不同剂量骨保护素对破骨细胞内一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨保护素和一氧化氮在防治骨质疏松方面有重要作用，但目前关于两者在抑制破骨细胞增殖分化方面的关系研究较少。
目的：验证不同剂量的骨保护素对破骨细胞内生成一氧化氮量及内皮型一氧化氮合酶活性的影响。
方法：用抗酒石酸酸性磷酸酶染色验证诱导生成的破骨细胞；将诱导生成的破骨细胞分成6个组，空白对照组不加任何试剂；阴性对照组培养液中加入培养液；骨保护素组分为4组分别加入10，25，50，75 μg/L不同剂量的骨保护素试剂。采用Annexinv -FITC细胞凋亡检测试剂盒，利用流式细胞仪测定破骨细胞凋亡率；荧光定量PCR检测破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA及蛋白激酶K mRNA 的表达量变化；一氧化氮检测试剂盒检测破骨细胞中内一氧化氮浓度；内皮型一氧化氮合成酶活力试剂盒检测破骨细胞内一氧化氮合酶的活力；骨保护素各组加入内皮细胞型一氧化氮合酶抑制剂；荧光定量PCR检测破骨细胞特异性酶抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA及蛋白激酶K mRNA表达量的变化。
结果与结论：①骨保护素可以抑制破骨细胞的分化生成并诱导其凋亡。②骨保护素的质量浓度与诱导生成的破骨细胞数量及其标志酶mRNA的表达量呈负相关，与破骨细胞凋亡率呈正相关。③骨保护素可以增加破骨细胞内一氧化氮的生成以及内皮型一氧化氮合酶活性的升高；骨保护素的质量浓度与破骨细胞生成的一氧化氮浓度及内皮型一氧化氮合酶活性呈正相关。④Raw264.7细胞在体外培养条件下，骨保护素与一氧化氮在抑制破骨细胞生成及促进其凋亡方面有协同作用，推测两者之间可能存在骨保护素/内皮型一氧化氮合酶/一氧化氮信号通路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨保护素, 破骨细胞, 一氧化氮, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 蛋白激酶K

Abstract:

BACKGROUND: Osteoprotegerin and nitrogen monoxidum play a key role in the prevention and treatment of osteoporosis. However, the correlation of the two in inhibiting the proliferation and differentiation of osteoclasts remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of different doses of osteoprotegerin on nitric oxide production and endothelial nitric oxide synthase activity in osteoclasts.
METHODS: Tartrate resistant acid phophatase staining was used to test whether the induced cells are osteoclasts. Osteoclasts were divided into six groups: blank control group (no reagent); negative control group (DMEM); four osteoprotegerin groups (10, 25, 50, 75 μg/L of osteoprotegerin). Annexinv-FITC kit and flow cytometry were used to test the apoptosis rate of osteoclasts. Real-time PCR was used to detect the expression
of osteoclasts marker gene, TRAP mRNA and protein kinase K mRNA. Nitric oxide production and nitric oxide synthase activity were determined using the corresponding kits. Four osteoprotegerin groups were added with L-NAME, a kind of nitric oxide synthase inhibitor, to test the changes of the apoptosis rates of osteoclasts and the changes of the expression of TRAP mRNA and protein kinase K mRNA of osteoclasts.
RESULTS AND CONCLUSION: Osteoprotegerin inhibited the differentiation of osteoclasts and induced the apoptosis. Osteoprotegerin concentration had a positive correlation with the apoptosis rate of osteoclasts, and a negative correlation with the numbers of osteoclasts and expression of marker gene TRAP mRNA and protein kinase K mRNA in osteoclasts. Osteoprotegerin boosted the nitric oxide production and endothelial nitric oxide synthase activity, and osteoprotegerin concentration was positively correlated to the nitric oxide production and endothelial nitric oxide synthase activity. After Raw264.7 cells were in vitro cultured, osteoprotegerin and nitric oxide play a synergic role in inhibiting osteoclasts production and promoting the apoptosis. We speculate that there is osteoprotegerin/endothelial nitric oxide synthase/nitric oxide signal pathway.

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Key words: osteoprotegerin, osteoclasts, protein kinases

中图分类号:

R318

赵帅，何爱咏，陶澄. 不同剂量骨保护素对破骨细胞内一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6725-6731.

Zhao Shuai, He Ai-yong, Tao Cheng . Effect of osteoprotegerin on nitric oxide production and endothelial nitric oxide synthase activity in osteoclasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6725-6731.

图/表（结果） 7

2.1 细胞形态学观察结果 Raw264.7细胞的诱导培养正常(图1A)，核因子κB受体活化因子配体诱导培养后生成的破骨细胞(图1B)，Trap染色结果显示有被染成酒红色且细胞核≥3个的阳性破骨细胞(图1C)。

2.2 骨保护素对破骨细胞诱导分化的影响 随着骨保护素质量浓度的增加，对破骨细胞的诱导分化的抑制作用越明显，TRAP染(+)的破骨细胞数量越少(图2)。

2.3 骨保护素对破骨细胞调亡坏死的影响 空白对照组和阴性对照组破骨细胞凋亡率正常；但加入骨保护素后随着保护素质量浓度增加，破骨细胞凋亡率增加(图3)。

2.4 骨保护素对破骨细胞生成的一氧化氮的影响 用SPSS 17.0统计软件算出各组的x(_)±s，各组数据经方差齐性检验，显著性=0.217 > 0.05；采用单因素方差分析，设均数差的显著水平P=0.05，各组间两两比较，其中空白对照组与阴性对照组比较，差异无显著性意义(P=0.515 > 0.05)；加入骨保护素组各组分别与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著性意义(P=0 < 0.05，表1)。并且在10-75 mg/L的质量浓度范围内，骨保护素与破骨细胞内一氧化氮水平呈正相关；在10-50 mg/L的质量浓度范围内骨保护素与一氧化氮合酶水平呈正相关。而超过一定浓度范围后随着骨保护素质量浓度的增加，一氧化氮合酶活性开始降低。

2.5 骨保护素对破骨细胞特异性酶mRNA表达的影响 随着骨保护素剂量的增加，破骨细胞中TRAP mRNA的表达量成递减趋势，并且经过统计分析骨保护素组之间以及骨保护素组与对照组(空白对照组、阴性对照组)对比差异有显著性意义(P < 0.05)；加入一氧化氮合酶抑制剂后，破骨细胞中TRAP mRNA表达量较未加入一氧化氮合酶抑制剂前增加，经统计学分析差异有显著性意义(P < 0.05，图4)。同样，随着骨保护素剂量的增加，破骨细胞中蛋白激酶KmRNA的表达量成递减趋势，骨保护素组之间以及骨保护素组与对照组对比差异有显著性意义(P < 0.05)；加入一氧化氮合酶抑制剂后，破骨细胞中蛋白激酶K mRNA表达量较未加入一氧化氮合酶抑制剂前增加，经统计学分析差异有显著性意义(P < 0.05，图5)。TRAP mRNA和蛋白激酶K mRNA、内参基因mRNA的扩容及熔解曲线见图6。

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引言

骨保护素是一种肿瘤坏死因子，在调节骨质疏松等骨代谢方面起到关键作用。它通过与RANK的高亲和力结合，竞争性抑制了核因子受体κB因子与核因子受体κB因子活化配体的结合，从而发挥抑制破骨细胞活性，促进其凋亡的作用^[1]。一氧化氮作为一种脂溶性很强的细胞因子，在人体的许多生理功能中起到关键作用，尤其在心血管系统中，作为调节血管内皮细胞舒缩活性的因子有着重要的意义。

近年来对骨质疏松性骨折的研究中发现一氧化氮也参与其中，并且一定浓度一氧化氮可以抑制破骨细胞活性并诱导破骨细胞凋亡；而在心血管系统领域发现一定浓度骨保护素可以增加血管内皮细胞中一氧化氮浓度，从而起到改善动脉粥样硬化的作用，有可能用于治疗糖尿病等血管硬化方面的疾病^[2]；那么在骨质疏松症的发病机制中，是否存在骨保护素与一氧化氮的某种联系，可以增加破骨细胞内一氧化氮的浓度，使两者发挥协同作用，共同抑制破骨细胞的骨吸收活性，改善骨密度，防止骨质疏松？

付应霄等^[3]动物实验表明，骨保护素可以显著抑制破骨细胞的分化成熟及骨吸收活性，并且可能有诱导期凋亡坏死的作用。Wang等^[4]在研究脂连素对骨代谢的影响时发现，雄性12周龄缺失Adipo小鼠比野生型小鼠骨密度高，骨小梁密集，破骨细胞的数量也相对较少，相对定量PCR显示Adipo基因缺失型小鼠高表达骨保护素而表达核因子κB受体活化因子配体较少。Inanc等^[5]在骨转移癌用咗来磷酸治疗时检测患者血清中核因子κB受体活化因子配体以及骨保护素，发现在使用唑来磷酸治疗后3个月，血清中骨保护素的水平比治疗前有显著上升，而核因子κB受体活化因子配体与骨保护素的水平成负相关。Wang等^[6]在软骨细胞β连接素信号在破骨细胞骨吸收的作用时发现，通过敲出小鼠软骨细胞β连接素cKO基因，激活cAct 基因，结果显示前者有明显的骨量丢失，后者则表现骨量增加，对信号通路的进一步研究发现，该作用是通过调整核因子受体κB因子配体mRNA和骨保护素mRNA的表达比例实现的，软骨细胞β连接素信号的活化，可以使骨保护素mRNA的表达量上调，下调核因子受体κB因子活化配体mRNA，从而抑制破骨细胞的成熟活化和骨吸收活性。

实验用核因子受体κB因子活化配体诱导培养Raw264.7细胞系生成破骨细胞，加入外源性骨保护素，观察不同剂量的骨保护素对破骨细胞体外培养条件下破骨细胞内一氧化氮浓度及内皮型一氧化氮合酶活性的影响，初步分析两者在抑制破骨细胞、促进其凋亡方面的联系，加深对破骨细胞凋亡机制的研究，以期为临床骨质疏松症的治疗提供新的理论方向。

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材料方法

设计：分子和细胞生物学水平的对比观察实验。

时间及地点：2013年6月至2014年1月在中南大学湘雅二医院中心实验室进行。

材料：

实验方法：

Raw264.7细胞的诱导培养：Raw264.7细胞培养并加入核因子受体κB因子活化配体诱导分化生成破骨细胞。破骨细胞的鉴定：TRAP 染色在倒置显微镜下观察细胞核被染成酒红色的细胞并且拍照(细胞核≥3)。

实验分组：将诱导生成的破骨细胞分成6个组，接种到24孔培养板，每组设3个复孔，其中空白对照组不加任何试剂；阴性对照组培养液中加入培养基；骨保护素组分为4组，分别加入10，25，50，75 μg/L骨保护素试剂，进行药物干预，培养3 d，再次用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察并计数被染成酒红色的破骨细胞的数目。

破骨细胞凋亡率检测：采用Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒，利用流式细胞仪测定破骨细胞凋亡率。

破骨细胞特异酶表达的变化：用荧光定量PCR检测 6个组中破骨细胞特异性标志酶TRAP mRNA、蛋白激酶 K mRNA的表达：①RNA的提取：将细胞接种到培养板，每组每个剂量设3个复孔，继续培养待细胞贴壁后收集细胞，加入Trizol液，轻轻吹打后转至EP管，然后按说明书进行操作。②紫外吸收法测定RNA的浓度和纯度，先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零，然后取少量RNA溶液用TE稀释(1∶100)后，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。③RNA的反转录：以提取的总RNA为模版，按照Syber-Green试剂盒的操作步骤进行反转录，其中TRAP酶mRNA的上游引物序列为：5-TGA CGA TGA GGG CTA TTC GG-3；下游的引物序列为5-TTG GGT TGT TGC CTG TGG-3；蛋白激酶K mRNA上游引物序列为：5-GGG CCA GGA TGA AAG TTG TA-3；下游引物序列：5.-CCG AGC CAA GAG AGC ATA TC-3；以B-actin为内参基因，上游引物序列：5-’ TGG CAC CCA GCA CAA T-GAA -3 ’，下游序列5- ’CTA AGT CAT AGT CCG C-CTA GAA GCA-3。④扩增程序：95 ℃×10 min(预变性)，95 ℃×5 s→X ℃×30 s→72 ℃×30 s，经过40个循环(TRAP：X=59 ℃；蛋白激酶K：X=60 ℃)。⑤反应体系：反转录buffer 2 μL；上游引物 0.2 μL；下游引物0.2 μL；dNTP 0.1 μL；反转录酶MMLV 0.5 μL；DEPC水5 μL；RNA模版2 μL；总体积10 μL，每组设3个复孔，重复试验。

一氧化氮和一氧化氮合酶的检测：用一氧化氮检测试剂盒、内皮型一氧化氮合酶活力试剂盒分别检测6个组中一氧化氮的生成量及内皮型一氧化氮合酶活性。

加入一氧化氮合酶抑制剂后破骨细胞特异性酶表达及凋亡率变化：将诱导生成的破骨细胞分为6组，分别设为骨保护素10 μg/L、骨保护素25 μg/L、骨保护素 50 μg/L、骨保护素75 μg/L，空白组和阴性对照组，培养细胞至贴壁生长达80%，分别加入50 μmol/L的一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，37 ℃，体积分数5%CO₂条件下继续培养24 h；Real time PCR 检测破骨细胞标志基因TRAP mRNA及蛋白激酶K mRNA表达量的变化。PCR操作步骤同上。

主要观察指标：TRAP染色验证诱导生成的是否为破骨细胞；碘化丙啶插入DNA法测定破骨细胞凋亡率；破骨细胞生成的一氧化氮浓度和内皮型一氧化氮合酶活性；破骨细胞特异性酶TRAP mRNA和蛋白激酶K mRNA的表达。

统计学分析：数据处理由第一作者应用SPSS 17.0统计软件完成，数据采用x(_)±s表示，各分组间采用单因素方差分析。

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讨论

一方面本实验验证了在一定浓度范围内骨保护素可以减少破骨细胞的生成；并且随着骨保护素质量浓度的增加，其诱导破骨细胞凋亡率增加。

实验通过加入不同剂量的骨保护素，TRAP染色计数生成的破骨细胞的数量，结果显示，随着加入骨保护素剂量的增加，生成的破骨细胞数量逐渐减少，碘化丙啶插入DNA检测破骨细胞凋亡率表明，骨保护素剂量与破骨细胞的凋亡成正相关，与国内外的报道一致。

一氧化氮是体内重要的信号分子，其不仅在心血管领域有着重要的作用。近年研究发现一氧化氮信号通路在骨代谢中也发挥关键作用。Klein-Nulend等^[7]认为一氧化氮作为细胞间的信使在骨重建中发挥关键作用，增加骨的机械负荷可以激活骨细胞膜上的信号通道同时刺激骨细胞产生一氧化氮等小分子物质，结果使骨质量增加。然而，对于一氧化氮对破骨细胞的诱导分化及促进凋亡坏死的作用目前尚无一致结论。

Buso等^[8]在综述中阐述，对于骨保护素对心血管系统疾病到底具有保护作用还是起加剧血管损伤的作用这一问题，根据目前的体内体外研究，提出骨保护素在血管疾病的作用机制受骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/ RANK系统以及TRAIL等信号通路的影响，同时与疾病的进程有关，不同的疾病阶段，可能发挥不同的作用。

Kitaura等^[9]在研究肿瘤损伤因子介导的破骨细胞凋亡发现，一氧化氮在该机制中发挥重要作用，破骨细胞的培养中加入肿瘤坏死因子α可以生成破骨细胞，若同时加入白细胞介素2，白细胞介素8则可以诱导破骨细胞的凋亡；进一步的研究发现一氧化氮可以激活白细胞介素2，白细胞介素8介导恶的细胞坏死，若加入一氧化氮合成酶抑制剂，则破骨细胞的凋亡坏死受到抑制。

在研究一氧化氮供体在预防人类骨质疏松治疗基本原理时发现，绝经后妇女循环血液中一氧化氮的水平显著降低，而给予一定量一氧化氮供体治疗后可以显著改善骨量的丢失。临床已在使用硝酸甘油作为一氧化氮供体治疗骨质疏松，可以达到与添加雌激素相似的效果^[10]。然而在研究辛伐他汀在实验性牙周炎疾病中的保护机制中发现，使用不同剂量的辛伐他汀后，小鼠牙周骨丢失得到改善，血清及免疫组织化学检测发现炎性一氧化氮合酶表达减少致一氧化氮生成减少，而骨保护素的含量增加。有学者认为一氧化氮可以促进破骨细胞的成熟分化，在研究脂多糖诱导的破骨细胞分化生成实验时发现，脂多糖可以使诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达上调，增加一氧化氮的生成，而羊脂酸(一种中链脂肪酸)可以下调一氧化氮合酶mRNA的表达，降低一氧化氮的生成，同时减少脂多糖诱导的破骨细胞特异性基因mRNA的表达。羊脂酸是通过抑制一氧化氮的生成发挥抑制脂多糖诱导的破骨细胞生成的作用^[11]。

实验中发现，骨保护素各组加入内皮型一氧化氮合酶抑制剂后，与未加入之前相比，骨保护素抑制破骨细胞特异性基因TRAP mRNA和蛋白激酶mRNA的表达有所下降(P < 0.05)，诱导破骨细胞坏死的作用也降低。故认为一氧化氮在一定浓度范围内可以抑制破骨细胞的生成并促进其凋亡。

另一方面，本实验证实了最初实验设计的假设，即骨保护素可以增加破骨细胞在体外培养环境下一氧化氮的生成及内皮型一氧化氮合酶的活性。杨伟等^[12]在研究骨保护素对人脐静脉血管内皮细胞影响的实验中发现，与对照组比较，在一定浓度范围内，随着骨保护素质量浓度的增加，其促进血管内皮细胞的增殖和修复作用，提高血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶的表达，增加一氧化氮的生成的作用越明显，从而发挥预防动脉粥样硬化的作用。

然而，针对动脉粥样硬化患者骨保护素水平的升高，有的人则认为是机体的保护性反应，可以作为动脉粥样硬化的风险预测因子。研究发现，与正常人群比较，2型糖尿病早期阶段血清中骨保护素的水平显著增加，骨保护素可以抵消核因子κB受体活化因子配体对血管内皮细胞内一氧化氮合酶的激活作用，导致内皮细胞发生功能紊乱。

Hakimi等^[13]在研究颈动脉粥样硬化时发现，与无症状的颈动脉粥样硬化相比，有症状者血清中骨保护素水平明显增高，可能与血管内皮细胞的损伤有关。

Park等^[14]研究发现系统性红斑狼疮的患者动脉粥样硬化的风险增高，进一步的研究发现与正常组比较，患系统性红斑狼疮患者血清骨保护素的水平增高，提示增高的骨保护素可以作为动脉粥样硬化的风险预测因子。

Augoulea等^[15]在总结糖尿病患者患动脉粥样硬化的诸多因素中，认为在目前非损伤性检查的条件下可以将血清骨保护素水平的升高作为动脉粥样硬化的危险因子。因此，对于骨保护素与血管内皮细胞的机制目前尚未有明确结论。

目前对于一氧化氮与骨保护素的关系尚无明确定论，但对于一氧化氮对骨质疏松发病机制的影响近年来引起广泛的关注和研究，国内肖本熙等^[16]在研究中药白藜芦醇对去卵巢大鼠腰椎骨密度的影响中发现，给予不同浓度的白藜芦醇处理后与未给予处理组相比，去卵巢大鼠的L₅，L₆密度明显增加，同时研究发现腰椎骨密度增高的大鼠血清中一氧化氮浓度及一氧化氮合酶活性明显增加，因此他认为白藜芦醇可以改善骨质疏松，该作用可能与其可以增加血清中一氧化氮含量及一氧化氮合酶活性有关。张世旭等^[17]在研究不同剂量一氧化氮的底物左旋精氨酸对骨质疏松骨折愈合的促进作用中发现，中等剂量的左旋精氨酸可以促进骨质疏松骨折愈合，而大剂量左旋精氨酸虽然可以增加骨折端的一氧化氮含量，但却不能促进骨折的愈合。

这说明一氧化氮促进骨质疏松骨折愈合可能存在更加复杂的机制。国外学者Joshua等^[18]在研究绝经后骨质疏松时发现雌二醇可以增加骨细胞中一氧化氮的含量，因此他推测雌激素改善骨质密度的作用是通过一氧化氮介导的，进一步的研究发现17-雌二醇可以抑制骨细胞的凋亡坏死，该作用部分是通过一氧化氮/c GMP信号通路实现的。同时该学者在研究鸟苷酸环化酶对骨质疏松的治疗作用时发现一氧化氮/c GMP/PKG 可以促进成骨细胞内雌激素样物质的合成及激活。

在实验中发现，在一定浓度范围内，随着骨保护素剂量的增加，破骨细胞生成的一氧化氮量增加，内皮型一氧化氮的表达也增加，而且实验组加入内皮型一氧化氮合酶抑制剂消除一氧化氮对破骨细胞分化及凋亡的影响后检测破骨细胞的特异性表达基因TRAP mRNA和蛋白激酶K mRNA的表达，以及破骨细胞凋亡坏死，与之前骨保护素各组未加入内皮型一氧化氮合酶抑制剂相比，骨保护素抑制破骨细胞分化和凋亡坏死的作用降低(P < 0.05)；实验的结果都采用复孔(重复次数≥ 3)算得，故准确性较高；采用正常对照及阴性对照，增加了实验组数据的可比性。
本次实验的缺点在于：实验仅限于细胞分子水平骨保护素可以引起破骨细胞内一氧化氮及一氧化氮合酶含量的增加，但未从发生机制、信号通路等方面进一步研究；另外，一氧化氮合酶有3种类型，分别是内皮细胞型、炎症诱导型、神经型，本次实验观察了对内皮细胞型一氧化氮合酶的影响，尚需进一步的研究对其他两型的影响。

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