吸烟促进牙周炎牙槽骨的吸收效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项研究证实吸烟能够促进牙周炎性牙槽骨吸收。
目的：观察吸烟在牙周炎性牙槽骨吸收大鼠中的作用。
方法：24只大鼠随机分为3组，正常组：正常饲养，不给予其他处理；对照组：采用钢丝结扎法建立大鼠实验性牙周炎动物模型；实验组：在造模期间给予被动吸烟。8 周后将所有大鼠处死，取出牙周组织，利用苏木精-伊红染色观察牙周组织的病理学改变，运用免疫组织化学染色观察核因子活化因子受体配体和骨保护素的表达变化。
结果与结论：对照组和实验组大鼠造模8周后，实验组大鼠牙槽骨中核因子κB受体活化因子配体表达量高于对照组(P < 0.05)，而对照组大鼠牙槽骨中骨保护素的表达量较实验组有明显上调(P < 0.05)。提示吸烟能够提高牙周炎大鼠核因子κB受体活化因子配体的表达，同时并可以降低骨保护素的表达变化，在一定程度上加重了牙周炎性牙槽骨的吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 牙周组织, 吸烟, 核因子κB受体活化因子配体, 骨保护素, 牙周炎性牙槽骨

Abstract:

BACKGROUND: Various studies confirm that smoking can contribute to the resorption of periodontal alveolar bone.
OBJECTIVE: To observe the effect of smoking in alveolar bone resorption of periodontitis rat models.
METHODS: A total of 24 rats were randomly divided into three groups. Normal group: rats were normally fed without any other pre-treatment; Control group: experimental periodontitis model was established using wire ligation method in rats; Experimental group: rat models were given passive smoking during experimental modeling period. All rats were sacrificed after 8 weeks of modeling, periodontal tissue were removed. Hematoxylin-eosin staining was used for examining pathological changes in periodontal tissue, and immunohistochemical analysis was done for observing receptor activator of nuclear factor-κB ligand and osteoprotegrin expression.
RESULTS AND CONCLUSION: After 8 weeks of modeling, expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand factor was significantly higher in alveolar bone of rats from experimental group in comparison to control group (P < 0.05), whereas expression of osteoprotegerin in alveolar bone was significantly greater in rats from control group when compared to experimental group (P < 0.05). This finding suggests that smoking can increase the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand protein and reduce osteoprotegrin expression in periodontal rats, thus increasing the resorption of periodontal alveolar bone.

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Key words: smoking, periodontitis, alveolar bone loss, NF-kappa B, osteoprotegrin

中图分类号:

R318

朱建华，王莹，赵中男，刘继光. 吸烟促进牙周炎牙槽骨的吸收效应[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3172-3177.

Zhu Jian-hua, Wang Ying, Zhao Zhong-nan, Liu Ji-guang. Smoking promotes the resorption of periodontal alveolar bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3172-3177.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入Wistar大鼠数量为24只，进行造模的大鼠造模成功率为100%，1只大鼠死亡，原因为麻药过量，死亡后及时给予补充。共24只大鼠进入结果分析。

2.2 实验动物大体观察结果在造模成功后第6周，正常组大鼠牙周组织未出现明显异常，牙龈形态正常，呈粉红色，质地坚韧，无探诊出血，无牙周袋。对照组大鼠结扎丝处见食物残渣堆积，周围牙龈颜色鲜红，探诊出血，部分大鼠有浅牙周袋形成。实验组大鼠结扎丝处见软垢堆积，结扎处牙龈出现红肿，牙面色素沉着，牙龈质地松软，探诊出血，有牙周袋形成。在第7周时，正常组仍未见明显的牙周袋，对照组及实验组大鼠牙龈炎症均加重，牙周袋深度加深。在第8周时，正常组大鼠牙龈仍正常无炎症表现，而在对照组及实验组大鼠中结扎处牙龈炎症加重明显，探诊极易出血，有深牙周袋形成，且在实验组大鼠中部分牙龈明显退缩，根分叉区域暴露，为十分典型中重度牙周炎的表现。

2.3 探诊深度测定结果 3组大鼠牙周探诊深度的变化结果发现：正常组大鼠在实验过程中均无牙周袋形成，6周时，实验组牙周探诊深度高于对照组和正常组(P < 0.05)，对照组与正常组比较差异无显著性意义(P < 0.05)。8周时，实验组、对照组牙周探诊深度均高于正常组(P < 0.05)，且实验组、对照组牙周探诊深度分别较6周时升高(P < 0.05)，同时，实验组牙周袋深度对照组高(P < 0.05)。见表1。

2.4 苏木精-伊红染色观察在实验开始第8周时，显微镜下观察可见正常组大鼠下颌第1磨牙牙周组织标本，可见其结构正常，结合上皮位于釉牙骨质界处，牙龈纤维排列整齐，牙周膜纤维排列亦正常有序，牙槽骨边缘平整无吸收，牙槽嵴顶存。对照组可见上皮钉突明显伸长，结合上皮向根方增殖，结缔组织内可见较多淋巴细胞浸润，牙槽骨出现吸收，牙槽嵴顶形态不规则。实验组可见，结合上皮继续向根方增殖，结缔组织内可见密集的炎性细胞浸润，骨小梁稀疏，牙槽嵴顶消失，牙槽骨明显吸收(图1)。

2.5 免疫组织化学染色后各组大鼠灰度值的表达变化骨保护素蛋白免疫组织化学染色后显示：骨保护素活化的阳性表达为细胞的胞质、胞膜及核膜都被染色，呈弥漫成片的黄色或棕黄色颗粒状。在3组大鼠的牙周组织中均可见到骨保护素蛋白的表达。建模后8周各组大鼠平均灰度值比较：实验组灰度值高于对照组(P < 0.05)。且对照组高于假手术组(P < 0.05，表2，图2)。

核因子κB受体活化因子配体蛋白免疫组织化学染色后显示：与骨保护素相比，各组大鼠均有核因子κB受体活化因子配体表达，且表达部位和骨保护素相似，主要位于骨小梁周围细胞的胞核，呈棕黄色，骨细胞胞质和胞膜中

亦可见表达。在各组间大鼠平均灰度值比较：实验组灰度值低于对照组(P < 0.05)，且对照组低于假手术组(P < 0.05，表2，图3)。

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引言

吸烟是引起牙周疾病的重要危险因素^[1]。吸烟可导致体内体液免疫和细胞免疫系统发生变化，引起机体外周血中分叶核白细胞的吞噬作用下降，从而降低牙周组织对致病菌的防御能力和组织修复能力。吸烟吸进烟雾尘粒和各种有毒的物质已经被证实是影响全身健康的危险因素，烟草中含有尼古丁等多种有害物质，烟草燃烧的烟雾中许多化学成分可直接危害人体各组织脏器或在血循环中发挥作用。

牙周炎是一种慢性感染性疾病，以牙槽骨吸收为主要特征，表现为牙周组织的周围炎症，引起牙周组织破坏^[2]。牙周病的病因复杂，除了常见的菌斑牙石等局部刺激外，还受到一些其他因素的影响，其中吸烟可加重牙周炎的临床症状。牙槽骨是牙周组织的主要支持结构，其代谢与骨十分相似，而牙槽骨吸收可导致牙齿的松动和脱落，这是目前牙齿缺失在临床上主要因素之一，同时牙周疾病最主要的病理特征也是牙槽骨的吸收。牙周炎性牙槽骨吸收是牙周致病菌感染导致的炎症性损伤性疾病，是机体抗菌斑微生物及其代谢产物的炎症反应^[3]。吸烟是加重牙周炎的重要因素之一，吸烟能够对牙周炎的发生发展起到促进作用，从而对牙周炎的治疗效果及预后起到影响^[4]。

菌斑是牙周炎的始发因素，而在临床的研究发现，吸烟者较非吸烟者的口腔卫生差，菌斑的大量堆积，色素明显沉积，导致牙石的大量生成，引发牙龈的一系列炎症。而相关的资料也证实在吸烟者较非吸烟者的需氧菌、厌氧菌和牙菌斑的比例明显升高^[5]。吸烟可对牙龈的成纤维细胞造成损伤，对其合成、分泌胶原及增殖功能起到抑制作用，导致牙周附着的大量丧失，从而影响组织的修复功能，阻碍牙周组织的再附着，加重牙周组织病变，影响治疗效果^[6-7]。通过细胞实验研究表明，烟草中的尼古丁具有多重毒性^[8]，可影响人牙龈和牙周膜成纤维细胞的增殖贴附。

大鼠长期处于烟草烟雾中，可明显降低大鼠牙槽骨矿化组织的比例^[9]，但具体机制尚不明确。而细胞因子对牙周组织的改建过程起到重要作用，其中近期发现的核因子 κB受体活化因子配体和骨保护素对骨吸收尤为重要。近些年来许多学者在研究被动吸烟影响健康方面，大多集致力于全身性疾病，对于被动吸烟影响牙周组织的动物实验报道较少。

基于上述所述，实验通过建立大鼠被动吸烟模型，对牙周组织进行苏木精-伊红染色观察，利用免疫组织化学染色观察骨保护素蛋白和核因子κB受体活化因子配体蛋白的表达变化来探讨吸烟促进牙周炎性牙槽骨吸收的机制，为防治牙周病提供实验依据和倡导戒烟运动。

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材料方法

设计：完全随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年4至12月在佳木斯大学动物中心实验室完成。

材料：

实验动物：8周龄SPF级健康Wistar雄性大鼠24只，体质量180-220 g，由佳木斯大学动物中心提供，大鼠在适应性喂养1周后进行实验。

吸烟对牙槽骨中核因子κB受体活化因子配体影响实验试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
核因子κB受体活化因子配体抗体、骨保护素抗体、DAB试剂盒	武汉博士德生物工程公司
香烟	青岛卷烟厂
石蜡切片机	德国 LEICA 公司
电热恒温水温箱	上海医疗器械七厂
显微镜	日本奥林巴斯

实验方法：

实验动物分组：24只大鼠被随机分为3组，每组8只。正常组：正常喂养，不给予任何干预；对照组：以不锈钢正畸结扎丝(直径0.2 mm)结扎大鼠下颌第1磨牙牙颈部；实验组：以不锈钢正畸结扎丝结扎下颌第1磨牙牙颈部，每天放入自制有机玻璃被动吸烟箱内被动吸烟2次，每次点燃9支，每次持续1 h。

模型建立：健康Wistar大鼠适应性喂养1周后，将实验组和对照组大鼠在体积分数10%水合氯醛溶液，按 3 mL/kg腹腔注射，等待麻醉满意后，采用不锈钢正畸结扎丝(直径为0.2 mm)结扎大鼠下颌第1磨牙牙颈部，用持针器在腭侧结扎固定，置于龈下，并保证结扎丝不脱落。上述处置完成后大鼠全部苏醒，从实验当天起即喂食常规鼠料和糖水。

建模后每周检查牙周结扎情况，如有钢丝松动或脱落及时处理，并观察牙周组织的表现，如有无牙龈红肿、出血、肿胀、溃疡、溢脓等。实验组大鼠置于自制有机玻璃被动吸烟箱内，至香烟燃烧完全后，持续约15 min，间隔10 min后，再点燃3支香烟。共自然燃烧9支香烟后，取出大鼠，清洗玻璃舱。吸烟2 次/d，1 h/次，每次点燃9支香烟(哈德门牌香烟：含焦油15 mg、烟碱1.2 mg、一氧化碳15 mg)。大鼠随呼吸形成被动吸烟。对照组大鼠除每天不进行被动吸烟外结扎大鼠一侧下颌第1磨牙状况与实验组一样；正常组大鼠不给予结扎大鼠一侧下颌第1磨牙和烟熏处理，其他饲养条件与实验组、对照组等同。

探诊深度测定：取25号牙胶尖插入下颌第1磨牙的颊侧近中、远中和中央3个位点，利用游标卡尺对牙胶尖在牙周袋内的长度进行测量，取测量的平均值做为该牙的探诊深度。

标本制备：各组大鼠到达指定存活时间后，用体积分数10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg腹腔注射，在麻醉情况下打开胸腔，从心脏左心室心尖处插管，同时剪开右心耳，先灌注约200 mL的生理盐水快速冲洗，再用40 g/L的多聚甲醛约300 mL灌注固定。灌注完毕后，取出下颌第1磨牙区组织，多聚甲醛固定48 h，乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙8周。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。制作牙体牙周组织连续切片，片厚5 μm。常规行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。

免疫组织化学染色检测核因子κB受体活化因子配体和骨保护素蛋白：①每张石蜡切片常规脱蜡至水，PBS振荡洗5 min×3次。②切片经体积分数3%过氧化氢室温10 min孵育处理，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水震荡洗5 min×2次，PBS浸泡3 min。③热抗原修复10 min，室温孵育40 min。④体积分数10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，甩去多余液体，滴加第一抗体，湿盒 4 ℃孵育过夜。⑤次日取出湿盒，恢复室温，PBS振荡洗3次，5 min/次。⑥滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min。⑦去除二抗，PBS振荡洗3次，5 min/次。⑧滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液，室温孵育20 min。⑨PBS振荡洗3次，5 min/次。⑩DAB室温显色，显微镜下控制反应时间，至显色满意后，蒸馏水洗涤。?苏木精轻度复染。?梯度乙醇、二甲苯脱水透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗，作为阴性对照。

免疫组织化学染色结果的判定：所有切片置于 LEICA 光学显微镜下观察染色情况，核因子κB受体活化因子配体或骨保护素的阳性表达部位由于反应沉积物而呈黄色或棕黄色颗粒染色。每个下颌第1磨牙的骨组织平均取5个视野，经Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，进行数码拍照后存于计算机中，经编辑处理，自动计算测量得出平均灰度值。各张切片所检测得5个视野的灰度值均值为该张切片的值，用平均灰度值来表示蛋白的表达水平。

主要观察指标：观察各组大鼠牙周探诊深度、苏木精-伊红染色后牙周组织病理学变化及免疫组织化学染色后灰度值的变化情况。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 17.0软件数据包对所有实验所得数据完成统计处理，组间差异采用独立样本t 检验，P < 0.05表示为差异有显著性意义，检测结果数据用x(_)±s表示。

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讨论

徐莉等^[10]研究表明当吸烟达到一定量时，吸烟牙周炎患者与非吸烟患者相比，吸烟牙周炎患者发生牙槽骨吸收的牙齿数目较非吸烟患者明显增多。实验8周时牙周探诊过程中，实验组牙周袋深度较对照组深，并且正常组无明显牙周袋生成，说明单纯吸烟能够加重牙周炎症。

随着牙周炎性牙槽骨吸收相关研究的深入，吸烟对于牙周炎患者的影响越来越受到人们的关注。牙周炎疾病发生后会导致某些化学物质的释放、微血管通透性的增加和血管组织的水肿，这在牙周炎疾病的病理生理变化中起着重要作用。这种病理生理过程的变化必然会使牙周炎疾病后牙周组织内本身成分的改变。这其中就包括骨保护素蛋白和核因子κB受体活化因子配体蛋白。自20世纪90年代，发现骨保护素、核因子κB受体活化因子配体以来^[11-12]，它们对破骨细胞的作用一直受大家关注。

骨保护素蛋白作为肿瘤坏死因子受体家族的重要成员之一，由401个氨基酸残基组成，是一种分泌型糖蛋白，是骨转换过程中重要的细胞因子。对破骨细胞分化和活性具有抑制作用的生理功能^[13-15]。它广泛存在于各种组织和细胞系，在骨骼、脊髓、心脏和肺中表达较多。骨保护素对骨吸收有抑制作用的观点已被广泛认可^[16]。

很多学者研究了细胞因子和微量元素等对骨保护素对骨吸收的抑制的调节，吸烟可导致大鼠牙槽骨中骨保护素蛋白下降，促进破骨细胞生成，破坏骨代谢平衡，使骨吸收活动增强，最终使骨组织病理形态股吸收型方向发展。在本实验中，免疫组织化学染色病理变化发现，3组大鼠的牙槽骨中，骨保护素蛋白主要在骨小梁附近的成骨细胞中表达，其中实验组和对照组比较，骨保护素蛋白表达减低，存在统计学差异。这可能是由于低表达骨保护素蛋白促进破骨细胞的分化，促进成熟破骨细胞的激活，阻碍成熟破骨细胞的凋亡，从而促进了牙周炎性牙槽骨吸收。

核因子κB受体活化因子配体蛋白是肿瘤坏死因子配体家族成员，为成骨细胞分泌的膜蛋白。骨保护素蛋白是核因子κB受体活化因子配体的天然受体，属于一种可溶性蛋白，位于成骨细胞谱系细胞表面的核因子κB受体活化因子配体能够使破骨细胞受体间的信号传导增强。核因子κB受体活化因子配体蛋白不仅可以刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞，还可以使成熟破骨细胞的活性增强，并抑制破骨细胞的凋亡^[17]。表达在成骨细胞胞膜上的核因子κB受体活化因子配体特异性的识别破骨细胞前体，并与其膜上的受体核因子κB受体活化因子结合，把信号传导至核因子κB，或者活化C-JUN末端激酶，调节基因表达，激活成熟的破骨细胞从而发挥骨吸收功能^[11]。核因子κB受体活化因子配体mRNA是由成骨细胞和骨髓基质细胞分泌，在骨组织中主要表达于成骨细胞系细胞，骨髓基质细胞，骨保护素蛋白能竞争性地与核因子κB受体活化因子配体结合，阻断破骨细胞受体间的信号传导，从而抑制破骨细胞的形成和活化^[16]。

刘棋等^[18]研究发现慢性牙周炎牙槽骨吸收处肉芽组织中有核因子κB受体活化因子配体较高的蛋白表达。本实验免疫组织化学染色病理变化发现，各组大鼠中核因子κB受体活化因子配体蛋白均有表达，实验组较对照组明显增高，且存在统计学差异。这可能是由于核因子κB受体活化因子配体表达增加，使得破骨细胞形成增加，导致牙周炎性牙槽骨吸收增加。本实验结果说明被动吸烟增加大鼠牙周组织炎性细胞浸润，加重牙周组织炎症程度。以往研究表明吸烟加重牙周组织炎症^[19]，本实验结果与其一致。

对于牙周炎性牙槽骨吸收的实验研究来讲，实验动物的正确选择是一个重要内容，它对实验结果的判断有着很大的影响。目前对于实验动物的选择对象通常有大鼠、小鼠和兔子等。大鼠的骨骼解剖结构及骨代谢与人类有许多相近之处，又由于体积较小、价格便宜且操作方便，故通常被人们作为骨代谢的研究对象^[20]，也最为方便及客观。大鼠是目前较为常见的建立牙周疾病动物模型的动物，本实验成功地建立了吸烟导致大鼠牙周炎性牙槽骨吸收的动物模型。能准确地反映牙周炎性牙槽骨吸收的情况。

综上所述，吸烟可以加重牙周炎性大鼠牙槽骨的吸收，机制之一可能与吸烟使牙周组织中核因子κB受体活化因子配体的表达上调及骨保护素的表达下调有关^[21-26]。但牙周炎性牙槽骨吸收的过程非常复杂，是多种因素共同参与的结果，牙周组织中核因子κB受体活化因子配体和骨保护素蛋白的表达变化是否是吸烟影响牙周炎性牙槽骨吸收的主要作用机制还有待进一步研究。

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