不同接种方式对组织工程牙龈种子细胞黏附效果的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (21): 3299-3303.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.004

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不同接种方式对组织工程牙龈种子细胞黏附效果的影响

钟代琴^1，2，3，周勤虎⁴，靳趁心³，梁妍³

¹口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 400015；²重庆医科大学附属口腔医院，重庆市 400015；³天津医科大学附属口腔医院，天津市 300017；⁴重庆市公安局刑警总队，重庆市 400021

出版日期:2014-05-21 发布日期:2014-05-21
通讯作者: 靳趁心，天津医科大学附属口腔医院，天津市 300017
作者简介:钟代琴，女，1985年生，四川省达州市人，汉族，2010年天津医科大学口腔医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事牙周疾病的诊治方面的研究。
基金资助:
天津市高等学校科技发展基金项目(20110140)

Effects of different implant methods on in vitro adhesion of tissue-engineered gingival cells

Zhong Dai-qin ^{1, 2, 3} , Zhou Qin-hu⁴, Jin Chen-xin³, Liang Yan³

¹ Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 400015, China; ² the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China; ³the Affiliated Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300017, China; ⁴Chongqing Public Security Bureau Police Corps, Chongqing 400021, China

Online:2014-05-21 Published:2014-05-21
Contact: Jin Chen-xin, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China
About author:Zhong Dai-qin, Master, Attending physician, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 400015, China; the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China; the Affiliated Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300017, China; Chongqing Public Security Bureau Police Corps, Chongqing 400021, China
Supported by:
the Scientific Development Fund for Institutions of Higher Education in Tianjin, No. 20110140

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何在体外将支架材料和种子细胞高效地复合以构建组织工程牙周组织是目前牙周病治疗及牙周缺损修复研究的重要方向。
目的：比较传统沉淀接种法和胶原包裹接种法的细胞黏附状况，优化细胞接种方式。
方法：将一定浓度的犬牙龈成纤维细胞，分别采用传统沉淀接种法和胶原包裹接种法接种到聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径和均匀孔径支架上，通过细胞计数测定支架上贴附的细胞数量，计算其接种率，并进行对比分析。
结果与结论：采用胶原凝胶包裹接种法将细胞接种至均匀孔径支架和梯度孔径支架上，其接种率均明显高于传统的沉淀接种法(P < 0.01)。用胶原凝胶包裹种子细胞行细胞接种可以有效提高种子细胞的接种率，增加支架上的细胞初始浓度，可以选用胶原凝胶包裹细胞接种方式用于牙龈工程组织构建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 口腔组织工程, 种子细胞, 沉淀接种法, 胶原包裹接种法, 聚乳酸-壳聚糖-明胶, 细胞接种率, 牙龈成纤维细胞

Abstract:

BACKGROUND: How to construct tissue-engineered periodontal tissue through efficient combination of scaffold materials and seed cells in vitro is an important direction of current research.
OBJECTIVE: To compare the cell seeding efficiency of traditional static seeding method and collagen enclose seeding method to select a more appropriate seeding method for cell attach.
METHODS: Gingival fibroblasts from dogs at certain concentrations were seeded onto polylactic acid-chitosan- gelatin scaffolds with gradient and uniform pore sizes using the traditional static seeding method and collagen enclose seeding method, respectively. The number of adherent cells was counted to calculate the seeding efficiency for data comparison.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell seeding efficiency of the collagen enclose seeding method was higher than that of the traditional static seeding method (P < 0.01). The collagen enclose seeding method can significantly improve the seeding efficiency and increase cell initial concentration on the scaffold, and this method can be used for gingival tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: vaccination, gingival, cells, cell adhesion, stents, fibroblasts

中图分类号:

R318

钟代琴，周勤虎，靳趁心，梁妍. 不同接种方式对组织工程牙龈种子细胞黏附效果的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(21): 3299-3303.

Zhong Dai-qin, Zhou Qin-hu, Jin Chen-xin, Liang Yan. Effects of different implant methods on in vitro adhesion of tissue-engineered gingival cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(21): 3299-3303.

图/表（结果） 3

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引言

组织工程学是一门新兴边缘学科，其基本方法是将体外培养的高浓度、功能相关的活细胞种植于具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上，经过一段时间的培养，将这种细胞与生物材料的复合体植入机体病损部位以形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复组织损伤和重建功能的目的。将组织工程技术引入牙周组织再生治疗，为牙周病的治疗和牙周缺损的修复开辟了新的研究空间。
种子细胞、支架材料和信号分子是牙周组织工程的三大要素。将种子细胞接种到三维支架材料上是体外构建工程组织的第一步。细胞接种对于支架材料中起始细胞量、细胞在支架内的立体分布以及随后的细胞增殖分化、迁移和组织形成等方面都有重要的影响。如何在体外将支架材料和种子细胞高效地复合以构建组织工程牙周组织是目前研究的重要方向^[1-2] 。
目前常见的细胞接种方式有静态接种、转瓶接种、搅动接种、灌注接种和过滤接种等，均各有优劣。静态接种因其操作简单最为常用，但存在接种率较低、细胞分布不均的缺点^[3] 。转瓶接种不易出现细胞结团的现象，且细胞能够进入材料内部，但其接种率很低，且在接种过程中细胞损伤和死亡明显^[4] 。灌注接种，细胞混悬液直接流经多孔材料的内部孔隙，细胞可以到达材料内部，有较高的接种率，且细胞在材料内部分布较为均匀，但是灌注接种的操作复杂^[5] 。近年来有研究提出了一种改良的双相接种方式，即用胶原凝胶包裹细胞后接种至多孔三维支架材料上，这种方法利用胶原凝胶半固态、半液态的特点实现细胞的均匀分布，通过物理性捕获效应将大量的细胞限制于其中，使细胞在材料中均匀分布，同时降低了细胞的流失，提高了细胞的接种率，加快组织的再生速度、提高再生组织的均一性^[6] 。
实验以犬牙龈成纤维细胞作为种子细胞，聚乳酸-壳聚糖-明胶三维支架作为支架材料，探索采用胶原包裹细胞体外构建组织工程牙龈的可行性，并将其与传统的沉淀接种法进行对比。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：细胞培养，体外观察。

时间及地点：于2010年1月至2012年1月在天津医科大学口腔医学院完成。

材料：

牙龈组织来源：比格犬健康牙龈组织块，由天津医科大学口腔医学院动物实验室提供，来源符合医学实验动物伦理学标准。

主要试剂配制：胶原溶液：无菌条件下，用电子天平称取Ⅰ型胶原50 mg，于冰浴条件下充分溶解于5 mL 0.1%乙酸溶液中，1 mol/L NaHCO₃及精密试纸调整其酸碱度至7.4，即配即用。

支架来源：聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架、聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架均由天津大学化工学院馈赠。

方法：

实验分组：

梯度孔径支架-胶原组：胶原包裹比格犬牙龈成纤维细胞后接种至聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架。

梯度孔径支架-无胶原组：采用沉淀接种法将比格犬牙龈成纤维细胞接种至聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架。

均匀孔径支架-胶原组：胶原包裹犬牙龈成纤维细胞后接种至聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架。

均匀孔径支架-无胶原组：采用沉淀接种法将比格犬牙龈成纤维细胞接种至聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架。

比格犬牙龈成纤维细胞培养：切取比格犬健康牙龈组织块，用含双抗的PBS(20 mL加1 mL双抗)漂洗3次，然后将比格犬牙龈组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，用牙科探针将组织块均匀平铺在培养瓶壁，倒置培养瓶，用含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下，于恒温孵箱中静置培养，4 h后翻瓶。

制备浓度为4.0×10⁸ L^-¹胶原-细胞混悬液：取传代后铺满培养瓶底80%-90%的比格犬牙龈成纤维细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞至青霉素小瓶中，计算所得细胞混悬液的细胞浓度。于1 000 r/min离心8 min，弃上清后用1体积改良Eagle培养基(Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM)与1体积胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及8体积10 g/L胶原溶液的混合液调节细胞浓度至4.0×10⁸L^-¹。

制备浓度为4.0×10⁸L^-¹的细胞混悬液：取传代后铺满培养瓶底80%-90%的比格犬牙龈成纤维细胞，胰蛋白酶消化后收集至青霉素小瓶中，计算所得比格犬牙龈成纤维细胞混悬液的浓度。用含有体积分数10%FBS的完全DMEM培养基将细胞悬液浓度调整至4.0×10⁸L^-¹。

细胞接种：取无菌96孔板一块，一半平铺放置直径 5 mm聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架，一半平铺放置直径5 mm聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架，均粗糙面朝上。梯度孔径支架-胶原组在聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架上滴加4.0×10⁸L^-¹胶原-细胞混悬液100 μL，梯度孔径支架-无胶原组在聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架上滴加4.0×10⁸L^-¹细胞混悬液100 μL，均匀孔径支架-胶原组在聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架上滴加4.0×10⁸L^-¹胶原-细胞混悬液100 μL，均匀孔径支架-无胶原组在聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架上滴加4.0×10⁸L^-¹细胞混悬液100 μL。每组构建10个细胞-支架复合体。将孔板放入在37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下于恒温孵箱内，待梯度孔径支架-胶原组、均匀孔径支架-胶原组胶原凝固后(约30 min)，每孔加入完全培养液100 μL，继续于孵箱内静置培养。

细胞计数法测定不同接种方法的细胞接种率：4 h后取出96孔板，将所有支架依次转移至另一块无菌的96孔板内，梯度孔径支架-胶原组、均匀孔径支架-胶原组每孔加入20 g/L的Ⅰ型胶原酶20 μL，于37 ℃条件下作用约 45 min以彻底分解Ⅰ型胶原，之后加入80 μL完全培养液中和混匀。梯度孔径支架-无胶原组、均匀孔径支架-无胶原组每孔加入2.5 g/L胰蛋白酶20 μL消化5 min，80 μL完全培养液中和混匀。显微镜下用细胞计数板进行计数，计算每组支架上贴附的细胞数量并计算各组的细胞接种率。

细胞接种率=支架上贴附的细胞数量/接种细胞量× 100%

主要观察指标：胶原包裹细胞接种法及传统的沉淀接种法接种后的细胞贴附数及细胞接种率。

统计学分析：所有计量资料都采用x(_)±s表示，用SPSS 11.5软件进行统计学处理，组间细胞贴附数及细胞接种率比较行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

刘冰等^[7]实验已经证实聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架较聚乳酸-壳聚糖-明胶均匀孔径支架有更高的细胞接种率。郝伟等^[8]研究表明利用胶原凝胶包裹种子细胞接种至支架中，当细胞向支架内流动时，通过胶原的胶冻化可防止细胞流失，提高细胞接种率。本研究将两种能提高细胞接种率的因素叠加，将浓度为4.0×10⁸ L^-1的比格犬牙龈成纤维细胞接种到支架上，结果在梯度孔径支架内比格犬牙龈成纤维细胞细胞的细胞接种率由61.9%提高到86.6%，在均匀孔径支架内，比格犬牙龈成纤维细胞的接种率也由19.3%提高至50%，说明通过胶原凝胶包裹细胞确实可减少细胞的流失，提高细胞在支架内的接种率，在梯度孔径的基础上采用胶原凝胶包裹细胞进行接种可使细胞接种率进一步提高。
聚乳酸-壳聚糖-明胶多孔支架具有较高的孔隙率、良好的细胞相容性和力学性能，而且制作简便、来源丰富、经济成本低，具有成为组织工程支架材料的潜能^[9] 。但将细胞直接接种于该三维支架时存在细胞分布不均匀、细胞流失较多以及接种细胞成活率低等不足，虽然通过改变其孔隙结构，使均匀孔径变成梯度孔径，提高了细胞的接种率，但接种过程中细胞仍有一定程度的流失，并且没有相关证据表明细胞结团的现象有所改善。胶原作为一种天然高分子生物材料，具有较低的免疫原性、优异的生物相容性和可生物降解性、可促进细胞生长和止血作用等特性，是一种理想的组织工程支架材料和药物释放载体材料^[10] 。但是作为支架材料，胶原的力学性能较差，需要经过特殊处理或与其它材料复合后作支架材料^[11] 。胶原、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖等材料均具有良好的亲水性和细胞相容性，在较温和的条件下可以转变为凝胶，有利于细胞附着并在材料内均匀分布，但水凝胶力学强度较差，细胞-水凝胶复合体在体外培养时会发生收缩^[12] 。胶原水凝胶成形性能差，难以实现复杂的支架结构制造，并且其降解速度很快，在体内环境难以与组织生长速度相匹配，这限制了胶原蛋白水凝胶在微结构组织工程中的广泛应用^[13,14] 。为了解决上述问题，本研究使用Ⅰ型胶原凝胶包裹种子细胞进行细胞接种。Ⅰ型胶原凝胶具有半固体、半液态的特点，在进行细胞接种的过程中不仅能够相对容易地实现种子细胞的均匀分布，而且可以通过物理性捕获效应将大量种子细胞限制于其内，解决了材料与细胞的复合问题，同时减少了细胞在接种过程中的丢失。
潘勇等^[15]的研究表明，采用凝胶接种技术构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体能获得更多的细胞黏附，细胞增殖也更迅速。此外，胶原具有良好的生物相容性、生物降解性及降解可调性，良好的骨诱导性和骨传导性，利于细胞黏附和增殖^[16] 。
Glowacki等^[17]研究表明胶原包含诱导分化物，在体外或体内均能刺激成纤维细胞向软骨方向分化。因此本研究利用比格犬牙龈成纤维细胞、Ⅰ型胶原凝胶、聚乳酸-壳聚糖-明胶多孔支架构建了一种新型牙周组织工程复合体。研究结果表明细胞在该复合体内有高于直接接种细胞至支架上的细胞起始密度。
实验中胶原凝胶包裹的比格犬牙龈成纤维细胞以相同浓度分别接种至均匀孔径支架和梯度孔径支架内，结果发现在均匀孔径支架内，细胞的接种率由19.3%上升至50%，而在梯度孔径支架内细胞接种率仅由61.9%上升至86.6%，其上升的幅度小于均匀孔径支架。梯度孔径支架内孔隙结构由大到小排列的方式可以有效减少细胞的流失，同时相同体积的支架，梯度孔径支架内部可供细胞贴附的表面积大于均匀孔径支架，可以贴附更多的细胞，但是胶原凝胶的引入改变了这种孔隙结构，细胞除了直接贴附到支架上，还有一部分是悬浮在胶原凝胶内。所以虽然在原有基础上细胞的接种率有进一步的上升，但是上升的幅度却小于均匀孔径支架。
在细胞-支架复合体构建的过程中，胶原的浓度对其成功与否也起着重要的作用。Parkhurst等^[18]的研究表明，胶原浓度过低，在细胞的培养过程中，胶原收缩较大，0.75 g/L的胶原凝胶在培养7 d后可收缩85.6%，14 d后收缩93.7%，而2 g/L的胶原凝胶7 d收缩38.2%，14 d后收缩53.5%。但胶原浓度过高，凝胶则过于黏稠，易混入气泡，而且不易操作。同时胶原的浓度同细胞的生长状态有极为密切的关系。
Udea等^[19]比较了不同浓度的胶原对口腔黏膜上皮细胞的影响，研究表明，胶原的浓度和上皮细胞的生长分化呈明显的正相关，当胶原浓度为8.6 g/L时，在上皮和结缔组织交界处可观察到基底膜和上皮钉突。吕红兵等^[20]分离一两天的SD新生鼠背部皮肤的成纤维细胞，接种至不同浓度的胶原溶液中，结果发现当接种至浓度为6.4 g/L的胶原中的细胞生长状态良好，有明显的细胞突起，和二维培养条件下的形态相似。说明6.4 g/L的胶原适宜成纤维细胞的生长。在本实验中，胶原凝胶的浓度设为10 g/L，该浓度的胶原在细胞培养中收缩较小，在本研究中发现其粘稠度适中，未见气泡混入，不影响操作。
实验尚未研究通过胶原凝胶包裹接种的种子细胞在聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架上的生长状况以及其增殖周期同支架的降解周期是否一致的问题，作者将其作为下一个继续研究的方向，基于本实验所用支架及胶原的良好生物学性能，预计细胞在支架上能够良好地增殖生长，形成结缔组织片。

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