人牙髓干细胞增殖分化过程中的miR-431

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0890

摘要/Abstract

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文题释义：
牙髓干细胞：属于成体干细胞，2000年Gronthos等从健康人第三磨牙牙髓中分离得到与骨髓间充质干细胞具有相似免疫表型、矿化能力、克隆形成能力、高增殖能力和多向分化潜能的间充质细胞。在一定环境条件下牙髓干细胞可以分化为牙本质细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等。牙髓干细胞的增殖能力、可获得性和干/祖细胞比例都要优于骨髓间充质干细胞，在维持牙髓的动态平衡以及牙齿的修复和再生中发挥了重要的作用。
牙髓干细胞成牙分化标志物：通过检测碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白的含量和活性可以反映牙髓干细胞成牙分化的进程。碱性磷酸酶可以刺激牙髓细胞形成牙基质，是参与钙化组织形成、代谢和再生的重要指标，较高的碱性磷酸酶活性是牙本质细胞分化和发生矿化的前提条件。骨钙素、骨唾液蛋白等非胶原蛋白在细胞分化为矿化组织的过程中起着重要的作用，牙齿的再生包含矿化过程。牙本质涎磷蛋白是牙髓干细胞成牙分化的必需蛋白。敲除牙本质涎磷蛋白的小鼠牙齿矿化不足，牙本质层变薄，牙髓腔变大。

摘要
背景：利用现代细胞分子生物学和组织工程技术，将牙髓干细胞应用于修复和重建牙组织具有积极的临床价值。
目的：探索miR-431在牙髓干细胞牙向分化中的作用以及miR-431对牙髓干细胞体外增殖能力的影响。
方法：酶消化法分离培养牙髓干细胞，转染miR-431模拟剂或抑制剂促进或抑制miR-431表达，诱导牙髓干细胞成牙分化，通过碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Western blot检测成牙分化标志物牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白的表达，qRT-PCR检测miR-431表达，MTT法检测细胞增殖率，克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。
结果与结论：①牙髓干细胞成牙分化过程中，碱性磷酸酶活性上升，牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白表达上升，miR-431表达下调；②过表达miR-431后，牙髓干细胞成牙分化受到抑制，而抑制miR-431表达后，牙髓干细胞成牙分化得到促进，表明miR-431对牙髓干细胞成牙分化有负调控作用；③miR-431对牙髓干细胞的增殖和克隆形成能力有抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8123-1040(吴韫慧)

关键词: miR-431, 牙髓干细胞, 成牙分化, 增殖, 克隆形成, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Dental pulp stem cells have great clinical potential in dental repair and reconstruction through modern cellular and molecular biology and tissue engineering approaches.
OBJECTIVE: To explore the effect of microRNA-431 (miR-431) on the odontogenetic differentiation and in vitro proliferation of dental pulp stem cells.
METHODS: Dental pulp stem cells were isolated by enzyme digestion and induced to odontogenetic differentiation. Alkaline phosphatase activity was measured by Alkaline Phosphatase Assay Kit. Expression of odontogenetic differentiation markers, dentin sialophosphoprotein, osteocalcin and bone sialoprotein, was detected by western blot. Expression of miR-431 was detected by qRT-PCR. Cell proliferation and colony formation ability of dental pulp stem cells were detected by MTT and colony formation assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Alkaline phosphatase activity and the expression of dentin sialophosphoprotein, osteocalcin and bone sialoprotein were increased but the expression of miR-431 reduced during the odontogenetic differentiation. Odontogenetic differentiation was inhibited by miR-431 overexpression, while miR-431-knockdown promoted the odontogenetic differentiation of dental pulp stem cells. These results indicate that miR-431 negatively regulates the odontogenetic differentiation of dental pulp stem cells, and it also inhibits the proliferation and colony formation ability of dental pulp stem cells.

Key words: dental pulp stem cells, odontogenetic differentiation, proliferation, clonal formation, stem cells

中图分类号:

吴韫慧，郭磊，蒋翠霞，杨玉玲，袁冬冬，王楠. 人牙髓干细胞增殖分化过程中的miR-431[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3323-3328.

Wu Wenhui, Guo Lei, Jiang Cuixia, Yang Yuling, Yuan Dongdong, Wang Nan. MicroRNA-431 effects on the differentiation and proliferation of human dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3323-3328.

图/表（结果） 1

2.1 牙髓干细胞成牙分化过程中miR-431及成牙分化标志物的表达 目前，临床上获取牙髓干细胞的方法是从自然替换的乳牙、智齿和畸牙等需要拔出的牙中收集牙髓，使用组织培养或酶消化等方法分离获得^[22]。取健康前磨牙牙髓采用酶消化的方法成功分离培养出牙髓干细胞。为了检测牙髓干细胞成牙分化过程中miR-431及成牙分化标志物表达情况，提取出成牙分化前后的牙髓干细胞RNA，将提取的RNA反转录为cDNA，通过Real-time PCR检测miR-431表达。使用试剂盒和Western blot分别检测成牙分化前后碱性磷酸酶活性以及成牙分化标志蛋白牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)、骨唾液蛋白(BSP)的表达。结果显示，成牙分化诱导后碱性磷酸酶活性增加，成牙分化标志蛋白牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白表达上升，miR-431表达量降低，提示miR-431负向调控成骨分化，见图1。

2.2 miR-431抑制牙髓干细胞的成牙分化 为了检测miR-431对牙髓干细胞成牙分化的影响，实验将转染miR-431模拟剂或抑制剂的牙髓干细胞进行成牙分化诱导，培养12 d后检测miR-431表达、碱性磷酸酶活性以及成牙分化标志蛋白的表达。图2A的结果显示，转染miR-431模拟剂后细胞miR-431表达量明显升高，转染miR-431抑制剂后细胞miR-431表达显著降低。这些结果表明转染miR-431模拟剂和抑制剂可成功促进或者敲降牙髓干细胞miR-431的表达。图2B和图2C的结果显示，与正常分化的细胞相比，转染miR-431模拟剂后碱性磷酸酶活性降低，成牙分化标志蛋白表达降低，表明过表达miR-431成牙分化受到抑制。转染miR-431抑制剂后碱性磷酸酶活性增加，成牙分化标志蛋白表达上升，表明降低miR-431表达促进了成牙分化。

2.3 miR-431对牙髓干细胞增殖率的影响 牙髓干细胞转染miR-431模拟剂和抑制剂，采用MTT法检测细胞增殖率，见图3。转染miR-431模拟剂后细胞增殖率下降，转染miR-431抑制剂后细胞增殖率上升，表明miR-431对牙髓干细胞的增殖有抑制作用。

2.4 miR-431对牙髓干细胞克隆形成能力的影响 为了检测miR-431对牙髓干细胞克隆形成能力的影响，将牙髓干细胞培养12 d后显微镜下计数细胞克隆，计算克隆形成率，见图4。结果发现转染miR-431模拟剂后细胞集落形成数减少，转染miR-431抑制剂后集落形成增多，表明miR-431对牙髓干细胞集落形成有抑制作用。

参考文献

[1] Syed-Picard FN, Ray HL Jr, Kumta PN, et al. Scaffoldless tissue-engineered dental pulp cell constructs for endodontic therapy. J Dent Res. 2014;93(3):250-255.

[2] Tatullo M, Marrelli M, Shakesheff KM, et al. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med. 2015;9(11):1205-1216.

[3] Shi S, Bartold PM, Miura M, et al. The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. Orthod Craniofac Res. 2005;8(3):191-199.

[4] Liu H, Gronthos S, Shi S. Dental pulp stem cells. Methods Enzymol. 2006;419:99-113.

[5] 杜丽娟,苗勇,胡志奇.成体细胞转化为多能干细胞诱导方法的研究进展[J].中华实验外科杂志, 2014, 31(11): 2630-2631.

[6] Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(25):13625-13630.

[7] Gronthos S, Brahim J, Li W, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002;81(8): 531-535.

[8] La Noce M, Paino F, Spina A, et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. J Dent. 2014;42(7):761-768.

[9] Alge DL, Zhou D, Adams LL, et al. Donor-matched comparison of dental pulp stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. 2010;4(1):73-81.

[10] Kim S, Shin SJ, Song Y, et al. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015;2015:409347.

[11] Lee SM, Zhang Q, Le AD. Dental stem cells: sources and potential applications. Current Oral Health Reports. 2014; 1(1):34-42.

[12] Bansal R, Jain A. Current overview on dental stem cells applications in regenerative dentistry. J Nat Sci Biol Med. 2015;6(1):29-34.

[13] Modino SA, Sharpe PT. Tissue engineering of teeth using adult stem cells. Arch Oral Biol. 2005;50(2):255-258.

[14] Stroynowska-Czerwinska A, Fiszer A, Krzyzosiak WJ. The panorama of miRNA-mediated mechanisms in mammalian cells. Cell Mol Life Sci. 2014;71(12):2253-2270.

[15] Friedman RC, Farh KK, Burge CB, et al. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19(1):92-105.

[16] Huang TC, Pinto SM, Pandey A. Proteomics for understanding miRNA biology. Proteomics. 2013;13(3-4): 558-567.

[17] Shenoy A, Blelloch RH. Regulation of microRNA function in somatic stem cell proliferation and differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(9):565-576.

[18] Miyoshi N, Ishii H, Nagano H, et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell Stem Cell. 2011;8(6):633-638.

[19] Baglìo SR, Devescovi V, Granchi D, et al. MicroRNA expression profiling of human bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation reveals Osterix regulation by miR-31. Gene. 2013;527(1):321-331.

[20] Hamam D, Ali D, Kassem M, et al. microRNAs as regulators of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2015;24(4):417-425.

[21] Zhang W, Walboomers XF, Van Kuppevelt TH, et al. In vivo evaluation of human dental pulp stem cells differentiated towards multiple lineages. J Tissue Eng Regen Med. 2008; 2(2-3):117-125.

[22] Hilkens P, Gervois P, Fanton Y, et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Res. 2013;353(1):65-78.

[23] Gay I, Cavender A, Peto D, et al. Differentiation of human dental stem cells reveals a role for microRNA-218. J Periodontal Res. 2014;49(1):110-120.

[24] Gong Q, Wang R, Jiang H, et al. Alteration of microRNA expression of human dental pulp cells during odontogenic differentiation. J Endod. 2012;38(10):1348-1354.

[25] Liu W, Gong Q, Ling J, et al. Role of miR-424 on angiogenic potential in human dental pulp cells. J Endod. 2014;40(1): 76-82.

[26] Hara ES, Ono M, Eguchi T, et al. miRNA-720 controls stem cell phenotype, proliferation and differentiation of human dental pulp cells. PLoS One. 2013;8(12):e83545.

[27] Wheeler G, Ntounia-Fousara S, Granda B, et al. Identification of new central nervous system specific mouse microRNAs. FEBS Lett. 2006;580(9):2195-2200.

[28] Wu D, Murashov AK. MicroRNA-431 regulates axon regeneration in mature sensory neurons by targeting the Wnt antagonist Kremen1. Front Mol Neurosci. 2013;6:35.

[29] Liu R, Ma X, Xu L, et al. Differential microRNA expression in peripheral blood mononuclear cells from Graves' disease patients.J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(6):E968-972.

[30] Pan L, Ren F, Rong M, et al. Correlation between down-expression of miR-431 and clinicopathological significance in HCC tissues. Clin Transl Oncol. 2015;17(7): 557-563.

[31] Sun K, Zeng T, Huang D, et al. MicroRNA-431 inhibits migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting the ZEB1-mediated epithelial-mensenchymal transition. FEBS Open Bio. 2015;5:900-907.

[32] Sun K, Zeng T, Huang D, et al. MicroRNA-431 inhibits migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting the ZEB1-mediated epithelial-mensenchymal transition. Genes Dev. 2015;29(15):1605-1617.

[33] Salmon B, Bardet C, Khaddam M, et al. MEPE-derived ASARM peptide inhibits odontogenic differentiation of dental pulp stem cells and impairs mineralization in tooth models of X-linked hypophosphatemia. PLoS One. 2013;8(2):e56749.

[34] Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-Ike T, et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch Oral Biol. 1992;37(12):1045-1055.

[35] Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-Ike T, et al. Loss of bone sialoprotein leads to impaired endochondral bone development and mineralization. Bone. 2015;71:145-154.

[36] Yang L, Cheng P, Chen C, et al. miR-93/Sp7 function loop mediates osteoblast mineralization. J Bone Miner Res. 2012; 27(7):1598-1606.

[37] Guo S, Lim D, Dong Z, et al. Dentin sialophosphoprotein: a regulatory protein for dental pulp stem cell identity and fate. Stem Cells Dev. 2014;23(23):2883-2894.

[38] Sreenath T, Thyagarajan T, Hall B, et al. Dentin sialophosphoprotein knockout mouse teeth display widened predentin zone and develop defective dentin mineralization similar to human dentinogenesis imperfecta type III. J Biol Chem. 2003;278(27):24874-24880.

[39] Liu P, Zhao Y, Yan Y, et al. Construction of extracellular microenvironment to improve surface endothelialization of NiTi alloy substrate. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015; 55:1-7.

[40] 何飞,谭颖徽,张纲.人牙髓干细胞的体外培养和鉴定[J].华西口腔医学杂志, 2005, 23(1): 75-78.

引言

牙髓被硬的牙本质包围，富含血管、神经、结缔组织和间质细胞^[1]。牙髓的主要功能是产生牙本质和保持牙本质的生物生理活性^[2]。复杂的结构组成给牙齿提供了一定的硬度和稳定性，但是牙齿依然容易受到机械、化学和细菌等损伤。牙齿受到损伤后，只能得到很有限的修复，不能够完全再生^[3]。在生物体内，牙髓干细胞能够迁移到牙本质表面并且分化成牙本质细胞来修复牙本质^[4]，这样形成的牙本质通常是不规则的，但是可以给牙髓提供保护作用。

干细胞是一类具有分化增殖和自我更新能力的细胞。根据个体发育过程中出现的次序不同干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞^[5]。牙髓干细胞属于成体干细胞。牙髓干细胞在2000年被Gronthos等^[6]发现，Gronthos从健康人第三磨牙牙髓中分离得到与骨髓间充质干细胞具有相似免疫表型、矿化能力、克隆形成能力、高增殖能力和多向分化潜能的间充质细胞^[7]。在一定环境条件下牙髓干细胞可以分化为牙本质细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等^[8]。牙髓干细胞的增殖能力、可获得性和干/祖细胞比例都要优于骨髓间充质干细胞^[9]，在维持牙髓的动态平衡以及牙齿的修复和再生中发挥了重要的作用。

研究者将牙髓干细胞种植在生物支架材料上植入裸鼠体内，获得了牙髓-牙本质复合体样结构^[10]。另有研究者提出利用牙髓干细胞和组织工程技术重建部分牙组织，再在其上进行牙冠修复，该技术具有广阔的临床应用前景^[11]。随着对成牙机制认识的深入和组织工程学的飞速发展，牙组织工程已经成为研究的热点。牙髓干细胞是构建组织工程牙齿的重要种子细胞之一，与其他干细胞相比，牙髓干细胞具有来源丰富、异体移植不良反应小、没有伦理争议等优点^[12]。利用现代细胞分子生物学和组织工程技术，将干细胞用于修复和重建牙组织具有积极的临床应用价值^[13]。

miRNA是一类长度为17-25个核苷酸的非编码小RNA，它可以通过互补配对绑定到靶基因mRNA的3’UTR从而调控靶基因的表达^[14]。每一个miRNA可以调控多个靶基因，miRNA可以绑定到大约60%的基因^[15]，miRNA在人体细胞中大量存在，调控大量的生理和病理过程^[16-17]。将成熟的miRNA转染到分化的成纤维细胞可以使细胞重新编程为具有分化潜能的细胞^[18]。miRNA在骨髓间充质干细胞的成骨分化和成脂分化中也有重要的作用^[19-20]。

牙髓干细胞体外培养时容易自发分化和失去自我更新能力^[21]，难以在体外大量扩增，限制了对牙髓干细胞的实验研究。因此，如何提高牙髓干细胞的体外增殖能力并防止其分化，成为亟待解决的问题。此研究探索了miR-431在牙髓干细胞牙向分化中的作用以及miR-431对牙髓干细胞体外增殖能力的影响，为牙髓干细胞的临床应用提供了新的线索和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 于2014年7月至2015年9月在郑州市第七人民医院药剂科和病理实验室完成。

1.3 材料 miR-431模拟剂、抑制剂由GenePharma公司合成；Lipofectamine RNAi-MAX购自Life Technologies公司；α-MEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、青/链霉素、L-谷氨酰胺购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、MTT、二甲基亚砜、Ⅰ型胶原酶、Dispase、吉姆萨染液购自美国Sigma公司；miRNA抽提试剂盒、miRNA反转录试剂盒购自Ambion公司；鼠抗牙本质涎磷蛋白(DSPP)购自Santa Cruz公司；碱性磷酸酶活性检测试剂盒、兔抗骨钙素(OCN)、兔抗骨唾液蛋白(BSP)抗体购自Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、NP40裂解液、鼠抗GAPDH、HRP标记的山羊抗兔、HRP标记的山羊抗鼠购自Beyotime公司；ECL显色液购自Millipore公司。

1.4 实验方法

1.4.1 牙髓干细胞分离培养 经伦理委员会同意，收集临床上12-28岁健康者因正畸治疗或阻生需要而拔除的健康前磨牙，受试者及家属均知情同意。无菌条件下取出牙髓，剪成1 mm³的小块，用3 g/LⅠ型胶原酶和4 g/L Dispase在37 ℃消化1 h，将形成的悬液通过70 μm的细胞筛网制成单细胞悬液，离心沉淀细胞，用α-MEM培养基(含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)培养细胞，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中培养，每隔3 d换1次培养基。细胞长到融合度为80%时胰酶消化传代培养。

1.4.2 牙髓干细胞成牙分化诱导 取第3代牙髓干细胞，使用诱导培养基(含体积分数为15%胎牛血清，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.2 mmol/L抗坏血酸，100 nmol/L地塞米松的α-MEM培养基)培养细胞，每3 d换1次培养基，诱导培养12 d。

1.4.3 miRNA模拟剂和抑制剂的转染 待细胞长到60%-80%融合度时将合成的miR-431模拟剂(或模拟剂阴性对照)和miR-431抑制剂(或抑制剂阴性对照)用Lipofectamine RNAi-MAX转染到未分化的牙髓干细胞中，miR-431模拟剂或抑制剂终浓度为20 nmol/L，转染过程中使用无血清的Opti-MEM培养基。将细胞置于含体积分数为5%CO₂的37 ℃培养箱中孵育24 h，换成正常的培养基继续培养。

1.4.4 碱性磷酸酶活性 细胞用冷PBS洗2次，使用NP40裂解液(加入1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF)冰上裂解30 min，13 000×g离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性。将碱性磷酸酶活性除以总蛋白浓度得到碱性磷酸酶的比活性。

1.4.5 qRT-PCR 使用miRNA抽提试剂盒按照说明书的操作提取细胞的miRNA，Nanodrop 2000测定提取的RNA浓度，使用miRNA反转录试剂盒进行反转录反应。以U6为内参，用Real-time PCR进行相对定量，采用2^-^??Ct方法分析miR-431在牙髓干细胞的相对表达水平。

1.4.6 Western blot 细胞用冷的PBS洗2次，使用RIPA裂解液(添加1 mmol/L PMSF)裂解细胞，4 ℃，12 000 ×g离心5 min，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒定量细胞总蛋白浓度，每组取50 μg蛋白进行凝胶电泳。电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入抗DSPP、OCN和BMPR2的抗体作为一抗，以GAPDH作为内参，4 ℃孵育过夜，HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠作为二抗，37 ℃孵育1 h，加入ECL显色液，在暗室中进行胶片曝光检测蛋白表达。

1.4.7 MTT检测细胞增殖率 将牙髓干细胞接种在96孔板上，转染miR-431模拟剂和抑制剂后，间隔4 d取4个孔进行MTT实验，加入10% MTT反应液(5 g/L)，37 ℃反应 4 h，移去培养基，细胞用PBS洗2次，加入150 μL二甲基亚砜，将培养板均匀振荡5 min，用酶标仪检测细胞在570 nm处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.4.8 细胞克隆形成(CFU-F)能力 牙髓干细胞经胰酶消化后计数，按10³个/孔接种于6孔板中，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中培养12 d，移去培养基，将细胞用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，吉姆萨染色20 min，移去染色液，水冲洗后晾干，在显微镜下计数> 50个细胞的细胞克隆，计算克隆形成率。

1.5 统计学分析 实验数据均以x(_)±s表示，采用GraphPad Prism 5软件进行分析处理。组间差异使用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

miRNA在干细胞分化中的作用研究较多，但是miRNA在牙髓干细胞分化中的研究还较少。Gay等^[23]使用qRT-PCR的方法比较了牙周膜干细胞、牙髓干细胞和牙龈干细胞在分化过程中的miRNA表达变化。Gong等^[24]鉴定出22个在牙髓干细胞成牙分化过程中差异表达的miRNA。Liu等^[25]使用微阵列的方法鉴定出miR-424在牙髓干细胞内皮分化过程中差异表达。Hara等^[26]发现miR-720在牙髓干细胞成牙分化过程中上调，通过靶向干细胞关键蛋白NANOG调控牙髓干细胞的分化。

miR-431最初是从老鼠胚胎的脑组织中克隆出来，原位杂交显示miR-431在脑桥中高表达，被确定为中枢神经系统特异的miRNA^[27]。但是，研究者对miR-431的生理功能依然只有很有限的了解。通过和Kremen1 mRNA的3’-UTR相互作用，miR-431可以沉默Kremen1从而促进再生轴突的生长^[28]。在最近两三年的研究也发现miR-431在调控癌症发展中是重要的角色。通过微阵列分析发现miR-431可能和细胞的生存力有关。在甲状腺功能亢进患者外周血单个核细胞中，miR-431的表达被抑制，病情缓解期miR-431表达恢复^[29]。在肝癌中，miR-431的下调和一系列的临床病理指标有关^[30]，miR-431可以通过靶向ZEB1介导的上皮细胞-间充质转化抑制肝癌细胞的迁移和扩张^[31]。在小鼠肌细胞中，miR-431通过调控SMAD4的表达从而促进成肌细胞的分化以及骨骼肌的再生^[32]。但是miR-431在细胞分化中的作用研究还较少。

碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白是牙髓干细胞成牙分化的标志物，通过检测这些蛋白的含量和活性可以反映牙髓干细胞成牙分化的进程^[33]。碱性磷酸酶可以刺激牙髓细胞形成牙基质，是参与钙化组织形成、代谢和再生的重要指标，较高的碱性磷酸酶活性是牙本质细胞分化和发生矿化的前提条件^[34]。骨钙素、骨唾液蛋白等非胶原蛋白在细胞分化为矿化组织的过程中起着重要的作用^[35-36]，牙齿的再生包含矿化过程。牙本质涎磷蛋白是牙髓干细胞成牙分化的必需蛋白^[37]。敲除牙本质涎磷蛋白的小鼠牙齿矿化不足，牙本质层变薄，牙髓腔变大^[38]。该研究发现，在牙髓干细胞成牙分化过程中，成牙分化的标志物牙本质涎磷蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白表达上调，碱性磷酸酶活性增加，miR-431表达下调，提示miR-431可以负向调控成骨分化。为了进一步验证这一结论，将miR-431模拟剂和抑制剂转染到牙髓干细胞中研究其对牙髓干细胞成牙分化的影响，结果发现转染miR-431模拟剂后成牙分化受到抑制，转染miR-431抑制剂则可以促进成牙分化，这些结果证实了miR-431可以负向调控成骨分化。

MTT法是常用的测定细胞增殖的方法，它的原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使MTT还原为不溶的蓝紫色甲臜，甲臜的形成量与细胞数量和活性呈正相关的关系^[39]，通过比色测定甲臜含量即可反映出活细胞数量和活性。该研究发现转染miR-431模拟剂后细胞增殖率下降，转染miR-431抑制剂后细胞增殖率上升，说明miR-431对细胞增殖有抑制作用。体外克隆形成是干细胞具有自我更新能力的体现，通过计数CFU-F可间接反映干细胞的数量^[40]。研究表明转染miR-431模拟剂后集落形成数减少，转染miR-431抑制剂后集落形成增多，反映miR-431对牙髓干细胞自我更新有抑制作用，从而抑制了细胞集落形成。

该研究探索了miR-431对人牙髓干细胞增殖及分化的影响，发现miR-431可以抑制牙髓干细胞的牙向分化和增殖能力，为牙髓干细胞的临床应用提供了理论依据，miR-431抑制牙髓干细胞增殖和分化的具体机制还需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程