乳兔成骨细胞原代培养与鉴定：改良胶原酶与胰酶的分段消化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：成骨细胞获取的方法较多，如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。
目的：比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。
方法：取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨，采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞，并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。
结果与结论：分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强，具备成骨细胞的典型特征，茜素红染色阳性，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性，Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性，细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达，PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率，更好的细胞活性，且比传统胶原酶消化法耗时短(P < 0.05)；组织块法操作方法最为简单，细胞活性最高，但是细胞产出率最低、耗时最长，不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞，可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨细胞, 成骨细胞, 颅盖骨, 体外培养, 碱性磷酸酶, 骨钙素, Ⅰ型胶原, Ⅲ型胶原

Abstract:

BACKGROUND: There are many kinds of ways to obtain osteoblasts at present, but how to get high-purity osteoblasts in a easy and fast way has become a hot research.
OBJECTIVE: To explore a method to get massive and high purified osteoblasts effectively by comparing three common primary osteoblast culture methods, and to observe the biological characteristics of the osteoblasts from the skull of neonatal rabbit.
METHODS: Calvarias were dissected from newborn New Zealand white rabbits within 24 hours, and osteoblasts were isolated with bone tissue method, collagenase digestion method and modified tryptase and collagenase sequential digestion method respectively, then the cells were subcultured in vitro. Osteoblast proliferation and osteogenic activity were identified by inverted microscope for morphology observation. The rate of living osteobalsts was counted with trypan blue staining. The growth curve of the cells was drawn with MTT method. Alizarin red staining was applied to detect alkaline phosphatase and osteocalcin protein in the cell culture supernatants. Collagen I and collagen III immunohistochemical staining was also performed. RT-PCR was used to determine the expression of osteocalcin and collagen I mRNA expression.
RESULTS AND CONCLUSION: The cultured cells showed highly homogeneous appearance with active proliferation, and they had the typical features of osteoblasts. Alizarin red staining and collagen I immunohistochemical staining were both positive, while collagen III immunohistochemical staining was negative.
Alkaline phosphatase and osteocalcin protein expression in the cell culture supernatants can be detected. The expression of osteocalcin and collagen I mRNA was positive in the RT-PCR test. Compared with collagenase digestion method, the modified tryptase and collagenase I sequential digestion method cost less time, presented higher production of osteoblasts and higher cell survival rate (P < 0.05). Bone tissue method was the easiest method and did the least damage to osteoblasts, but it presented lowest production of osteoblasts and cost the maximum time among the three methods. So it cannot be used in large-scale osteoblast culture. A large quantity of high purity osteoblasts were obtained by modified trypsase and collagenase I sequential digestion method, which can be used as a reliable and efficient way to obtain the original generation osteoblasts in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoblasts, alkaline phosphatase, osteocalcin

中图分类号:

R318

杨森，冯付明，王银辉. 乳兔成骨细胞原代培养与鉴定：改良胶原酶与胰酶的分段消化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6129-6135.

Yang Sen, Feng Fu-ming, Wang Yin-hui. Primary culture and identification of neonatal rabbit osteoblasts: modified tryptase and collagenase sequential digestion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6129-6135.

图/表（结果） 4

2.1 成骨细胞形态学观察结果组织块法第5天细胞从骨片边缘爬出，呈长梭形或多边形并有突起(图1A)；胶原酶消化法分离所得的原代细胞接种5 d后细胞贴壁生长，呈长梭形、三角形或鳞片状，有两三个突起，多为单核(图1B)；改良胶原酶和胰酶分段消化法第5天细胞呈长梭形或鳞片状有两三个突起，体积较大，胞浆丰富(图1C)。3种方法所得细胞均具有成骨细胞特征。

2.2 成骨细胞苏木精-伊红染色结果原代成骨细胞传代至第3代苏木精-伊红染色，见细胞轮廓清晰，细胞呈梭形或星状，有多个突起，胞浆丰富，细胞核为单个蓝色，胞浆为红色(图2A)。

2.3 成骨细胞茜素红染色结果成骨细胞原代培养14 d后，可见细胞汇合处呈现多层重叠生长，形成不透明的钙化区，茜素红染色后，显微镜下可见大块被染成橘红色的钙化结节(图2B)。

2.4 成骨细胞增殖能力MTT测定结果接种后1-3 d细胞生长缓慢为适应期，3-6 d生长较快，为对数生长期，第7-9天生长变缓进入平台期，采用SPSS 13.0统计软件绘制细胞的生长曲线(图3A)。

2.5 碱性磷酸酶测定结果原代成骨细胞连续培养14 d，随培养时间增加，碱性磷酸酶数值先增大后降低，表示成骨细胞分泌了碱性磷酸酶，随着成骨细胞矿化成熟，碱性磷酸酶分泌减少(图3B)。

2.6 骨钙素测定结果原代成骨细胞连续培养14 d，随着培养时间的增加，细胞上清液中骨钙素含量也增加(图4A)。

2.7 Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学染色结果结果判定参考细胞培养学^[6]，Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色阳性，细胞核周围呈黄褐色着色(图4B)；阳性细胞比例达90%以上，Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学染色阴性(图4C)，成骨细胞偶呈淡棕色，表明成骨细胞产生少量Ⅲ型胶原。

2.8 RT-PCR检测成骨细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、GADPH mRNA表达结果骨钙素、Ⅰ型胶原PCR凝胶电泳显示有目的基因，骨钙素、Ⅰ型胶原mRNA表达，扩增产物长度骨钙素为310 bp，Ⅰ型胶原为259 bp，内参GADPH为177 bp(图5)。

2.9 原代成骨细胞3种培养方法的比较结果改良酶消化法与胶原酶消化法比较，分离成骨细胞密度高、纯度好、消化时间短、细胞存活率高；与组织块消化法相比，分离成骨细胞数量多、耗时短，适于成骨细胞大规模培养(表1)。

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引言

成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，对骨的生长发育、代谢平衡和损伤修复至关重要。自1964年Peck等^[1]首次成功将胎鼠骨组织内的成骨细胞进行离体培养开始，经过近几十年的研究，目前成骨细胞的体外培养技术基本成熟。近年来，随着骨组织工程技术的发展，对如何经济而高效地获得种子细胞的研究日趋深入。目前国内外学者已从许多动物的颅骨、骨膜、骨髓基质及骨外组织中成功分离培养出成骨细胞^[2-4]，但是如何在短时间内经济、简便地获取大量成骨细胞还没有形成统一认识。

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞^[5]，对于成骨细胞的研究是探讨骨疾病发病机制与原理的重要手段，同时也是骨组织工程研究的关键^[6-7]。随着骨组织工程技术的快速发展和广泛应用，需要大量的种子细胞用于组织工程骨的构建。成骨细胞是常用的种子细胞，然而它的取材有限，需要通过体外培养扩增以满足需要。原代培养是获得大量成骨细胞的重要手段之一^[8]，也是获取组织后的首次培养，其最大优点是组织与细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性，在一定程度上能反映体内状态^[9]。成骨细胞体外培养的组织来源有松质骨、皮质骨、骨膜和骨髓等^[10]，国内外文献报道中经常把新生动物的颅骨或胚胎颅骨作为成骨细胞的常用来源^[11]。由于新生动物的颅盖骨为板层骨，几乎没有髓腔和小血管，混杂的内皮细胞数量相对较少^[12]，因此实验采用新生24 h之内的新西兰大白兔颅盖骨作为取材来源进行原代培养。

目前，骨来源成骨细胞的分离培养方法主要有组织块法和酶消化法。但组织块培养法存在培养周期长、细胞产出率低且细胞纯度不高的缺点^[13]，因而限制了它的应用。酶消化法是利用胰蛋白酶和胶原酶依次消化细胞间质使成骨细胞分离，一次可获得较多量的细胞，是目前较常用的方法。常用的消化酶主要有胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。胰酶活性较强，但容易损伤细胞膜上的功能蛋白，影响细胞的活性和功能；胶原酶对细胞作用较缓和，但单独应用时细胞不易消化分离，获得的细胞数量较少^[14]。有研究证实骨组织中各类细胞耐受消化酶能力依次为：成纤维细胞<破骨细胞<骨祖细胞<成骨细胞^[15]。成骨细胞分泌基质有机成分中90%是Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原酶是Ⅰ、Ⅲ型胶水解的关键酶^[16-17]，鉴于此应采用胰酶和Ⅰ型胶原酶相结合的方法，有学者的研究结果也表明了这一点^[12^，^14]。传统的酶消化法虽可获得大量的成骨细胞，但存在酶消化时间长且不容易控制、操作步骤复杂和容易造成污染等不足。因此，本实验针对上述实验方法的不足，采取改良的胰酶和Ⅰ型胶原酶分段消化法。

实验将分别使用组织块法、胶原酶消化法及改良胶原酶和胰酶分段消化法共3种方法分离获取成骨细胞，旨在探索出兔颅骨来源的成骨细胞的体外培养，以期为更好更快地获取成骨细胞提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞形态学与生物学特性实验。

时间及地点：2013年11月至2014年2月在河南省医药科学研究院分子生物学实验室完成。

材料：

乳兔成骨细胞的原代培养与鉴定实验用试剂与仪器：
试剂及仪器	来源
L-DMEM培养基，胎牛血清	Gibco，USA
胰酶、青链霉素溶液、MTT	Genview，USA
Ⅰ型胶原酶	Invitrogen，USA
β-甘油磷酸钠粉剂、抗坏血酸	Sigma，USA
茜素红染液	北京索莱宝科技有限公司
碱性磷酸酶试剂盒	南京建成生物制品有限公司
Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原SABC免疫组织化学试剂盒	北京博奥森生物技术公司
酶免骨钙素	ADL，USA
RT-PCR试剂盒	TaKaRa，大连宝生物公司
SW-CJ型超净工作台	苏净集团安泰公司
倒置显微镜	Olympus，Japan
CO₂孵箱、酶标仪	Thermo，USA
ZD-85型恒温振荡器，HH-42型三用恒温水浴箱	常州国华电器有限公司

实验动物：取新生24 h内新西兰大白兔乳兔4只，雌雄各半，清洁级，由新乡华兰生物疫苗公司提供，动物合格证号：SCXK(豫)2010-0001。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

原代成骨细胞的提取：取新生24 h乳兔2只，体积分数75%乙醇浸泡消毒5 min，超净台内无菌取出兔颅盖骨，放入含青霉素、链霉素0.01 mol/L PBS的培养皿内，用眼科解剖器械仔细清除骨膜、血管、结缔组织及透明软骨，无菌冷PBS液冲洗颅盖骨3次。

组织块法：将颅盖骨剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的骨块，无菌PBS洗涤1次，然后将碎骨块均匀接种于 25 cm²培养瓶(术前1 h瓶底涂一层胎牛血清，放入孵箱备用)，骨块间距为1.0-2.0 mm，使培养瓶瓶底向上置于培养箱中，培养3 h后待碎骨块牢固贴附时将瓶底翻转向下，小心加入5 mL含体积分数10%胎牛血清成骨细胞培养液(DMEM-LG培养基+10%胎牛血清+L-抗坏血酸50 mg/L+β-甘油磷酸钠10 mmol/L+青霉素100 U/mL+链霉素　　100 mg/L)。

胶原酶消化法：将整片颅盖骨不剪碎加入盛有0.25%胰酶5 mL的离心管中，37 ℃水浴20 min，弃去消化液。然后把颅骨剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的骨片，加入 5 mL 0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃ 恒温振荡消化30 min，弃去消化液，200目滤网过滤，保留滤网上骨残渣。重复用Ⅰ型胶原酶消化3次，30 min/次，每次收集的消化液均加入1 mL胎牛血清终止消化，收集后3次消化液加入5 mL含体积分数10%胎牛血清低糖DMEM培养基，用低温离心机　1 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加入5 mL成骨细胞培养液，接种于25 cm²培养瓶放置于培养箱。

改良胶原酶和胰酶分段消化法：将整片颅盖骨不剪碎加入盛有0.25 %胰酶5mL的离心管中，37 ℃水浴20 min，弃上清液。然后把颅骨剪成约1 mm×1mm×1mm大小的骨片，加入1 mL 0.25%胰酶和4 mL 0.1% Ⅰ型胶原酶^[5]， 37 ℃恒温振荡消化20 min，200目滤网过滤，保留滤网上骨残渣。将含有细胞的滤过液加入5 mL含体积分数10%胎牛血清低糖DMEM培养基终止消化，用低温离心机 1 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加入5 mL成骨细胞培养液，接种于25 cm²培养瓶。将骨残渣加入1 mL 0.25%胰酶和4 mL 0.1%Ⅰ型胶原酶，按上述方法操作重复2次，根据成骨细胞和成纤维细胞贴壁时间不同，首次接种就采取“差速贴壁法”^[18]，使细胞接种于25 cm²培养瓶，放置于培养箱。

成骨细胞的传代培养：每天观察培养基的颜色，看是否有浑浊。镜下观察细胞形态和生长状况，是否铺满瓶底。组织块法：接种后继续培养5-7 d，根据细胞生长情况酌情换液，为避免组织块从瓶底脱落，移动瓶底时要轻缓，以后每3-5 d按细胞生长情况换液，待细胞铺满瓶底时可去除组织块，用胰酶消化离心法收集细胞，按1∶2传代培养。胶原酶消化法及改良胶原酶和胰酶分段消化法：接种48 h后首次半量换液，72 h后首次全量换液，以后每隔两三天换液1次，待细胞铺满瓶底的80%以上，以1∶2传代培养。组织块法和胶原酶消化法使用普通方法传代，改良胶原酶和胰酶分段消化法传代时使用“差速贴壁法”。

细胞形态观察：倒置显微镜下每天观察原代成骨细胞生长情况，传至第3代时进行苏木精-伊红染色，拍照记录。

锥虫蓝排斥实验测定细胞的活力：制备单细胞悬液，稀释至10⁹ L^-¹，细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混和，在3 min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞活力：

MTT测定细胞增殖：取第3代成骨细胞，按1 000个/孔接种于96孔培养板，每组5个复孔，并设空白对照孔。连续培养9 d每天测定各孔在490 nm处的吸光度(A值)，并以A值大小表示成骨细胞的增殖能力。

茜素红钙结节染色：第3代成骨细胞接种于35 mm培养皿，培养至第14天，期间不传代，弃培养液，用PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)染色，37 ℃条件下30 min，蒸馏水冲洗。倒置显微镜下观察矿化结节，拍照记录。

细胞上清液碱性磷酸酶测定：原代成骨细胞连续培养14 d，分别于第1，3，6，9，12，14天收集细胞上清液，离心留取上清，按照碱性磷酸酶测定试剂盒说明书，在96 孔酶标板上分测定孔、标准孔、空白孔，每孔30 μL，测定孔加入细胞上清液，标准孔加入浓度为0.02 g/L酚标准应用液，空白孔加入双蒸水。用酶标仪测定酶标板各孔在520 nm处的A值。结果计算公式如下：

碱性磷酸酶(金氏单位/100 mL)=

ELISA法测定细胞培养上清液中骨钙素：上清液准备同碱性磷酸酶测定，取50 μL上清液按酶免法试剂盒操作步骤，用酶标仪测定酶标板各孔在450 nm处的A值，根据试剂盒中标准品画标准曲线，把每次测定的A值连成曲线，看是否符合标准曲线。

Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学染色：取第3代成骨细胞于预置有盖玻片的6孔板内进行培养，1周后取出盖玻片用0.1 mol/L的PBS轻洗3遍后，用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，按照Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原SABC免疫组织化学染色试剂盒说明，进行免疫组织化学染色，最后DAB显色，显微镜下观察并拍照。

RT-PCR法测定成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素mRNA的表达：取第3代成骨细胞在6孔培养板内培养1周，常规提取总RNA，引物设计参考GenBank数据库Ⅰ型胶原、骨钙素基因序列，委托invitrogen上海公司设计合成Ⅰ型胶原、骨钙素基因和内参GADPH的上下游引物。按RT-PCR试剂盒进行反转录与扩增操作，扩增产物行3%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察电泳条带，凝胶成像分析仪分析mRNA表达情况。

引物序列：
基因	引物序列(5’-3’)	预期PCR产物长度(bp)
骨钙素	F:CCT CAG TCC CCA GCC CAG TCC R:CAG GGA GAG AGA GGA CAG G	310
Ⅰ型胶原	F:CCT GGT AAA GAT GGT GCC AC R:CAC CAG GTT CAC CTT TCG CC	259
GADPH	F:TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA R:TCA TAC CAG GAA ATG AGC TT	177

主要观察指标：比较3种培养方法酶消化时间、提取的细胞密度、锥虫蓝排斥法计数活细胞率、接种后贴壁时间、MTT法测定细胞倍增时间及原代培养第10天细胞上清液中碱性磷酸酶和骨钙素的含量。

统计学分析：实验所获取的数据由第一作者采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量数据以x(_)±s表示，并对实验数据进行检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

实验研究有以下特点：①采用胰酶和胶原酶消化前，颅骨不剪碎使用胰酶37 ℃预消化20 min^[19-21]，优点是颅骨完整避免不必要的细胞损失，消化时间缩短降低了胰酶对成骨细胞的损伤。②采用37 ℃恒温振荡、30 min分阶段胰酶和Ⅰ型胶原酶消化法，既减少了传统酶消化法需要每隔一段时间震荡的繁琐步骤，又避免酶消化时间过长降低细胞的活性，增加了酶消化效率和细胞产出量。③原代培养首次接种即采用“细胞差速贴壁法”^[18]，成纤维细胞在10-30 min可完成附着，将未贴壁的细胞连同培养基转移至新瓶继续培养，可去除杂细胞污染，后续传代时，先使用1 mL胰酶快速消化1次，当少量细胞脱落(主要是成纤维细胞)大量细胞变圆时倾去胰酶和脱落细胞，再次胰酶消化，用含血清的培养基中和后接种至新的培养瓶，这样可以使成骨细胞得到快速纯化。④原代培养采用低糖培养基，可以使成骨细胞保持良好的生长状态。在初始阶段采用高糖培养基对成骨细胞的生长有促进作用，但是长期使用高糖培养基反而会对细胞造成毒性，使细胞逐渐脱落、甚至死亡^[5]。⑤取出颅骨后在含青链霉素的PBS液中剥离骨膜、结缔组织等，在取材间歇用庆大霉素生理盐水于超净台内浸泡手术器械，可以有效的避免细菌污染。成骨细胞的分化过程由细胞增殖、细胞外基质形成及成熟、骨基质矿化3个阶段组成^[22]，在不同分化时期有不同的生物学行为。目前对成骨细胞的鉴定尚无统一标准，被广泛采用的是形态学观察和其分泌的细胞外基质鉴定，如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素及钙化结节等^[23]。
碱性磷酸酶及矿化结节是成骨细胞分化的标记物^[24-25]，碱性磷酸酶是一种具有生物活性的蛋白质,其功能是水解有机磷酸,使局部PO4³^－浓度升高和降解微环境中的钙化抑制剂，结合并转运钙离子，启动钙化程序^[26]。其作为细胞成骨性分化早期的主要标志物，在分化开始时达到峰值并随分化的进行而迅速下调^[27]，因此碱性磷酸酶含量检测主要显示细胞开始成骨性分化的时间。实验中作者发现原代成骨细胞培养第12天上清液中碱性磷酸酶含量达到峰值，并随培养时间延长而下降。由于受检测时间点数量的限制，单纯碱性磷酸酶含量检测不能全面的反映细胞的分化情况。矿化能力是成骨细胞的又一重要生物学特征，本实验中矿化结节出现于原代培养的第14天，而且成骨细胞连续传代后也可形成钙化结节，该实验结果和国内外有关文献报道相一致^[28-29]。成骨细胞是典型的分泌蛋白型细胞，分泌的骨钙素、胰岛素样生长因子1、Ⅰ型胶原、转化生长因子β与成骨分化和骨形成功能密切相关。Ⅰ型胶原从增殖期开始表达，基质合成期达高峰，作为钙盐沉着和细胞附着的支架，约占骨基质有机物的90%。实验中作者对原代培养的成骨细胞进行Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学染色，实验结果发现3种方法提取的原代成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色阳性，Ⅲ型胶原蛋白免疫组化染色阴性，实验结果和预期结果一致，证实了文献中有关骨基质中胶原蛋白约90%都是Ⅰ型胶原蛋白的说法。

骨代谢生化指标中的骨钙素是骨形成的特异性标志物^[30-31]，在成骨细胞表型发育过程中, 骨钙素的表达呈现发育阶段特异性,可作为成骨细胞分化的中期指标。骨钙素是骨组织中丰富的非胶原蛋白，其主要功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常羟磷灰石结晶的形成，抑制软骨的矿化速率、维持骨量平衡，参与骨骼重塑^[32]。当骨形成和骨吸收耦联时，骨钙素是反映骨转换的指标；当骨形成和骨吸收解耦联时，骨钙素是反映骨形成的特异指标。实验中作者采用酶免法测定骨钙素的含量，测定结果与试剂盒标准曲线拟合度很高，说明成骨细胞培养上清液中骨钙素含量随培养时间增加而增加，测定结果符合原代成骨细胞的特点。

本实验以新生24 h之内的新西兰大白兔颅盖骨作为取材来源，采用3种方法即组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶消化法培养原代成骨细胞，并通过细胞形态学观察、成骨细胞分泌的细胞外基质鉴定和实验数据的统计学分析等处理，实验结果证实改良胶原酶与胰酶分段消化法(胰酶预消化后，胰酶和Ⅰ型胶原酶再多次短时的消化分离细胞)提取成骨细胞是一种方便，快速成功率高的提纯法，可作为一种可靠的细胞培养方法。所培养的成骨细胞脱离了活体内环境后仍具有较强的增殖活性和成骨能力，传代培养后的细胞高度保持了成骨细胞的典型特征，因此该实验的研究结论可以为原代成骨细胞的提取提供一种简便实用的方法，为后续骨组织工程种子细胞的研究提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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