Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能，参与肝脏的修复与重建，是肝细胞的重要来源，但是人体的胎肝干细胞含量极少，如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。

目的：构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siRNA载体，探讨抑制 Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。

方法：体外培养鼠胎肝干细胞，设计及合成靶向Cx43的siRNA序列(Cx43-siRNA)以及阴性对照序列(NC-siRNA)，采用电转法转染大鼠胎肝干细胞，即为实验组和对照组，未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达；细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况；流式细胞术测定细胞周期分布的变化。

结果与结论：转染Cx43-siRNA后，实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低，细胞的生长速度明显增快，G₀/G₁期细胞减少，S期细胞数增多，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果表明通过电转法转染靶向Cx43的siRNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖，对其培养有优化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 连接蛋白43, 基因干扰, 鼠胎肝干细胞, 细胞增殖, 细胞周期

Abstract:

BACKGROUND: Fetal liver stem cells have the potential to differentiate into hepatocytes and bile duct cells, and participate in the repair and reconstruction of the liver, which is an important source of hepatocytes. But there are a little amount of fetal liver stem cells in human body, and how to obtain a certain number of high-purity fetal liver stem cells is currently a hot research.

OBJECTIVE: To construct a siRNA carrier that can effectively inhibit the expression of connexin 43 (Cx43) in rat fetal liver stem cells, and to investigate the effect of Cx43 inhibition on the proliferation and cell cycle of fetal liver stem cells cultured in vitro.

METHODS: Fetal liver stem cells were cultured by the suspension culture in vitro, siRNA sequences targeting Cx43 (Cx43-siRNA) and negative control sequence (NC-siRNA) were designed and synthesized. Then, rat fetal liver stem cells were transferred electrophoretically and divided into three groups: blank group, NC-siRNA group, Cx43-siRNA group. Real-time PCR and western blot were used to assess the knockdown efficiency. Cellular proliferation was determined by cell growth curve and cell counting kit-8 assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry.

RESULTS AND CONCLUSION: After transfection, the Cx43 gene and protein expression levels were declined dramatically in the Cx43-siRNA, NC-siRNA and blank groups, and the cells grew faster. The number of cells at G₀/G₁ phase decrease, but the number of cells in S phase increased. There were significant differences between the groups (P < 0.05). Electrophoretic transfer of Cx43-siRNA can promote the proliferation of cultured fetal liver stem cells and optimize the cell culture.

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Key words: Hepatocytes, Connexin 43, RNA, Small Interfering, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

张增光，秦鸣放. Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2133-2137.

Zhang Zeng-guang, Qin Ming-fang. Optimized effect of connexin 43 gene silencing on the proliferation of fetal liver stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2133-2137.

图/表（结果） 4

2.1 胎肝干细胞形态 原代培养1 d后细胞呈贴壁性生长，圆形或者卵圆形，胞质清晰，核质比高，核大。在特殊培养条件下胎肝干细胞不断的增殖分裂，速度较快，第3天形成了3-5个胎肝干细胞组成的细胞团，1周时细胞团数量增至6-10个，培养30 d左右时形成了肉眼可见的细胞集落，见图1。采用流式细胞仪对胎肝干细胞进行鉴定，CD133和上皮细胞黏附分子呈现高表达，证实了培养细胞为胎肝干细胞。

2.2 Cx43-siRNA转染抑制胎肝干细胞中Cx43 mRNA的表达 RT-PCR检测结果显示，与空白组和对照组比较(0.70±0.07，0.71±0.04)，实验组Cx43 mRNA的表达明显减少(0.47±0.06)，差异均有显著性意义(P < 0.05)。空白组和对照组比较Cx43 mRNA的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，表明Cx43-siRNA转染能够有效抑制胎肝干细胞中Cx43 mRNA的表达，见图2。

2.3 Cx43-siRNA转染抑制胎肝干细胞中Cx43蛋白的表达 与空白组和对照组比较(0.97±0.14，0.99±0.16)，实验组Cx43蛋白的表达明显减少(0.65±0.12)，差异均有显著性意义(P < 0.05)。空白组与对照组比较Cx43蛋白的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 细胞生长曲线 Cx43-siRNA转染后，实验组鼠胎肝干细胞增殖能力较对照组、空白组明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 CCK-8检测结果 Cx43-siRNA转染48 h后，实验组鼠胎肝干细胞吸光度值(0.29±0.06)较对照组、空白组(0.17± 0.03，0.17±0.02)明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 细胞周期分布 Cx43-siRNA转染48 h后，实验组S期细胞明显多于对照组、空白组，实验组G₁期细胞明显少于对照组、空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)，M期细胞无明显变化，见表2。

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引言

材料方法

设计：细胞水平体外观察实验。

时间及地点：于2013年3月至2014年5月在天津医科大学动物实验室完成。

材料：

实验动物：F344大鼠65只，体质量200-250 g，由天津医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(津)20050002。恒温下饲养，自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。

实验方法：

细胞培养：F344大鼠以雌雄比2∶1合笼进行混养，每天8：00点定时观察，观察到雌鼠出现阴栓后即刻雌雄分笼饲养，并记录受孕日期，于无菌条件下取出14 d胎龄的胎鼠行胎肝分离。按照文献[3]描述方法利用Percoll不连续梯度离心将胎肝细胞从大鼠胎肝内提取出来并贴壁培养。通过胰蛋白酶差速消化及差速贴壁法将培养基中的胎肝细胞进行纯化。培养3代后，通过Percoll连续梯度离心法将细胞分为6层。取第1，2层细胞，通过流式细胞仪进行鉴定。

靶向Cx43的siRNA设计与合成：按照文献[4]设计靶向Cx43基因的Cx43-siRNA序列，正义链5’-GAT CCC CGC TGG T-TA CTG GTG ACA GAT TCA AGA GAT CTG TCA CCA GTA ACC AGC-TTT TTT-3’，反义链 5’-AGC TAA AAA AGC TGG TTA CTG GTG ACA GAT CTC TTG AAT CTG TCA CCA GTA ACC AG-C GGG-3’；无同源性的阴性对照序列(negative control siRNA，NC-siRNA)正义链 5’-GAT CCC CCG GTT CGT GTA AGG TGA ACT TCA AGA GAG-TTC ACC TTA CAC GAA CCG TTT TTT-3’，反义链 5’-AGC TAA AAA A-GC TGG TTA CTG GTG ACA GAT CTC TTG AAT CTG T-CA CCA GTA ACC AGC GGG-3’。所有序列均由上海 Invitrogen 生物公司合成，质粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-EGFP，pcDNA3.1(+)EGFP)购自美国Invitrogen公司，由珠海英平生物技术有限公司构建shRNA质粒，用于下一步实验。

Cx43-siRNA电转染胎肝干细胞：转染前1 d，胎肝干细胞接种在24孔板上，置于CO₂培养箱中37 ℃温育48 h后，加入电转液，重悬细胞，800×g离心5 min，洗涤细胞3次，离心后重悬于电转液中，移入电击杯，混匀，冰上放置0.5 h后，进行电穿孔(电压450 V/cm，电容 25 μF，时间0.9 ms)，Cx43-siRNA电转染后的胎肝干细胞为实验组，室温下放置0.5 h，将细胞移入加有DMEM培养基(含体积分数为10%小牛血清，1%双抗)的培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内培养，同时以NC-siRNA电转染胎肝干细胞作为对照组，未转染的胎肝干细胞为空白组，于转染48 h后进行RNA干扰效应的检测。

RT-PCR检测：细胞弃培养液，每组收集1×10⁷个细胞，PBS冲洗3次后，TRIzol法提取总RNA，通过cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。分别扩增Cx43和内参GAPDH。Cx43引物序列：上游：5’-GTC GAC ATG GGT GAC TGG AGC GCC TT-3’，下游：5’-GCG GCC GCC TAG ATC TCC AGG TCA TCA GG-3’，扩增产物为1 149 bp。GAPDH上游：5’-GAG TCA ACG GAT TGG TCG T-3’，下游：5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3’，扩增产物185 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察电泳结果，UVI凝胶成像系统进行摄像，Image-Pro Plus 8.0 软件分析条带灰度值，用Cx43/GAPDH 代表Cx43 mRNA的相对表达量。

Western blot检测：每组收集1×10⁷个细胞，PBS冲洗3次，提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，入等体积2×上样缓冲液，99 ℃变性10 min。离心后吸取30 μL上样，经10% SDS-PAGE分离后，通过半干法电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉，于37 ℃封闭2 h，加入1∶1 000稀释的Cx43多克隆一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜5次，5 min/次，加入1∶5 000 HRP标记的二抗和GAPDH，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤2次，通过ECL法检测。暗室曝光X射线片，冲洗胶片，UVI 凝胶成像系统摄像Image-Pro Plus 8.0 软件分析条带灰度值，用Cx43/GAPDH代表代表Cx43蛋白的相对表达量。

生长曲线测定：在24孔板上按1.6×10⁴/孔接种3组鼠胎肝干细胞，每组设3个复孔。第2天起，每天同一时间消化每组细胞3个孔，精确计数，连续5 d，绘制各组细胞的生长曲线图。

CCK-8检测：在96孔板上按1×10⁴/孔接种3组鼠胎肝干细胞，每组设3个平行孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养48 h后，加入含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基200 μL，置于培养箱中孵育48 h后每孔加入CCK-8 20 μL，培养箱孵育4 h后，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。另设空白孔作为对照。

流式细胞仪检测：调整每组细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，经冷PBS洗涤2次，加入体积分数为70%的冷乙醇(4 ℃)固定24 h。洗涤细胞，与含10 mg/L RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min。50 mg/L碘化丙啶进行细胞DNA染色，1 h内流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，计算出每个周期细胞的百分率。

主要观察指标：胎肝干细胞形态、Cx43 mRNA和蛋白的表达、细胞增殖能力、细胞周期分布。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，由第一作者采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析，两组之间的两样本比较用q 检验(即Newman-kueuls法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前最为有效治疗终末期肝脏疾病的治疗方法是肝移植，但是由于肝脏供体的紧缺，大多数患者并不能得到肝移植的治疗^[10-12]，实验研究证明，在特定条件下胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能^[13-16]，参与肝脏的修复与重建，是肝细胞的重要来源。干细胞移植具有操作简单、创伤小、不存在组织配型和免疫排斥、易于体外扩增等优点。肝干细胞移植治疗方法作为一种新的治疗领域受到研究人员的关注^[17-19]。人体肝干细胞含量极为稀有，严重制约着临床工作中肝干细胞移植治疗相关肝脏疾病的发展，怎样有效、方便、快捷地增殖、诱导分化及提取干细胞一直是科研工作中的新的研究方向^[20-23]。目前肝干细胞主要来源为肝内干细胞和肝外干细胞。相关研究表明在治疗肝脏损伤时肝外干细胞有致肝纤维化的缺点。胎肝干细胞具有再生肝细胞和胆管系统的能力，移植后细胞存活没有选择压力、存活率高，细胞移植后会持续增殖、不发生排斥反应，定位及扩散容易，是肝干细胞理想的移植类型^[24-26]。

Cx是一个较保守的蛋白家族，Cx43为主要成员^[27-30]。研究表明，Cx43介导间隙连接细胞间通讯，广泛存在于骨髓基质细胞、基质细胞与造血细胞之间^[31-34]，是相邻细胞间普遍存在的作用直接、低阻抗、传导快的通讯方式，细胞间信号转导启动后对正常骨髓基质细胞的增殖起抑制作用。与靶基因诱导的同源的双链RNA特异转录后，核酸酶特异的降解双链RNA，从而产生干扰小RNA(siRNA)，互补结合同源的靶RNA，靶RNA被特异性酶降解，靶基因表达被抑制、下调，导致基因沉默现象被称为RNA干扰，成为研究基因结构功能的有效方法^[35-37]。电转染方法是目前实验室中较为理想的获得高效率转染的方法^[38-39]，利用高压电场电脉冲，外源DNA能通过细胞膜瞬间出现的微小孔洞进入细胞内。

本研究体外培养鼠胎肝干细胞，设计及合成能靶向抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siRNA序列(Cx43–siRNA)，利用电转法转染至大鼠胎肝干细胞，应用Real-time PCR、Western blot法检测鼠胎肝干细胞转染前后Cx43基因和蛋白的表达，应用细胞生长曲线、CCK-8观察细胞生长的优化作用，流式细胞术测定细胞周期分布的变化，检测抑制Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。研究结果显示：转染Cx43-siRNA后，Cx43基因和蛋白表达明显减少，G₀/G₁期细胞减少，S期细胞数增多，细胞生长速度得到了明显增快，与对照组及空白组相比较差异有显著性意义。

综上所述，通过电转法介导靶向Cx43的siRNA转染大鼠胎肝干细胞，Cx43蛋白表达被直接抑制，促进肝干细胞的增殖，有优化培养肝干细胞的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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