海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶载药体系制备、释放及对结肠癌的抑制效果

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0917

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (22): 3498-3505.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0917

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海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶载药体系制备、释放及对结肠癌的抑制效果

王江¹，王庆峰²，蒋亦昕³，陈娜¹，褚征⁴

解放军沈阳军区总医院，¹中医科，⁴药剂科，辽宁省沈阳市 110016；²沈阳师范大学粮食学院，辽宁省沈阳市 110032；³辽宁经济职业技术学院，辽宁省沈阳市 110122

收稿日期:2018-05-01 出版日期:2018-08-08 发布日期:2018-08-08
通讯作者: 褚征，主管药师，解放军沈阳军区总医院药剂科，辽宁省沈阳市 110016
作者简介:王江，女，1978年生，辽宁省沈阳市人，满族，中国医科大学毕业，硕士，主管药师，主要从事中药现代化及药房管理研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金指导计划项目(20170540601)；沈阳市科技计划项目(18-013-0-44)

Sodium alginate/podophyllotoxin drug delivery system: preparation, release and anti-colon cancer effects

Wang Jiang¹, Wang Qing-feng², Jiang Yi-xin³, Chen Na¹, Chu Zheng⁴

¹Department of Chinese Herbs, ⁴Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; ²Food School of Shenyang Normal University, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; ³Liaoning Vocational Technical College, Shenyang 110122, Liaoning Province, China

Received:2018-05-01 Online:2018-08-08 Published:2018-08-08
Contact: Chu Zheng, Pharmacist in charge, Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Wang Jiang, Master, Pharmacist-in-charge, Department of Chinese Herbs, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20170540601; the Science and Technology Research Project of Shenyang, No. 18-013-0-44

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

鬼臼毒素：存在于小檗科的鬼臼属、八角莲属和山荷叶属及大麻科和柏科的少数科属植物中，1947年被证实对癌细胞有破坏作用，同时具有抑制肿瘤细胞增殖及抗病等作用。然而，在实际应用的过程中发现，鬼臼毒素对人体有严重的毒副作用，水溶性差，体内代谢时间短，生物利用度低，使其应用受到很大限制。

海藻酸钠：是从食用海藻类植物胞壁中提取的天然线性多糖，被广泛应用于药物运输体系，目前剂型有片剂、微球、凝胶珠体及纳米粒等。制各海藻酸钠凝胶微球不需有机溶剂，其作为药物运输系统的特性有：包封率高、稳定性强、体内特异性分布、无毒、pH敏感；与药物配伍，不影响其药理作用及含量测定；成胶条件温和。

背景：鬼臼毒素具有抑制癌细胞增殖、抗病毒和抗病虫害的功能，但其单独应用有较大不良反应且生物利用度低。

目的：制备海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，以期望实现鬼臼毒素的控释或靶向给药，提高疗效，降低其生物毒性和不良反应。

方法：采用外部离子凝胶法制备海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，检测鬼臼毒素质量浓度分别为25，50，75 g/L时的凝胶珠载药量，以及凝胶珠在不同pH值环境中(pH=2.1，4.6，7.4)的溶胀率及释药行为。分别以含5，10，20，40 mg/L海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠(或鬼臼毒素或海藻酸钠)的细胞培养基培养肠癌细胞SW480与肠上皮细胞NCM460，48 h后，检测肠上皮细胞NCM460的存活率及肠癌SW480细胞的抑制率。

结果与结论：①当鬼臼毒素质量浓度分别为25，50，75 g/L时，凝胶珠的载药率分别为8.97%，17.02%和19.16%；②当鬼臼毒素质量浓度分别为25，50，75 g/L时，凝胶珠在pH=2.1，4.6的环境中几乎不溶胀；在pH=7.4的环境中溶胀，且随着鬼臼毒素质量浓度的增加，凝胶珠溶胀率增加；③在pH=7.4的环境中， 24 h内有(69.5±9.1)%的鬼臼毒素缓慢地从凝胶珠中释放出来；在pH=2.1，4.6的环境中，24 h内只有(2.0±0.2)%和(2.1±0.6)%的鬼臼毒素从凝胶珠中释放出来；④随着药物质量浓度增加，各组NCM460细胞存活率逐步下降，海藻酸钠无细胞毒性，鬼臼毒素有明显的细胞毒性，凝胶珠可降低鬼臼毒素的细胞毒性； ⑤随着药物质量浓度的增加，各组SW480细胞抑制率逐渐提高，凝胶珠的抑制作用强于海藻酸钠与鬼臼毒素；⑥结果表明，海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠是一种有研究前景的pH敏感缓释型结肠癌载药体系。

ORCID: 0000-0002-5461-0432(王江)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: pH敏感, 海藻酸钠, 鬼臼毒素, 载药体系, 结肠癌细胞, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Podophyllotoxin has the function of inhibiting cancer cell proliferation, antiviral and pest resistance, but its use alone causes great adverse reactions and has low bioavailability.

OBJECTIVE: To prepare sodium alginate/podophyllotoxin gel beads aiming to achieve the control release or targeted drug delivery that can improve effectiveness and reduce biotoxicity and adverse events.

METHODS: External ion gel preparation of sodium alginate/podophyllotoxin gel beads was performed. Drug load efficiency of the gel beads with podophyllotoxin mass concentrations of 25, 50, and 75 g/L was detected, and swelling and release performance of the gel beads at different pH values (pH=2.1, 4.6, 7.4) was also measured. Colon cancer cells SW480 and intestinal epithelial cells NCM460 were cultured in the medium containing 5, 10, 20, 40 mg/L sodium alginate/podophyllotoxin gel beads, sodium alginate or podophyllotoxin alone. After 48 hours of culture, survival rate of NDM460 cells and inhibition rate of SW480 cells were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: The drug loading rate of the gel beads was 8.97%, 17.02% and 19.16% respectively, when the mass concentration of podophyllotoxin was 25, 50 and 75 g/L. When the mass concentration of podophyllotoxin was 25, 50 and 75 g/L, the gel beads were almost insoluble in the pH=2.1 and pH=4.6 environment. In the environment of pH=7.4, the swelling rate of gel beads increased with the increase of the mass concentration of podophyllotoxin. In the environment of pH=7.4, there was a slow release of podophyllotoxin, (69.5±9.1)%, from the gel beads in 24 hours. In the environment of pH=2.1 and 4.6, only (2.0±0.2)% and (2.1±0.6)% podophyllotoxin was released from the gel beads in 24 hours, respectively. With the increase of drug mass concentration, the survival rate of NCM460 cells in each group declined gradually. Sodium alginate had no cytotoxicity, but podophyllotoxin exhibited obvious cytotoxicity. Moreover, the gel beads could reduce the cytotoxicity of podophyllotoxin. With the increase of drug mass concentration, the inhibition rate of SW480 cells in each group increased gradually, and the inhibitory effect of the gel beads was stronger than that of sodium alginate and podophyllotoxin. These experimental findings indicate that the sodium alginate/podophyllotoxin gel bead is a promising pH sensitive slow-release colorectal cancer drug delivery system.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Podophyllotoxin, Colonic Neoplasms, Delayed-Action Preparations, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王江，王庆峰，蒋亦昕，陈娜，褚征. 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶载药体系制备、释放及对结肠癌的抑制效果[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3498-3505.

Wang Jiang, Wang Qing-feng, Jiang Yi-xin, Chen Na, Chu Zheng. Sodium alginate/podophyllotoxin drug delivery system: preparation, release and anti-colon cancer effects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(22): 3498-3505.

图/表（结果） 9

2.1 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的载药量各组海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的载药量及包封率见表3。随着鬼臼毒素加入量的增加，凝胶珠的载药量也随着增加，当鬼臼毒素的加入量为25，50，75 g/L时，凝胶珠的载药量分别为8.97%，17.02%和19.16%。各组均获得了较好的包封率。

2.2 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的傅里叶变换红外光谱和扫描电镜分析从图3同时看出海藻酸钠、鬼臼毒素、海藻酸钠/鬼臼毒素的红外光谱特征^[27]。分析海藻酸钠/鬼臼毒素的红外光谱图可得：1 770 cm^-1的特征峰是C=O的伸缩振动引起的，且1 507 cm^-1和1 484 cm^-1的特征吸收是C=C的振动引起的，这几个特征峰体现了鬼臼毒素芳香环的结构特征^[28]；1 236，1 128，1 033 cm^-1的特征峰，是由鬼臼毒素和海藻酸钠分子的-C-O振动引起的；1 613 cm^-1和 1 423 cm^-1的特征峰，是海藻酸钠的-COOH振动引起的^[29-30]。另外，海藻酸钠/鬼臼毒素的1 770，1 507， 1 484 cm⁻¹的特征峰比其在鬼臼毒素中的弱。综上，鬼臼毒素被包裹在海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠中。

海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的形貌特征见图4。如图4A干燥的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠为500 μm左右的球形，所获得的凝胶珠表面规整，无明显裂痕，药物包埋完整。而如图4B所示，干燥的凝胶珠表面出现褶皱现象，这是由于带负电的海藻酸钠分子与带正电的Ca²⁺通过静电作用形成“蛋盒”结构而形成了外膜。该结果说明，所获得的凝胶珠结构完整，并对药物进行了有效的包埋，可以用于后续的药理学研究。

2.3 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠在不同pH值下的溶胀性能由表4可知，180 min后，3个样品都达到了最大溶胀率，且随PPT的增加，海藻酸钠/鬼臼毒素的溶胀速度也增加。由于大量PO₄³^-阴离子存于pH=7.4的PBS中，可以和海藻酸钠的-COO^-1竞争与Ca²⁺结合，导致海藻酸钠/鬼臼毒素溶胀。且随着时间增加，海藻酸钠溶解于PBS中，引起海藻酸钠/鬼臼毒素在pH=7.4的溶胀率下降。在pH=2.1和 pH=4.6时，海藻酸钠分子的-COO^-转化为-COOH，海藻酸钠变为不溶于水的大分子，因此较低的溶胀率是由表面海藻酸钠的水化导致的。以上表明：海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠可在胃中保持稳定，将药物输送到肠中，可作为肠靶向载药体系。

图5为海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠在pH=7.4下的溶胀性能，可以看出，整个凝胶珠体系在180 min处获得了最大的溶胀率。然而，由于壁材的原因，其在240 min处，溶胀率出现下降。该结果显示，制备的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠在pH=7.4的条件下，可以充分溶胀，并有助于后续药物的缓释。

2.4 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠在体外不同pH值下的释药行为如图6所示，以样本S2为模型，在pH=7.4的模拟肠液中，24 h内有(69.5±9.1)%的鬼臼毒素缓慢地从鬼臼毒素凝胶珠中释放出来；在pH=2.1和pH=4.6的模拟胃液中(表5)，24 h只有(2.0±0.2)%和(2.1±0.6)%的鬼臼毒素释放。由于模拟胃液中(pH=2.1和pH=4.6)鬼臼毒素凝胶珠几乎不溶胀，只有表面吸附的鬼臼毒素溶解到了介质中，而在模拟肠液中(pH=7.4)，凝胶珠中的鬼臼毒素随时间被释放到介质中。将海藻酸钠/鬼臼毒素在pH=7.4下的释放曲线用R%= ktⁿ(power law model)拟合。经过拟合得出鬼臼毒素的拟合曲方程式为：y=0.051 0×t^0.83，n为0.83，属于控制扩散和溶胀释放机制。

另进一步对各组的缓释情况对比可知，其他两组在 24 h处的缓释趋势同其他两组基本相同。组间对比并无显著性区别(P > 0.05)，可以肯定制备的凝胶珠效果稳定且在强酸性环境pH=2.1及弱酸性pH=4.6环境下均表现出一定的稳定性，而在pH=7.4的弱碱性条件下则可缓慢的释放，其24 h释放率同添加的鬼臼毒素质量浓度呈正比，但组间并无显著区别(P > 0.05)。该结果显示在该条件下，所获得的凝胶珠性质稳定，可满足临床的实际需要。

2.5 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠对正常细胞及结肠癌SW480细胞的作用

2.5.1 对正常细胞的毒性图7显示了不同物质在各浓度下对正常细胞的毒性，可以看出随着质量浓度增加，NCM460细胞存活率均逐步下降。其中，海藻酸钠组各个浓度下细胞存活率都高于80%，说明海藻酸钠有很好的安全性，5 mg/L组对比其他3组的细胞存活率差异有显著性意义(P < 0.05)；而10 mg/L同20 mg/L组、20 mg/L同40 mg/L组相比差异无显著性意义(P >0.05)。与之对应，鬼臼毒素组的细胞存活率则呈现一个显著性下降趋势，随着质量浓度的不断增加，组内的细胞存活率也随之下降，且各组间对比差异均有显著性意义(P < 0.01)。结果表明，单独使用鬼臼毒素投入到人体体内会直接杀伤结肠细胞，带来相应的细胞毒性，其并不适合直接应用于临床。

海藻酸钠/鬼臼毒素组的NCM460细胞亦随着其质量浓度的不断上升而死亡，且同鬼臼毒素组类似，随着质量浓度的不断增加，海藻酸钠/鬼臼毒素组内的NCM460细胞的存活率也随之下降，且各组间对比差异均有显著性意义(P < 0.01)，但其趋势较鬼臼毒素组明显放缓。组间对比，在质量浓度分别为5，10，20 mg/L时，虽然海藻酸钠也可通过对鬼臼毒素的包埋起到保护细胞的作用，但海藻酸钠/鬼臼毒素组与鬼臼毒素组的细胞存活率对比无显著性意义(P > 0.05)；当质量浓度上升至40 mg/L时，海藻酸钠/鬼臼毒素组的细胞存活率为(65.85±1.10)%，相比于海藻酸钠/鬼臼毒素的(51.22±0.85)%差异显著(P < 0.05)。该结果进一步证明海藻酸钠/鬼臼毒素体系能降低药物对正常细胞的毒性。

2.5.2 对肠癌细胞的杀伤作用海藻酸钠、鬼臼毒素和海藻酸钠/鬼臼毒素对SW480结肠癌细胞的抑制实验表明，随3者质量浓度的增加，SW480细胞的抑制率有提高(图8)。在实验质量浓度下，鬼臼毒素组出现了不同程度的抑制。单纯提高海藻酸钠的质量浓度，对SW480细胞的抑制作用有限，当海藻酸钠浓度提升至40 mg/L时，相比于5 mg/L组杀伤率仅提升了59.2%；另5 mg/L组同10 mg/L组、 20 mg/L组同40 mg/L组相比差异不显著(P > 0.05)。

相比于海藻酸钠，鬼臼毒素对SW480的杀伤率有提升，在鬼臼毒素作用下，5 mg/L组同10 mg/L组、20 mg/L细胞抑制率相比差异不显著(P > 0.05)，40 mg/L组与 5 mg/L组细胞抑制率相比差异显著(P < 0.05)，10 mg/L组与40 mg/L组细胞抑制率相比差异不显著(P > 0.05)。

相同质量浓度下，海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠对SW480的杀伤效果均优于海藻酸钠或鬼臼毒素(P < 0.05)。在当海藻酸钠/鬼臼毒素作用下，20 mg/L组细胞抑制率高于 5 mg/L组(P < 0.05)，40 mg/L组与20 mg/L组细胞抑制率相比未进一步上升(P > 0.05)，仅提升了2%。

参考文献

[1] Canel C,Moraes RM,Dayan FE,et al. Podophyllotoxin. Phytochemistry. 2000;54(2):115-120.

[2] 李楠,赵阳,魏菲,等.鬼臼毒素脲类衍生物的合成和体外抗癌活性的研究[J].天津医科大学学报,2016, 22(3):199-203.

[3] Gordaliza M,García PA,Del corral JM,et al.Podophyllotoxin: Distribution, Sources, Applications and New Cytotoxic Derivatives. Toxicon.2004;44(4):441-459.

[4] 种树彬,王小婕,陈如大,等.鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染的研究[J].中国实用医药,2017, 12(1):1-4.

[5] Han HW,Qiu HY,Hu C, et al. Design, Synthesis and Anti-cancer Activity Evaluation of Podophyllotoxin-norcantharidin Hybrid Drugs. Bioorg Med Chem Lett.2016;26(14): 3237-3242.

[6] 成伟华,陈虹,邹忠梅.鬼臼毒素的结构修饰及抗肿瘤活性研究进展[J].中国医药工业杂志,2017,48(5):644-650.

[7] 程冀,季宇彬,王向涛.正交试验法优选鬼臼毒素新型脂质体的制备工艺[J].黑龙江大学自然科学学报, 2009,26(6):795-798.

[8] Qin L,Xue M,Wang W,et al.The in Vitro and in Vivo Anti-tumor Effect of Layered Double Hydroxides Nanoparticles as Delivery for Podophyllotoxin. Int J Pharm. 2010;388(1): 223.

[9] Fan L,Wu H,Zhang H, et al. Ph‐sensitive Podophyllotoxin Carrier for Cancer Cells Specific Delivery. Polymer Composites.2010; 31(1):51-59.

[10] 高鹏.鬼臼毒素的聚乙二醇-聚己内酯胶束的制备[J].江西中医药, 2010,41(2):57-59.

[11] 朱雄,吴葆金,罗厚蔚,等.去氧鬼臼毒素-磺丁基醚-β-环糊精包合物的制备及抗肿瘤作用[J].中国药科大学学报, 2010,41(5):447-450.

[12] 邓亚利,蔡鑫剑,姚淑娴.羧基化碳纳米管负载鬼臼毒素的制备及透皮性能研究[J].中国药学杂志, 2017,52(12):1049-1055.

[13] 程浩.1,2-顺式otobain-podophyllotoxin杂化物的合成及其抑制肿瘤活性研究[D].上海:华东师范大学,2016.

[14] 梁华丽.紫杉醇纳米颗粒制备和应用[J].亚太传统医药, 2016,12(7): 52-53.

[15] 高昊辰,汪沛,曹志中,等.载米诺环素纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体的体外释放及抑菌性[J].中国组织工程研究, 2016,20(8):1118-1125.

[16] 李瑞端,张建军.聚乳酸-羟基乙酸聚合物载入羟基喜树碱载药纳米粒子的制备及表征[J].化学反应工程与工艺, 2016,32(6):542-546.

[17] 黄妍瑜.生物大分子纳米载药体系的功能化设计及其在肿瘤诊疗中的研究[D].广州:暨南大学,2016.

[18] 宋一凡,柴云,张普玉.刺激响应性聚合物载药纳米胶束研究进展[J].化学研究,2016,27(5):655-659.

[19] 董丽艳,李晓华,焦晓雯,等.他克莫司载药胶束的制备与制剂学性质[J].沈阳药科大学学报,2016,33(9):679-685.

[20] 何思良.水凝胶/微球/淫羊藿苷复合载药体系的制备及性能研究[D].湘潭:湖南科技大学,2015.

[21] 熊露.基于超分子聚合物前药的可注射载药水凝胶[D].杭州:浙江大学, 2016.

[22] Podual† K,Iii FD,Peppas NA.Modeling of Water Transport in and Release From Glucose-sensitive Swelling-controlled Release Systems Based on Poly(diethylaminoethyl Methacrylate-g- ethylene Glycol).Ind Eng Chem Res. 2004;43(23):7510-7512.

[23] 杨继荣,严文伟,肖勇翔,等.不同聚合物配方的硝苯地平缓释片体外释放差异研究[J].中国药业,2016, 25(18):43-47.

[24] 吴叶,刘袖洞,王云红,等.海藻酸钠纳米粒制备的研究进展[J].材料导报, 2016,30(5):7-11.

[25] 宋丽敏,李明,倪雅欣,等.高效氯氰菊酯/海藻酸钠/壳聚糖凝胶微球的制备[J].应用化工,2016,45(11): 2118-2120.

[26] 赵睿.海藻酸钠基复合凝胶的制备与性能研究[D].武汉:武汉工程大学, 2016.

[27] Liu Y,Yang L,Liu Y,et al.Synthesis and Insecticidal Activities of Novel Derivatives of Podophyllotoxin.Nat Prod Res. 2007;21(11) 967-974.

[28] 王盈盈. CS/PAA@TPGS/PLGA纳米核递药系统逆转肺癌细胞多药耐药的效应及机制研究[D].南京:南京师范大学,2016.

[29] Xie S,Luo J,Liu Q,et al.Adsorption Characteristics and Mechanism of Hydroxyethyl Cellulose/sodium Alginate Blend Films for Uranium(vi). Acta Materiae Compositae Sinica.2015; 32(1):268-275.

[30] Hong C,Li M,Xin M,et al.Synthesis and Drug Release Performance of Chitosan Immobilized Cyclodextrin-sodium Alginate.Chin J Mater Res.2011;25(2):135-140.

[31] Wang L,Yang F,Yang X,et al.Synthesis and Biological Evaluation of New 4β-anilino-4′- O -demethyl-4-desoxypodophyllotoxin Derivatives as Potential Antitumor Agents.Eur J Med Chem.2011; 46(1):285-296.

[32] 江中洪,曾抗,李国锋,等.鬼臼毒素纳米脂质载体的制备及质量考察[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(6):1039-1042.

[33] 成伟华,牛聪,孙强稳,等.呋喃鬼臼毒素衍生物及其抗肿瘤活性研究[J].天津医科大学学报,2016, 22(5):381-385.

[34] Li P,Dai YN,Zhang JP,et al.Chitosan-alginate Nanoparticles as a Novel Drug Delivery System for Nifedipine.Int J Biomed Sci. 2008; 4(3):8-221.

[35] 肖潇.4-邻氨基酚-4'去甲表鬼臼醚抑制人舌鱗癌细胞增殖、黏附、迁移和侵袭[D].兰州大学,2013.

[36] 孙如宁,熊晔蓉,涂家生.去氧鬼臼毒素mPEG-PDLLA聚合物胶束的制备及其性质的研究[J].海峡药学, 2016,28(4):26-30.

[37] 李亚瑜,毛晓颖,汪凌,等. PLA-PEG-PLA的微波合成工艺及其在鬼臼毒素载药微球中的应用[J].化工新型材料, 2012,40(3):127-130.

引言

鬼臼毒素存在于小檗科的鬼臼属、八角莲属和山荷叶属，以及大麻科和柏科的少数科属植物中，1947年被证实对癌细胞有破坏作用，同时具有抑制肿瘤细胞增殖及抗病毒等作用^[1-4]。然而，在实际应用的过程中发现，鬼臼毒素对人体有严重的毒副作用，水溶性差，体内代谢时间短，生物利用度低，使其应用受到很大限制^[5-6]。为了增加其在临床上的应用，学者对其剂型的更改做了大量研究，如鬼臼毒素的脂质体，被应用于相关的抗肿瘤研究；程冀等^[7]以氢化磷脂∶胆固醇=20∶3.26、氢化卵磷脂∶PAMAMdendrimer G3.5 脂质小球=20∶0.5、氢化磷脂∶鬼臼毒素=10∶1.5为优选参数，以45 ℃旋转蒸发的形式制备了物理和化学性质都较为稳定的脂质体。部分研究考察以层状双氢氧物作为无机纳米药物载体，并协同鬼臼毒素制备了相应载药体系，另，Qin等^[8]制备的层状双氢氧物-鬼臼毒素的复合纳米载药体系，可长期抑制肿瘤细胞，同时，其可大幅增加增加肿瘤细胞的凋亡。并且层状双氢氧物-鬼臼毒素体系可大幅增加PPT的使用时间及生物利用度。以聚合物胶束包埋鬼臼毒素也是极佳的解决办法，如以N-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖聚合物、聚乙二醇修饰的共聚物等。其中，以壳聚糖最为常见，如Fan等^[9]在pH敏感的药物靶向系统中制备了鬼臼毒素NIPAAm-壳聚糖纳米颗粒，并考察该载药体系对人肺癌A549的抑制活性。在NIPAAm∶壳聚糖为4∶1的条件下，可获得最佳的纳米颗粒，该载药体系较为稳定，且制备的的颗粒大小为50- 150 nm，而对肿瘤可展示出较好的pH敏感性。部分研究亦考察了以薄膜分散法制备聚合物胶束的方法^[10]，在该条件下，以聚乙二醇修饰出的两亲性共聚物聚乙二醇-聚乙内酯作为载体，制备出的鬼臼毒素胶束，具有核壳结构，其临街缔合浓度低，且获得了良好的载药性及缓释性能。朱雄等^[11]的研究则显示，以磺丁基醚-β环糊精包埋鬼臼毒素，鬼臼毒素的溶解度大幅提升。以此方法获得的载药体系药效也相应这增加。

随着对纳米管研究的深入，应用以纳米管形式对鬼臼毒素进行的载药研究也获得了突破，如邓亚利等^[12]研究应用冷冻球磨法制备了羧基化碳纳米管负载鬼臼毒素，获得了较好的缓释效果，其皮肤滞留量可提升及接近1倍。另外，该凝胶的家兔实验显示，载药体系在24 h内表现为轻度刺激性，48 h后刺激性逐渐降低，72 h后刺激性消失，其完全复合局部给药的要求。

根据之前的研究显示，鬼臼毒素对人结肠癌有较佳的治疗作用^[13]。而在实际临床应用当中可知，若要实现结肠给药，则需要满足以下2个要求；首先，必须保证其在酸性条件的稳定性，因为该颗粒首先经过胃酸的消化，如果在pH=2.1的条件下该体系不稳定，则会大幅增加药物在人体内的损失；其次，必须保证药物的缓释性，由于结肠属于人体的消化末端，该部位对于药物的吸收只能基于黏膜给药。同时，鬼臼毒素的有毒性导致其不可大量快速的释放，这就要求其在结肠的环境内缓释释放，最终可保证结肠黏膜对药物充分吸收，同时保证在结肠局部不会出现药物浓度骤增的情况。

基于鬼臼毒素的自身特性及临床用药的需求，考察了以高分子聚合物的形式对药物进行包埋。高分子聚合物类物质作为载药基质在改善药物的代谢、毒性和疗效方面都取得了不俗的进展，聚合物作为载药体系可以调节药物释放特性，包括释放速率、时间和部位等^[14-15]。高分子聚合物载药体系主要由水凝胶、纳米粒子^[16-17]、胶束和微球组成^[18-19]。

在上述高分子聚合物中，水凝胶是非共价键的物理结合或共价交联链结合而成的网络，具有大量亲水基团，对水有很高的亲和力，作为药物运载基质，其生理化学性质类似原生胞外基质，同时其生物黏附特性能增强药物在体内的停留时间和组织渗透性^[20-21]。Podual等^[22]制备了固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的二乙氨基乙基丙烯酸甲酯接枝乙二醇共聚物，考察了其在葡萄糖溶液中对葡萄糖的敏感行为，发现随pH值的脉冲变化，共聚物具有显著的溶胀-塌陷转变。

海藻酸钠是从食用海藻类植物胞壁中提取的天然线性多糖，被广泛应用于药物运输体系，目前剂型有片剂^[23]、微球、凝胶珠体及纳米粒等^[24]。制各海藻酸钠凝胶微球不需有机溶剂，其作为药物运输系统的特性有^[23]：包封率高、稳定性强、体内特异性分布、无毒、pH敏感；与药物配伍，不影响其药理作用及含量测定；成胶条件温和。有学者用海藻酸钠和羟乙基纤维素制备了凝胶珠，并将双氯芬钠和布洛芬包裹于凝胶珠中，研究发现包裹双氯芬钠的缓释效果要比包裹布洛芬的好，二者缓释模型为Fickan模型。有研究将木瓜蛋白包裹于海藻酸钠凝胶珠中，发现凝胶珠不溶于酸性环境，而在pH=6.8的环境下完全溶解，可以将木瓜蛋白靶向运输到小肠。

鉴于海藻酸钠体系的特征及对鬼臼毒素的实际需求，此次研究拟采用外部凝胶法制备海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，考察凝胶珠的载药量、形态、粒径、溶胀性能、体外释放行为，以及其对正常结肠NCM460和结肠癌细胞SW480的体外抑制情况，以期为鬼臼毒素抗肿瘤类药物的剂型开发研究提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计药物生物材料制备实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5至12月在辽宁经济职业技术学院生物系实验室(药物实验)及解放军沈阳军区总医院中医科(肿瘤实验)完成。

1.3 材料鬼臼毒素(中国科学技术大学分析测试中心)；海藻酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、无水氯化钙、无水乙醇(国药试剂集团，AR)；1%100 U/mL青霉素和链霉素、1640培养液、小牛血清、Trypsin-EDTA(浙江吉诺)；MTT (Sigma)；DMSO (上海国药AR)；NCM460、SW480细胞株(辽宁经济职业技术学院生物系实验室冻存)；DDHZ-300台式恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)；88-1型恒温磁力搅拌器(上海志威电器)；AL-204型电子天平；紫外-可见光谱Varian Cary 50；红外光谱仪(Nicolet Magna-IR 550II)；Rigaku D/max-rA型X射线粉末衍射仪；场发射扫描电镜(日立S-4800型)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；离心机(Hettich Universal 32)；MWCO14 000透析袋(上海绿鸟生物科技)；超速冷冻离心机(Backman)；CO₂培养箱(Thermo Fisher)；ELX800UV型酶标仪(美国BioTek)。

1.4 实验方法

1.4.1 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的制备将鬼臼毒素配置为25 g/L的无水乙醇溶液。取一定体积该溶液(具体添加体积见表1所示)，加入到20 g/L海藻酸钠溶液中，并将此混合溶液漩涡震荡5 min。将该混合液以4#针头，滴加到 20 mL的20 g/L CaCl₂溶液中，固化30 min，400目标准筛过滤，蒸馏水多次洗涤，室温干燥2 d后，放入40 ℃真空干燥箱中过夜。

1.4.2 鬼臼毒素标准工作曲线的制作将鬼臼毒素溶于10%的PBS乙醇溶液(PBS，pH=7.4)中。配制10，20，30，40，50，60，70，80，90 mg/L的鬼臼毒素乙醇PBS溶液(pH=7.4，乙醇体积分数为10%)。分别取3 mL溶液，用紫外-可见光谱扫描谱(图1)，然后以290 nm吸收值为纵坐标，以鬼臼毒素浓度为横坐标，绘制鬼臼毒素标准工作曲线(图2)，得回归方程：Y=0.004 6+0.009 6C[C为鬼臼毒素的质量浓度(mg/L)，R²=0.999 2，n=10]。

1.4.3 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的表征

粒径分布：参考文献[25]操作。

载药量及包封率：取干燥后的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠放入15 mL离心管中，加10 mL的10%PBS乙醇溶液(pH=7.4)中。离心管37 ℃ 100 r/min下恒温摇床水平震荡24 h，然后5 000 r/min离心5 min。取上清液测鬼臼毒素的含量，按公式计算载药量，载药量(%)=(1-m₁/m₂)×100%，其中m₁为上清液中鬼臼毒素质量(μg)；m₂为海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的质量(μg)。另，根据公式计算包封率，包封率(%)=m₁/m₂×100%，其中m₁为凝胶珠内鬼臼毒素的质量(μg)；m₂为凝胶珠内鬼臼毒素的理论质量(μg)。

傅里叶变换红外光谱和扫描电镜表征：取干燥的海藻酸钠、鬼臼毒素和海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，分别在研钵中按样品量与溴化钾1∶100加入溴化钾粉末，均匀磨细，油压机80 Pa维持3 min。所得压片于波长范围为4 000- 500 cm^-1的Nicolet傅里叶变换红外光谱内检测。

取一定的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，用导电胶粘到支持物上，喷金后用场发射扫描电镜下，加速电压10 kV，放大500和4×10⁵倍观察其形貌特征。

1.4.4 海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的药理活性

溶胀率^[26]：取一定的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，置于400目标准筛中。将标准筛浸入pH=2.1，7.4的PBS及pH=4.6的磷酸-柠檬酸缓冲液中，在浸泡180 min后，取出标准筛，以滤纸吸取凝胶珠表面水分。按公式计算溶胀率，溶胀率(%)=m₁-m₂/m₂×100%，其中m₁为溶胀后海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠质量(μg)；m₂为未溶胀的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠质量(μg)。

释药行为：取一定的海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠，放入缓冲溶液浸泡过的透析袋中，透析袋夹紧；精密量取10%的PBS乙醇溶液(乙醇体积分数10%, pH=7.4)50 mL，放入100 mL烧杯中；将装药透析袋移入装有溶出介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口；将烧杯置于恒温震荡器内，(37±1) ℃下50 r/min水平震荡。定时取3 mL的溶出介质，同时加入3 mL的释放介质，紫外光谱分析介质中鬼臼毒素的含量，计算得出鬼臼毒素浓度和药物释放率，以累积释放率和时间关系做体外释药曲线。再分别用pH=2.1的PBS和pH=4.6的10%的磷酸盐-柠檬酸的乙醇溶液，测定鬼臼毒素的释药率。

细胞实验样品的配制：根据药物的载药量及包封率数据，可以确定海藻酸钠/鬼臼毒素的初始液体的配，即，以S2的配置方法海藻酸∶鬼臼毒素=8∶2进行海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的制备，根据包封率的结果可进一步的估算出其中的鬼臼毒素浓度为4.12 g/L，而根据载药量的数据，可以估算出其中海藻酸钠质量浓度为20.07 g/L。基于海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠内海藻酸钠及鬼臼毒素的质量构成情况，依据鬼臼毒素质量浓度为准则，配置出相应的溶液，进行进一步的细胞实验，配制方法如表2所示。

凝胶珠对正常细胞及结肠癌SW480细胞的影响：用结肠上皮NCM460细胞为正常模型，SW480细胞为结肠癌模型。用含体积分数10%小牛血清的1640培养液培养细胞至对数期，0.25%胰酶消化对数期的细胞，以2.0×10⁴/孔浓度接种于96孔板，每孔100 μL。37 ℃、体积分数5% CO₂及饱和湿度下培养24 h，分别加入不同质量浓度的海藻酸钠、鬼臼毒素及海藻酸钠/鬼臼毒素。空白培养基为对照。培养48 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h弃上清，每孔加150 μL DMSO终止反应。将培养板水平振荡 15 min，用酶联检测仪在490 nm处测定吸光度A，按公式计算细胞存活率：

存活率(%)=A₄₉₀(样品)/A₄₉₀(对照)×100%，

细胞抑制率=1-细胞存活率。

1.5 主要观察指标海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的载药量、溶胀率及释药行为，以及海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的细胞毒性。

1.6 统计学分析全部实验数据以SPSS 20.0进行，其中计量资料以x(_)±s的形式表示，组间对比以独立样本t 检验进行，计数资料组间对比以卡方检验进行，两组数据以P=0.05计有统计学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

鬼臼毒素是从鬼臼属的盾叶鬼臼及八角莲等近缘植物中提取分离得到的芳基四氢萘内酯类木脂素天然产物^[31]，其有广泛的抗癌活性，并被已应用于临床多年。然而在实际应用的过程中，其往往面临着物利用度差且体内循环周期短等问题。因此为了进一步扩大其临床应用范围，可通过更改剂型^[32]、制备衍生物等方式进行^[33]，并取得了较好效果。

为了扩展鬼臼毒素的临床应用范围，提升其生物利用度，此次研究采用外部离子凝胶法制备了海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠载药体系，载药量为8.97%-19.16%，研究表明海藻酸钠/鬼臼毒素为具有pH敏感释放特性的500 μm球形颗粒，在酸性条件下不溶胀不释放药物，在pH=7.4条件下溶胀且24 h内以控制扩散和溶胀释放模式缓慢释放药物；对结肠正常细胞和癌细胞的抑制实验证明，海藻酸钠/鬼臼毒素能在提高肿瘤抑制效果的同时降低一定的正常细胞毒性，可作为一种安全有效的结肠靶向口服药物的载药体系。海藻酸钠作为一种包埋材料，被广泛应用于各种细胞毒性大、需要缓释药物体系制备当中。

载药量是凝胶珠的一项重要指标，此次研究结果表明，当鬼臼毒素溶液的质量浓度增加1倍，试验样品S2的载药量也接近样品S1的2倍。然而，当鬼臼毒素的加入量进一步增加至75 g/L时，海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠的载药量并没有随着增加1倍。该结果表明，在鬼臼毒素：海藻酸钠的体积比在2∶0时，该组的载药量已趋于饱和。由于此次实验选用的模型是水溶性极差的鬼臼毒素，因此，滴下的海藻酸钠/鬼臼毒素液滴在CaCl₂溶液中瞬间凝胶化成为凝胶珠，且该组凝胶珠的极为稳定，因此，在整个制备过程中，该凝胶珠不易发生泄漏。因此，整个实验均获得了较为稳定的包封率，各组的包封率并无显著区别。

以样本S2为模型，释药行为结果表明，在模拟胃液中(pH=2.1和 pH=4.6)，海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠几乎不溶胀，只有表面吸附的鬼臼毒素溶解到了介质中；在模拟肠液中(pH=7.4)，海藻酸钠/鬼臼毒素中的鬼臼毒素随时间被释放到介质中。将海藻酸钠/鬼臼毒素在pH=7.4下的释放曲线用R% = ktⁿ(power law model)拟合。经过拟合得出海藻酸钠/鬼臼毒素的拟合曲方程式为：y=0.0510×t^0.83，n为0.83，属于控制扩散和溶胀释放机制^[34]。可以肯定制备的凝胶珠效果稳定且在强酸性环境pH=2.1及弱酸性pH=4.6环境下均表现出一定的稳定性，而在pH=7.4的弱碱性条件下则可缓慢的释放，其24 h释放率同添加的鬼臼毒素质量浓度呈正比，但组间并无显著区别(P > 0.05)。该结果显示在该条件下，所获得的凝胶珠性质稳定，可满足临床的实际需要。

由不同物质对正常细胞的毒性可以看出，海藻酸钠有很好的安全性，单独使用鬼臼毒素投入到人体体内会直接杀伤结肠细胞，带来相应的正常细胞毒性，其并不适合直接应用于临床，而海藻酸钠/鬼臼毒素体系能降低药物对正常细胞的毒性。

SW480结肠癌细胞抑制实验表明，鬼臼毒素本身即对结肠癌细胞有着显著的杀伤性作用^[35]，因此在实验浓度下各组均出现了不同程度的抑制。但鬼臼毒素本身的溶解性较低，因此单纯提升溶液内的鬼臼毒素并不会进一步的增加对SW480细胞的杀伤效果。由于海藻酸钠仅仅为包材，因此其对SW480并无显著杀伤作用。相同质量浓度下，海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶珠对SW480的杀伤效果均优于海藻酸钠或鬼臼毒素，说明通过对鬼臼毒素的包埋，可有效提升其溶解性，且进一步提升了其对SW480细胞的杀伤效果。

在之前的研究中可看出，由于鬼臼毒素的溶解性较低，为了保证进一步临床的应用，往往采用包埋、纳米载药物、碳纳米管等方式进行包埋处理，以增加其溶解性，增加给药部位的药物浓度，以达到其治疗的目的^[32^，^36-37]。而在此次研究中，海藻酸钠可大幅提升鬼臼毒素对结肠癌细胞的杀伤效果，其主要通过对鬼臼毒素溶解性的增加得以实现，与之前的研究相比，此次研究体现了海藻酸钠/鬼臼毒素对结肠癌的治疗效果，且具有良好的缓释性能，使其能够更好地应用于结肠癌的常规治疗当中。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

海藻酸钠/鬼臼毒素凝胶载药体系制备、释放及对结肠癌的抑制效果

Sodium alginate/podophyllotoxin drug delivery system: preparation, release and anti-colon cancer effects

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[4]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[5]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[6]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[7]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[8]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[9]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[10]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[11]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[12]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[13]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[14]	李黎, 马力, 李鹤. 磁性壳聚糖微球的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 577-582.
[15]	唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.