组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3165-3171.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.010

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组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实

李春根¹，曲弋¹，叶超¹，陈婧²，王逢贤¹，李鹏洋¹，李素华¹，任敬佩¹，亓建¹

北京中医药大学东直门医院，1骨科，2脑病科，北京市 100700

收稿日期:2014-03-10 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 李春根，博士，主任医师，博士生导师，北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700
作者简介:李春根，男，1965年生，吉林省长春市人，朝鲜族，2008年北京中医药大学毕业，博士，主任医师，主要从事脊柱外科、关节软骨再生研究。
基金资助:
北京中医药大学中青年教师资助项目(JYBZZ-JS060)

Histology research on repairing of rabbit articular cartilage defects with naringin and tissue engineering cartilage

Li Chun-gen¹, Qu Yi¹, Ye Chao¹, Chen Jing², Wang Feng-xian¹, Li Peng-yang¹, Li Su-hua¹, Ren Jing-pei¹, Qi Jian¹

1Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2Department of Neurology, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China

Received:2014-03-10 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Li Chun-gen, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Li Chun-gen, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
Fund for Young Teachers by Beijing University of Chinese Medicine, No. JYBZZ-JS060

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床上虽有多种方法用于治疗软骨缺损，但没有从根本上解决关节软骨缺损修复问题。
目的：通过组织学研究进一步评价柚皮苷结合组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的效果。
方法：取兔骨髓间充质干细胞体外增殖后，复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上，制成组织工程软骨，植入到兔膝关节软骨缺损，并以柚皮苷汤灌胃，于 4，8周后分别对修复组织进行苏木精-伊红、Masson三色染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色、Ⅹ型胶原染色等组织学检查。
结果与结论：术后8周, 柚皮苷结合干细胞复合体组缺损处修复组织变成乳白色，半透明光滑组织，缺损修复组织与周围正常软骨已基本难区分，表面光滑。组织学检查发现修复缺损处基本为新生软骨填充。结果证实，柚皮苷结合组织工程软骨能提高家兔膝关节软骨缺损的修复质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 软骨缺损, 骨髓间充质干细胞, 脱细胞真皮基质, 组织工程软骨, 柚皮苷, 兔

Abstract:

BACKGROUND: At present, there are many methods to treat cartilage defects, but none radically repairs the articular cartilage defects.
OBJECTIVE: To histologically verify the effect of naringin combined with tissue engineering cartilage on the repair of rabbit articular cartilage defects.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells following in vitro proliferation were compounded onto acellular dermal matrix, which was then implanted into rabbit knee cartilage defects. Naringin was also given by lavage. Hematoxylin-eosin staining, Masson trichrome staining, toluidine blue dyeing, type II collagen staining and type X collagen staining were performed in the repaired tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: After 8 weeks post-surgery, the defects repaired with the naringin and stem cells composite were turned into milky-white and transparent smooth tissue. The defective tissue which was repaired, was very similar to normal cartilage tissue, with smooth surface. After the histology research, we found that the defect tissue was filled with new cartilage tissue. Results indicated that naringin combined with tissue engineering cartilage can promote the repair of articular cartilage defects in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, dermis, tissue engineering, cartilage, articular, polypodiaceae

中图分类号:

R318

李春根，曲弋，叶超，陈婧，王逢贤，李鹏洋，李素华，任敬佩，亓建. 组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3165-3171.

Li Chun-gen, Qu Yi, Ye Chao, Chen Jing, Wang Feng-xian, Li Peng-yang, Li Su-hua, Ren Jing-pei, Qi Jian. Histology research on repairing of rabbit articular cartilage defects with naringin and tissue engineering cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3165-3171.

图/表（结果） 3

2.1 动物数量实验选用新西兰兔25只，分为5组，无脱失，进入结果分析25只。

2.2 培养骨髓间充质干细胞形态学观察经全髓贴壁法筛选及纯化细胞，传代3次后可见细胞形成集落状，形态比较单一，基本上呈梭形或多角形；2 d后可铺满瓶底，形成单层结构，排列呈有规律的方向性(图2)。

2.3 关节缺损处修复组织的形态学观察

2.3.1 大体形态

空白组：术后4周缺损处未见肉芽组织填充，缺损面积较大，缺损处与周围软骨组织界限清楚。术后8周，缺损处出现肉芽组织填充，缺损面积不变，深度变浅，与周围软骨组织边界仍较清楚。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：术后4周缺损处可见少量肉芽组织填充，缺损处面积较大，与周围软骨组织界限清楚。术后8周，缺损处可见肉芽组织填充为半透明组织，缺损面积变小，深度变浅，与周围软骨组织边界变模糊，但仍可分辨。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：术后4周缺损处可见有半透明纤维样组织填充，缺损处面积不变，深度变浅，与周围正常软骨组织界限清楚，表面不光滑。术后8周，缺损处组织变为半透明状不光滑组织，缺损处面积变小，深度变浅，边界渐模糊，与周围软骨组织难以分辨。

单纯干细胞复合体组：术后4周缺损处有白色纤维样组织填充，缺损处面积较前变小，深度变浅，与周围正常软骨组织界限稍有模糊，表面不光滑。术后8周，缺损处组织为半透明状不光滑组织，缺损处面积较前继续变小，深度较前变浅，边界较前模糊，表面较前明显光滑。

柚皮苷结合干细胞复合体组：术后4周缺损处由白色、半透明类软骨样组织填充，缺损面积变小，深度变浅，与周围软骨组织界限清楚，表面较光滑。术后8周，缺损处修复组织变成乳白色，半透明光滑组织，缺损修复组织与周围正常软骨组织已基本难区分，表面光滑。

2.3.2 苏木精-伊红染色实验发现术后8周的效果比较好，所以只进行术后8周的论述。

空白组：示关节软骨表面不平，部分区分层不清晰，结构不规则，潮线破坏，有血管穿过，可见软骨细胞增生及明显纤维束状改变，有龟裂、虫蚀样变，个别边缘明显骨赘形成(图3A)。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：示关节软骨表面不平，潮线尚完整，部分区见明显纤维束状改变，软骨层变薄，部分软骨细胞缺失(图3B)。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，局灶可见软骨细胞增生明显，边缘见明显骨赘形成(图3C)。

单纯干细胞复合体组：示关节软骨表面表面大部分区域平滑，潮线尚完整，部分区见纤维组织增生，软骨层变薄(图3D)。

柚皮苷结合干细胞复合体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，可见软骨细胞显著增生及纤维束状改变(图3E)。

2.3.3 Masson三色染色实验发现术后8周的效果比较好，所以只进行术后8周的论述。

空白组：示关节软骨表面不平，见潮线中断缺损，增生的纤维束及软骨细胞见散在极浅淡着色，边缘骨赘及增生的软骨细胞增生(图4A)。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：示关节软骨表面不平，潮线尚完整，变薄区增生的纤维组织着色极浅淡(图4B)。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，边缘骨赘可见浅淡蓝色着色，染色尚均匀(图4C)。

单纯干细胞复合体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，边缘区可见少量增生的纤维组织染色(图4D)。

柚皮苷结合干细胞复合体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，变薄区增生的纤维组织见散在极浅淡着色(图4E)。

2.3.4 甲苯胺蓝染色实验发现术后8周的效果比较好，所以只进行术后8周的论述。

空白组：示关节软骨表面不平，增生的骨赘及软骨细胞可见蓝紫色着色，染色尚均匀(图5A)。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：示关节软骨表面不平，潮线尚完整，变薄区增生的纤维组织几乎不着色，增生的软骨淡蓝紫色着色(图5B)。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，边缘骨赘可见蓝紫色着色，染色尚均匀(图5C)。

单纯干细胞复合体组：关节软骨表面大部分区域平滑，小灶增生的软骨细胞淡蓝紫色着色(图5D)。

柚皮苷结合干细胞复合体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，变薄区增生的纤维组织不着色(图5E)。

2.3.5 Ⅱ型胶原染色法实验发现术后8周的效果比较好，所以只进行术后8周的论述。

空白组：示关节软骨表面不平，潮线中断，增生的骨赘及软骨细胞可见棕黄色着色，染色尚均匀(图6A)。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：示关节软骨表面不平，潮线尚完整，增生的软骨可见棕黄色着色，染色尚均匀，变薄区增生的纤维组织不着色(图6B)。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，边缘骨赘可见棕黄色着色，染色尚均匀，潮线尚完整(图6C)。

单纯干细胞复合体组：关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，病变区域未见着色(图6D)。

柚皮苷结合干细胞复合体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，增生的纤维组织可见散在淡棕黄色着色(图6E)。

2.3.6 Ⅹ型胶原染色法实验发现术后8周的效果比较好，所以只进行术后8周的论述。

空白组：示关节软骨表面不平，潮线中断，增生的骨赘及软骨细胞可见增生的深棕黄色着色(图7A)。

柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：示关节软骨表面不平，潮线尚完整，增生的软骨可见棕黄色着色，变薄区增生的纤维组织见棕黄色着色(图7B)。

柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：示关节软骨表面大部分区域平滑，边缘增生的软骨骨赘可见棕黄色着色(图7C)。

单纯干细胞复合体组：关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，增生的纤维组织可见淡棕黄色着色(图7D)。

柚皮苷结合干细胞复合体组：关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，增生的软骨骨赘可见深棕黄色着色，增生的软骨及纤维组织可见深棕黄色着色(图7E)。

参考文献

[1] 杨渊,李小峰,罗道明,等.柚皮甙诱导骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死[J].中国组织工程研究,2012,16(49):9232-9235.
[2] 刘伟,赵劲民,苏伟,等.柚皮苷对兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响[J].江苏医药,2011,37(14):1632-1636.
[3] Leo AJ, Grande DA.Mesenchymal stem cells in tissue engineering.Cells Tissues Organs. 2006;183(3):112-122.
[4] Meirelles Lda S, Fontes AM, Covas DT,et al.Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells.Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6):419-427.
[5] de Peppo GM, Sjovall P, Lennerås M,et al.Osteogenic potential of human mesenchymal stem cells and human embryonic stem cell-derived mesodermal progenitors: a tissue engineering perspective.Tissue Eng Part A. 2010; 16(11):3413-3426.
[6] Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI,et al.Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.J Cell Biochem. 1997;64(2): 295-312.
[7] 俞猛,于方,付胜良.兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(27): 4951-4954.
[8] 庾佳佳,汪新柱,赵琳,等.兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导[J].中国组织工程研究,2013,17(6):974-979.
[9] Harvanová D, Tóthová T, Sarišský M,et al.Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells.Folia Biol (Praha). 2011;57(3):119-124.
[10] Temenoff JS, Mikos AG.Review: tissue engineering for regeneration of articular cartilage.Biomaterials. 2000;21(5): 431-440.
[11] Mahmoudifar N, Doran PM.Chondrogenesis and cartilage tissue engineering: the longer road to technology development.Trends Biotechnol. 2012;30(3):166-176.
[12] 李运涛,程科,胡德志,等.柚皮苷对经TNF-α诱导体外培养兔关节软骨细胞增殖及SOD NOS影响[J].辽宁中医药大学学报, 2008, 10(5):175-177.
[13] 金连峰,韩煜.骨碎补对兔膝骨关节炎关节软骨细胞凋亡相关因子作用实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2013,15(11):42-46.
[14] 邓展生,张璇,邹冬青,等.骨碎补有效成分柚皮甙对人骨髓间充质干细胞的影响[J].湘南学院学报:自然科学版,2005,7(4):5-7.
[15] 高晓珺,解骏,肖涟波,等.骨碎补总黄酮对胶原诱导大鼠类风湿关节炎骨破坏治疗作用的实验研究[J].实用临床医药杂志,2013, 17(5):13-17.
[16] 高华利,肖涟波,张子峰,等. 骨碎补总黄酮对胶原诱导性关节炎大鼠关节骨破坏影响的实验研究[J].中国骨伤,2013,26(9): 764-767.
[17] 杨渊,李小峰,罗道明,等.柚皮甙诱导骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究,2012,16(49):9232-9235.
[18] 郝增涛,冯卫,郝廷,等. BMSCs 来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究[J]. 中国修复重建外科杂志,2012,26(4):489-494.
[19] 詹兴旺,韦曙东,姜艳,等. 胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(38):7090-7094.
[20] 初殿伟,王玮,陈立军,等.兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(42):8248-8252.
[21] 韩爽,卢世璧,刘强,等.自体脂肪间充质干细胞复合人脐带 Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损[J].中国组织工程研究, 2012,16(19):3496-3501.
[22] 韦益毅.不同生物材料复合支架对关节软骨缺损的修复评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(25):4723-4725.
[23] 张文林,刘丹平.软骨组织工程载体材料的研究与进展.中国组织工程研究与临床康复,2009,13(12):2329-2332.
[24] Qing C, Wei-ding C, Wei-min F.Co-culture of chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells in vitro enhances the expression of cartilaginous extracellular matrix components.Braz J Med Biol Res. 2011;44(4):303-310.
[25] Hildner F, Concaro S, Peterbauer A,et al.Human adipose-derived stem cells contribute to chondrogenesis in coculture with human articular chondrocytes.Tissue Eng Part A. 2009;15(12):3961-3969.

引言

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年6月在北京中医药大学东直门医院细胞与生化实验室(国家中医药管理局三级实验室)、中国中医科学院中医基础理论研究所动物房、中国中医科学院望京医院病理科完成。

材料：

实验动物：3月龄健康新西兰兔25只，雌雄不拘，体质量2.5 kg左右；2周龄健康新西兰兔1只，体质量1.15 kg。均购自北京市昌扬西山养殖场，合格证号：SCXL(京) 2011-0010。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》及2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

脱细胞真皮基质载体：由北京积水潭医院骨库提供。

柚皮苷汤：以柚皮苷10 g加去离子水100 mL配得。

柚皮苷结合组织工程软骨移植治疗关节软骨缺损实验所需主要试剂：
药物、试剂	来源
柚皮苷	西安开来生物工程有限公司
胎牛血清	GIBCO
青链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM(Low Glucose)、磷酸盐缓冲液(PBS)	Solarbio
马松染色试剂、甲苯胺蓝染色试剂、Ⅱ型胶原染色试剂、Ⅹ型胶原染色试剂	望京医院病理科

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的提取、分离：取新西兰兔1只，给予30 g/L戊巴比妥钠麻醉后，双侧髂后上棘备皮，常规铺单，在无菌操作下以16号骨髓穿刺针刺入兔髂后上嵴，用预抗凝的5 mL注射器(内装100 U/L肝素溶液3 mL，生理盐水3 mL)抽取骨髓，每侧抽取4 mL，打入2个无菌离心管中，吹打成细胞悬液，经L-DMEM 1∶5稀释(各注入 20 mL)。将骨髓-DMEM混合液以半径10 cm，1 500 r/min离心5 min。在超净工作台内弃漂浮的脂肪团块，加入DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)20 mL重悬。将两个离心管合为一管，吹打混匀。将离心管内物质接种于培养瓶中置于37 ℃、体积分数5%CO₂的孵育箱中。48 h后换液。采用全髓贴壁法进行分离纯化。以后每3 d予PBS漂洗并更换培养基，直至细胞生长至80%融合，进行传代。

干细胞复合体制备过程：用角膜环钻将脱细胞真皮基质载体制作成为直径5 mm的圆形，低温等离子体消毒后将脱细胞真皮基质放入自制的支架上，然后将支架分别放入 6孔板中，加入0.5 mL DMEM培养液(含体积分数为20%胎牛血清)浸润。将消化好的第3代细胞种植在浸润的脱细胞真皮基质支架上(每块脱细胞真皮基质种植1瓶细胞，细胞浓度约为1×10¹² L^-1)。每30 min使用移液器加入一次0.5 mL DMEM培养液(含体积分数为20%胎牛血清)，共进行12次，以期细胞能完全在脱细胞真皮基质上贴壁。最后加入5 mL DMEM培养液(含体积分数为20%胎牛血清)浸没脱细胞真皮基质，之后每2 d换液1次。

动物模型制备：根据Hulth法制作关节软骨缺损动物模型，25%乌拉坦溶液4 mL/kg进行耳缘静脉麻醉。双膝备皮消毒，无菌条件下逐层切开，应用角膜环钻在股骨髁滑车关节面钻孔(直径5 mm、深3 mm)，达软骨下骨。

实验动物分组及干预：将25只新西兰兔50侧后膝关节随机分为5组：①空白组：缺损不作任何处理，每天柚皮苷汤灌胃(10 mL/只)。②柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组：缺损处植入骨髓间充质干细胞，每天柚皮苷汤灌胃(10 mL/只)。③柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组：缺损处植入脱细胞真皮基质载体，每天柚皮苷汤灌胃(10 mL/只)。④单纯干细胞复合体组：缺损处植入干细胞复合体。⑤柚皮苷结合干细胞复合体组：缺损处植入干细胞复合体，每天柚皮苷汤灌胃(10 mL/只)。缺损处按实验方案相应填充。完成后将髌骨复位，逐层缝合膝关节囊和皮肤。术后青霉素10×10⁴ U肌肉注射3 d，不固定术肢，自由活动(图1)。

取材：各组分别于术后4，8周处死取材，截取兔完整双膝关节，EDTA缓慢脱钙4周，每周更换脱钙液2次。脱钙满意后，截取修复部位关节软骨，修成4 mm左右厚度薄片，体积分数为4%新配甲醛固定2 d后进行常规固定、石蜡包埋、切片，进行组织学观察。

主要观察指标：苏木精-伊红染色用来观察软骨细胞形态变化。Masson三色染色法可见Ⅱ型胶原呈绿色反应，Ⅰ型胶原呈红色反应，在新生骨走向成熟及软骨钙化成骨过程中有胶原类型的逐渐转变，由此可以见到红-绿相间现象。甲苯胺蓝染色用来观察酸性黏多糖分泌情况，间接评价软骨基质情况。Ⅱ型胶原染色法与Ⅹ型胶原染色法均为免疫组织化学染色，软骨细胞的细胞外基质主要是Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，还包括X型胶原，通过特异性染色观察关节软骨的新生及修复情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

随着社会老龄化的到来，以关节软骨退变为主要表现的膝关节骨关节炎的发病率日益增加，具有发病率高、症状迁延难愈、病情反复发作的特点。由于膝关节软骨的特点，不具备自身修复的能力，因此研究延缓关节软骨的退变过程及促进其再生的方法是很有现实意义的。

骨髓间充质干细胞具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新。德国病理学家在动物损伤肢体远端部位发现某些细胞来自骨髓，最早提出骨髓具有造血以外的功能^[3]，其具有很强的自我更新和高度增殖能力，并且在不同的诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪组织和肌肉等间质组织^[4]，且取材方便，体外分离培养较容易^[5]。Jaiswal等^[6]证实，成人骨髓间充质干细胞在适宜条件能通过分化形成多种中胚层组织，如骨和软骨。俞猛等^[7]发现可从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞，经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原的表达阳性。

由此可见骨髓间充质干细胞可作为软骨组织工程领域较理想的种子细胞，并受到了广泛研究。因此实验选用兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞。如庾佳佳等^[8]构建兔骨髓间充质干细胞分离培养体系，发现骨髓间充质干细胞可定向转化为成骨细胞，而且研究发现这种分化增殖能力在幼年动物来源的骨髓中更为明显^[9]，所以采用2周龄的新西兰兔进行骨髓间充质干细胞的取材。

仅有种子细胞是远远不够的，为了使种子细胞能够在目标缺损处培养生长，下一步的核心是建立由细胞和支架材料构成的三维空间复合体，即组织工程软骨。实验应用小牛脱细胞真皮基质作为载体，为种子细胞提供生长代谢的场所，同时也为其形成新的具有形态和功能的组织提供基础^[10]。

本研究选用实验动物为3月龄健康新西兰兔，雌雄不限，体质量约2.5 kg。采用Hulth法制备关节软骨缺损动物模型，施术人员均经过正规培训，保证了实验动物手术和观察的准确性。

大体形态观察：各组术后8周的形态均好于术后4周，说明修复时间的延长对于修复程度有着正向的影响。从修复效果来看，各组均有关节软骨修复。但空白组的修复效果最差，柚皮苷结合干细胞复合体组的修复效果最好，单纯干细胞复合体组的修复效果次之，柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组和柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组均有修复，但未见明显差别。

苏木精-伊红染色和Masson三色染色：这两种染色方法均是常用的基础染色法，应用广泛，但特异性稍差。通过染色处理后，苏木精-伊红染色法胶原纤维呈不同程度的红色，而Masson三色染色胶原纤维和软骨成分多染为蓝色。分析数据可得，空白组很少见到增生的关节软骨，而柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组、柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组和单纯干细胞复合体组均可发现较多增生的软骨细胞，且新生软骨细胞与周围组织的融合较好，柚皮苷结合干细胞复合体组的修复效果最佳，新生的软骨细胞与周围软骨融合性好，软骨表面区域光滑。

甲苯胺蓝染色：该染色方法可以显示软骨细胞的特异性分泌产物酸性糖胺多糖，染色后显示软骨细胞周围异染性，应用较广泛，有一定的特异性。通过观察可知，空白组很少见到软骨增生，且修复不佳，软骨表面不平。柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组和柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组均可见增生的软骨细胞，而且修复效果较好，单纯干细胞复合体组可见小灶增生的软骨细胞，修复效果很好，柚皮苷结合干细胞复合体组修复后关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，修复效果较满意。

Ⅱ型胶原染色法和Ⅹ型胶原染色法：Ⅱ型和Ⅹ型胶原是软骨细胞的特征性分泌产物^[11]，用Ⅱ型或Ⅹ型胶原的抗体作免疫细胞化学染色，根据显色结果，可以判断培养细胞是否具有或保持着软骨细胞的生物学特征，有很好的特异性，对于软骨的识别较好，是检测软骨常用的特异性诊断。通过观察发现，柚皮苷结合干细胞复合体组修复后，可见到增生的软骨细胞，关节软骨表面大部分区域平滑，潮线尚完整，说明其与周围的正常软骨细胞融合较好，单纯干细胞复合体组潮线尚完整，增生的纤维组织可见淡棕黄色着色，修复效果较前稍差。而空白组软骨表面不平，潮线中断，修复效果较差。柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组和柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组修复情况介于两者之间。

膝骨性关节炎属于中医骨伤科学中骨病的范畴，其发病与肝肾的关系十分密切，《素问•五藏生成》说：“肝之合筋，其荣爪也。”说明肝主筋，主关节运动，筋需要依赖肝血的滋养。《素问•宣明五气》说：“肾主骨。”《素问•六节藏象论》说：“肾者……其充在骨。”都说明肾主骨生髓，骨是支持人体的支架。由以上条文不难看出，本病的病机关键为肝肾亏损，而柚皮苷是中药骨碎补的主要有效成分，骨碎补可补益肝肾，正是切合了膝骨性关节炎病机的关键。大量研究表明，柚皮苷对关节软骨缺损的修复有明显的促进作用。如李运涛等^[12]研究发现柚皮苷萃取物能体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。金连峰等^[13]通过实验研究发现骨碎补能抑制软骨细胞凋亡。邓展生等^[14]发现柚皮甙对人骨髓间充质干细胞有保护作用并能促进其增殖、分化。高晓珺等^[15]发现骨碎补总黄酮能明显抑制胶原诱导性关节炎大鼠关节侵蚀及关节周围骨丢失。高华利等^[16]发现骨碎补总黄酮能明显抑制胶原诱导性关节炎大鼠炎症关节骨破坏。杨渊等^[17]发现柚皮甙诱导的骨髓间充质干细胞可修复兔股骨头坏死。软骨组织工程支架材料的来源包括两大类:天然来源的材料和人工合成材料，取材研究十分丰富。郝增涛等^[18]使用壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为细胞支架。詹兴旺等^[19]应用混合材料胶原-壳聚糖作为细胞支架。初殿伟等^[20]使用壳聚糖-胶原支架构建兔骨髓间充质干细胞复合体。韩爽等^[21]应用自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损。韦益毅^[22]经过检索文献发现复合支架使生物材料具有互补特性，一定程度上满足了理想生物材料支架应具的综合特点但是仍然多存在各种各样的缺陷：如体内吸收过快过慢，机械强度不足，生物相容性问题，人工合成的聚合物植入引起的炎性反应，以及免疫原性和致癌性等问题^[23]。

为解决以上问题，实验选用脱细胞真皮基质载体，通过对胶原纤维进行系列改建，利用组织学等方法使其成为适合软骨细胞生长的载体，并通过细胞支架使骨髓间充质干细胞与正常软骨细胞共培养，软骨细胞可与骨髓间充质干细胞相互作用，从而促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化^[24]。研究发现，与单纯应用骨髓间充质干细胞相比，软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养可产生更多的Ⅱ型胶原等软骨细胞特征性的成分^[25]。

应用柚皮苷结合骨髓间充质干细胞复合脱细胞真皮基质构建的组织工程软骨治疗关节软骨缺损的实验显示，柚皮苷结合干细胞复合体组的修复效果最好，单纯干细胞复合体组次之，空白组的修复最差，柚皮苷结合单纯骨髓间充质干细胞组和柚皮苷结合单纯脱细胞真皮基质载体组修复情况介于两者之间。就修复时间对于修复效果的影响而言，修复时间的延长对修复程度有着正向的影响。

本研究首次采用分离纯化后的骨髓间充质干细胞，复合改建后的脱细胞真皮基质材料，构建组织工程骨，在中医传统理论的指导下，结合应用中药柚皮苷，修复关节软骨缺损。应用权威的造模方法，保证了本研究的研究质量。较之国内外其他相关研究，本研究首次从中西医结合的角度进行研究，中医学认为本病的病机为肝肾亏损，“肝主筋”、“肾主骨”是中医学的传统理论，因此结合应用补肝肾的中药柚皮苷进行关节软骨修复的研究，兼顾了病机的关键，具有很好的创新性和先进性。本研究探索了提高修复关节软骨缺损成功率的新途径，为传统中药结合现代组织工程技术治疗关节软骨缺损提供了新的理论与实验依据。

不足与展望：对柚皮苷结合组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损的探讨尚属初步，在今后的研究中，还需作以下几方面的工作：①从细胞学的层面探讨组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损的机制。②结合基因转染技术，增强兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的效率。③探讨不同浓度的柚皮苷溶液对修复兔膝关节软骨缺损效率的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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组织工程软骨与柚皮苷联合修复兔膝关节软骨缺损的组织学证实

Histology research on repairing of rabbit articular cartilage defects with naringin and tissue engineering cartilage

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[1]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[2]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[3]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[4]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[5]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[6]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[7]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[8]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[9]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[10]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[11]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[12]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	高坤, 陈大宇, 张勇, 刘伟东, 孙淑芬, 赖文强, 马笃军, 吴益宏, 林展鹏, 蒋鹰鹭, 余伟吉. 牛膝醇提物调控滑膜成纤维细胞外泌体抑制软骨细胞外基质降解[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3636-3640.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.