一氧化碳中毒迟发性脑病模型小鼠脑内血红素加氧酶1 mRNA和蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明一氧化碳中毒迟发性脑病症状的出现与一氧化碳中毒后神经组织细胞凋亡持续发生关系较大。有关血红素加氧酶的细胞保护作用尤其在脑损伤中的细胞保护作用还存在争议。
目的：观察一氧化碳中毒后不同时间点小鼠脑内血红素加氧酶1 mRNA和蛋白的表达变化。
方法：雄性昆明小鼠随机分为2组，一氧化碳中毒组腹腔注射一氧化碳制备一氧化碳中毒迟发性脑病模型，空气对照组腹腔注射空气。应用原位杂交及Western blot法观察两组在不同时间点海马区血红素加氧酶1 mRNA及蛋白表达变化。
结果与结论：空气对照组血红素加氧酶1 mRNA表达阳性细胞较少，染色较浅；一氧化碳中毒组海马阳性细胞数较多，染色较深。血红素加氧酶1 mRNA在1 d表达增加(P < 0.01)，3 d达高峰(P < 0.01)，5 d时下降(P < 0.01)，21 d时仍高于空气对照组(P < 0.01)。血红素加氧酶1蛋白表达与血红素加氧酶1 mRNA表达变化相一致。结果表明血红素加氧酶1 mRNA及其蛋白的表达增加可能在一氧化碳中毒所致迟发性脑病的发病机制中起重要作用。

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关键词: 实验动物, 组织构建, 一氧化碳, 血红素加氧酶, 小鼠, 脑病, 中毒

Abstract:

BACKGROUND: Currently delayed encephalopathy is closely related with the cell apoptosis in nerve tissue after carbon monoxide (CO) poisoning. The protective effect of heme oxygenase-1, especially in the brain injury remains controversial.
OBJECTIVE: To observe heme oxygenase-1 mRNA and protein expression at different time points after CO poisoning in the mouse brain.
METHODS: Male Kunming mice, weighing 18-22 g, were randomly divided into CO poisoning group and air control group. The model of delayed encephalopathy after acute CO poisoning was established with intraperitoneal injection of CO. Air control group was intraperitoneally injected with air. In situ hybridization and western blot analysis were applied to observe the heme oxygenase-1 mRNA and protein expression in the hippocampus of mice in the two groups at different time points.
RESULTS AND CONCLUSION: There were few positive cells for heme oxygenase-1 mRNA expression in the air control group, with light staining; but a large number of positive cells for heme oxygenase-1 mRNA expression in CO poisoning group, with deep staining. The heme oxygenase-1 mRNA expression was increased at 1 days (P < 0.01), reached a peak at 3 days (P < 0.01), decreased at 5 days (P < 0.01), and still higher than air control group at 21 days (P < 0.01). Changes of heme oxygenase-1 protein expression were consistent with heme oxygenase-1 mRNA expression. The upregulated expression of heme oxygenase-1 mRNA and protein plays a crucial role in the pathogenesis of delayed encephalopathy after CO poisoning.

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Key words: carbon monoxide poisoning, brain diseases, heme oxygenase-1, mice

中图分类号:

R318

赵林岩1，于家川2 . 一氧化碳中毒迟发性脑病模型小鼠脑内血红素加氧酶1 mRNA和蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2836-2840.

Zhao Lin-yan, Yu Jia-chuan. Expression of heme oxygenase-1 mRNA and protein after delayed encephalopathy in carbon monoxide poisoning mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2836-2840.

图/表（结果） 3

2.1 动物模型制备后大体观察

一氧化碳中毒组：染毒后小鼠中毒表现为：平均 6 min后出现多动、烦躁、撞笼，约15 min后出现精神萎靡、少动、四肢瘫软、口唇黏膜呈现樱桃红色，抽搐。中毒30 min后染毒小鼠聚集在一起不动；上述症状染毒后 7 h后逐渐恢复。一氧化碳中毒组中有3只小鼠死亡，予以重新造模，补齐一氧化碳中毒小鼠。

空气对照组：小鼠无异常表现。

2.2 动物模型制备后脑组织海马区的病理改变一氧化碳中毒组1 d时可见神经细胞肿胀，数目略减少；3 d时除上述变化外，可见部分坏死细胞，细胞核浓缩；5 d时上述现象进一步明显，海马区可见大量坏死细胞，21 d时细胞水肿减轻，但仍可见部分坏死细胞(图1)。

空气对照组各时间点脑组织切片染色未见明显改变(图1)，表现为海马区细胞无肿胀，无坏死细胞，细胞核正常。

2.3 两组小鼠血碳氧血红蛋白水平见表1。

2.4 血红素加氧酶1 mRNA表达情况原位杂交结果显示空气对照组海马阳性细胞较少，染色较浅；一氧化碳中毒组海马阳性细胞数较多，染色较深(图2)。且除0 h外，不同时间点阳性细胞数与空气对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。

血红素加氧酶1 mRNA在1 d表达增加，3 d达高峰， 5 d时下降，21 d时仍高于对照组。表2为各时间点血红素加氧酶1 mRNA阳性细胞数比较。

2.5 Western blot法检测血红素加氧酶1蛋白表达情况空气对照组表达较少，一氧化碳中毒组在1 d表达增加， 3 d达高峰，之后略下降，但 21 d时仍高于空气对照组 (P < 0.01，表2)，与原位杂交检测结果一致。血红素加氧酶1蛋白表达条带见图3。

参考文献

引言

一氧化碳中毒是生活和生产中常见的中毒性疾病，严重危害人类的健康和生命。急性一氧化碳中毒患者经过及时抢救治疗，大多可以康复，但有部分患者在中毒症状缓解、意识恢复正常后，经历2-60 d表现正常或基本正常的间歇期后，会再次出现一系列脑病的症状，称为一氧化碳中毒迟发性脑病(DEACMP) ^[1]。脑细胞坏死主要发生在一氧化碳中毒所致的严重损伤之后，病变以炎性反应与组织损伤为特点^[2]，而一氧化碳中毒所致迟发性脑病则是经历一段“正常”时期后才出现，推测一氧化碳中毒迟发性脑病症状的出现与一氧化碳中毒后神经组织细胞凋亡持续发生关系较大^[3-4]。

目前对血红素加氧酶(HO)的生物学特性已经有了较明确的认识，其在体内有3种存在形式，即血红素加氧酶1、血红素加氧酶2、血红素加氧酶3。正常情况下血红素加氧酶1主要存在于外周组织，可被血红素、金属元素、氧化应激、紫外线照射、化学物质、高温、某些药物、内谷胱甘肽耗竭等因素诱导激活，因此又被称为诱导型血红素加氧酶。在正常的脑组织中，血红素加氧酶1表达很少，甚至不表达，各种理化因素刺激导致的脑损伤时都可增加血红素加氧酶1的表达。血红素加氧酶2在中枢特定区域有极高表达，其生化特性及结构都与血红素加氧酶1不同，几乎不被诱导，惟一已知诱导因素是糖皮质激素，又被称为结构型血红素加氧酶。血红素加氧酶3代谢血红素的能力虽然很低，但可能对血红素依赖性的反应过程有调节作用，其生理功能尚未完全明了。

血红素加氧酶系统分布、作用极其广泛，涉及心血管、内分泌、生殖、神经、消化、免疫、呼吸系统等。有研究表明血红素加氧酶1在缺氧缺血性脑病动物模型中的表达与细胞凋亡相关联^[5-6]。本文使用腹腔注射一氧化碳的方法制备一氧化碳中毒迟发性脑病模型，应用原位杂交及Western blot法观察不同时间点海马区血红素加氧酶1 mRNA及蛋白表达变化，探讨一氧化碳中毒所致迟发性脑病的发病机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年11月至2012年3月在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性昆明小鼠，二三个月龄，体质量18-22 g，由大连医科大学动物实验室提供，每笼5只温室饲养(温度在18-20 ℃)于昼夜节律光照条件下，自由进食进水。

实验材料和试剂：一氧化碳气体(体积分数为99.9%)由大连大特气体有限公司提供。丙烯酰胺(Acrylamide)、APS、TEMED、苯甲基磺酰氟(PMSF)、吐温20(Tween20)均为Sigma公司产品。血红素加氧酶1 mRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物制剂公司提供。

实验方法：

动物分组：将小鼠随机分为一氧化碳中毒组和空气对照组，每组40只。各组再随机分为不同的时间点：0 h，12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，15 d，21 d，每个时间点5只。

一氧化碳中毒迟发性脑病动物模型的制备：实验前1 d禁食。一氧化碳中毒组小鼠通过腹腔注射纯品一氧化碳气体制备急性一氧化碳中毒迟发性脑病动物模型^[7]。实验先采用改良寇式法确定单次腹腔注射染毒半数致死量，以略低于半数致死量剂量为首次注射剂量，确定该剂量下染毒小鼠体内一氧化碳的半排出期后，于到达半排出期终点前重复腹腔注射，剂量为首剂量的一半。尾尖静脉采血动态监测染毒大鼠血碳氧血红蛋白(HbCO)，血中碳氧血红蛋白浓度维持在50% 16 h以上，并观察其症状及体征变化。实验于首次腹腔注射一氧化碳100 mL/kg后，连续3次按首次剂量的半量(50 mL/kg)作追加注射，间隔为4 h。采用分光光度计法，使用721型分光光度计测定血浆在540 nm及 555 nm波长处吸光度(A)值，算出吸光率Q值(Q=A₅₄₀/A₅₅₅)。查标准曲线得碳氧血红蛋白的百分含量^[8]。

空气对照组首次腹腔注射空气100 mL/kg后，连续3次按首次剂量的半量(50 mL/kg)作追加注射，间隔为4 h。

脑组织出现病理学改变及中毒结束后迷宫实验^[2]显示正确入臂数少于3次者做为一氧化碳中毒小鼠迟发性脑病模型的鉴定标准^[9]。

标本制备：一氧化碳中毒及空气对照组小鼠分别于末次注射后各时间点断头处死，取出一侧脑组织标本置于多聚甲醛中固定，制作石蜡切片。另一侧脑组织用于Western blot实验。

Western blot法观察血红素加氧酶1蛋白表达：①海马细胞总蛋白的提取。②蛋白变性：100 ℃煮沸3 min，置于冰上5 min，-80 ℃备用。③Bradford比色法测定蛋白含量。④SDS-PAGE电泳。⑤转膜。⑥免疫反应。⑦化学发光、显影、定影。⑧凝胶图像分析：将胶片进行扫描或拍照，经β-actin校正后，用凝胶图像处理系统比较各组的积分吸光度值。

血红素加氧酶1 mRNA原位杂交检测：将石蜡标本切片反复脱蜡至水，H₂O₂室温处理10 min，加胃蛋白酶消化15 min，滴加预杂交液，湿盒中37 ℃杂交过夜，切片经过反复振洗、封闭、滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶、DAB显色、脱水透明、封固。用预杂交液代替杂交液作阴性对照，阳性细胞为胞质内有棕黄色颗粒。

主要观察指标：血红素加氧酶1 mRNA及蛋白表达变化。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，于400倍光镜下计数5个视野平均阳性细胞数。两组间比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

一氧化碳在常温、常压下以气态物质存在，日常和生产环境中也是从呼吸道进入人体引起中毒，因此传统的一氧化碳中毒模型多采用吸入式染毒，可分为动态法和静式法^[10]。动态吸入法染毒较接近于日常一氧化碳中毒途径，所得结果可避免缺氧、CO₂蓄积和湿度增加等因素影响，但其装置费用较高，一氧化碳消耗量大，染毒过程中对操作要求较高，因此难以普及推广；而静式染毒法虽然所需设备相对简单，操作亦较方便，但常因不能排除缺氧、CO₂蓄积等各种因素干扰等缺点而难以应用。Fechter等^[11]曾报告用腹腔注射一氧化碳染毒的方法建立大鼠耳蜗损伤的动物模型获得成功；杨俊卿等^[12]亦采用腹腔注射法建立了急性一氧化碳中毒小鼠脑损伤模型，相对于吸入染毒法来说，腹腔注射一氧化碳优点明显：操作简单易行，对仪器设备无特殊要求，影响因素少，染毒剂量可准确控制，注射后血碳氧血红蛋白浓度可迅速升高至所需水平，并引起明显的中毒症状，神经系统损伤及生化指标改变均与临床所见一氧化碳中毒表现一致。本实验参照王耀宏等^[7]急性一氧化碳中毒迟发性脑病的动物模型制备采用的连续间隔染毒法及刘凤超等^[9]一氧化碳中毒迟发性脑病的动物模型鉴定标准使动物处于重度中毒状态，染毒出现长时间浅昏迷，十分接近临床上重症一氧化碳中毒病例，本实验先采用改良寇式法确定单次腹腔注射染毒半数致死量，以略低于半数致死量剂量为首次注射剂量，确定该剂量下染毒小鼠体内一氧化碳的半排出期后，于到达半排出期终点前重复腹腔注射，剂量为首剂量的一半。尾尖静脉采血动态监测染毒大鼠血碳氧血红蛋白，血中碳氧血红蛋白浓度维持在50% 16 h以上，其他染毒方法血中碳氧血红蛋白浓度维持时间均未达16 h，采用分光光度计法，使用721型分光光度计测定血浆在540 nm及555 nm 波长处吸光度值，算出吸光率值，查标准曲线得碳氧血红蛋白的百分含量。本实验采用腹腔注射途径染毒使动物长时间处于重度中毒状态，避免了吸入染毒可能出现的缺氧因素对实验结果的影响，虽与临床所见急性一氧化碳中毒的侵入途径不同，但中毒机制相符。本方法是最为接近临床实际的一氧化碳中毒迟发性脑病模型，通过上述方法制备模型，发现3 d时迟发性脑病模型发生率最高为80%，余时间点迟发性脑病发生率为55%-70%，与以往其他方法造模比较此方法造模成功率高^[13]，简便，易行。

血红素加氧酶系统是一个微粒体酶系统，在哺乳动物体内广泛存在，涉及整个生长发育过程。血红素加氧酶的分类、分布、分子生物学、功能以及在机体各系统中的作用已有大量研究，血红素加氧酶有3种同功酶，血红素加氧酶1为诱导型^[14]，正常情况下存在于脾、肝、骨髓等血细胞代谢活跃的组织中表达很少，只有在应激状态下脑内才有大量表达^[15-17]。血红素加氧酶系统在维持和调节正常及应激状态下机体内环境稳定和代谢平衡中起重要作用。在各种类型的损伤中如缺血、缺氧、炎症等情况下，都观察到血红素加氧酶的诱导表达^[¹⁸^]，多认为这一反应是对抗氧化应激的代偿机制，对细胞起保护作用^[^19-20^]，但有关血红素加氧酶的细胞保护作用尤其在脑损伤中的细胞保护作用还存在争议，有研究表明脑中血红素加氧酶1的过度表达会产生有害作用，认为血红素加氧酶诱导的细胞保护作用是有阈值的。

本实验模拟临床一氧化碳中毒迟发性脑病的动物模型，研究一氧化碳中毒后不同时间点小鼠脑内血红素加氧酶1表达变化规律，利用原位杂交和Westen Blot方法观察一氧化碳中毒小鼠在不同时间点血红素加氧酶1 mRNA及蛋白的表达，结果显示对照组阳性细胞较少，染色较浅；一氧化碳中毒组海马阳性细胞数较多，染色较深，且在一些不同时间点阳性细胞数与对照组相比差异有显著性意义。血红素加氧酶1在1 d表达增加，3 d达高峰，21 d时下降，仍高于对照组。血红素加氧酶1的变化趋势与小鼠迟发性脑病发生率呈现一致性，另外关里等^[21]研究认为血红素加氧酶1诱导表达对急性一氧化碳中毒引起的大鼠脑海马损伤有明显的保护作用，提示血红素加氧酶1系统在防护急性一氧化碳中毒海马损伤的病理过程中占有重要地位，以往研究一氧化碳诱导培养星型胶质细胞早期凋亡时，观察到一氧化碳处理组比一氧化碳+ZnppⅨ(HO活性抑制剂)组早期凋亡细胞数百分比高，提示血红素加氧酶与细胞凋亡间存在相关性，血红素加氧酶1的保护机制可能与其减轻脂质过氧化反应，抑制caspase-3蛋白表达和活性对抗细胞凋亡有关。但是，血红素加氧酶1与细胞凋亡间的具体关系还需进一步明确^[22]。一氧化碳中毒诱导的神经细胞凋亡在一氧化碳中毒迟发性脑病发病机制中尤为被重视，如果上述二者之间的关系研究清楚，通过对一氧化碳中毒脑损伤的发病机制的认识，对于一氧化碳中毒迟发性脑病将会更深一步理解。

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