移植保存液中脐带间充质干细胞活性与氧化应激的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5785-5792.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.007

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移植保存液中脐带间充质干细胞活性与氧化应激的影响

牛玉虎¹，陈彦²，张建林¹，雷鑫¹，董艳婷¹，崔蕾²，牛勃³

1山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
2山西医科大学第二附属医院呼吸科，山西省太原市 030001
3首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020

收稿日期:2012-12-06 修回日期:2012-12-19 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 牛勃，博士，博士生导师，首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020 niub2004@126.com
作者简介:牛玉虎★，男，1985年生，山西省汾西县人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事干细胞研究与生物诊疗研究。 niuyuhu_8905@163.com

Oxidative stress effect on viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in storage solution of transplantation

Niu Yu-hu¹, Chen Yan², Zhang Jian-lin¹, Lei Xin¹, Dong Yan-ting¹, Cui Lei², Niu Bo³

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
2Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
3Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

Received:2012-12-06 Revised:2012-12-19 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Niu Bo, M.D., Doctoral supervisor, Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China niub2004@126.com
About author:Niu Yu-hu★, Studying for master’s degree, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China niuyuhu_8905@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床移植常用的保存液可使人脐带来源间充质干细胞活性下降，影响移植效果，但关于其活性下降原因的报道目前还很少。
目的：探索氧化应激是否为人脐带来源间充质干细胞临床移植保存过程中活性下降的因素；并在保存液中添加自由基清除剂是否可提高保存效果。
方法：室温下用生理盐水保存人脐带来源间充质干细胞，0，2，4，6 h后分别检测细胞内活性氧水平、检测丙二醛含量以及抗氧化酶活性以判定保存后细胞内氧化应激水平；保存液中添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸后检测细胞贴壁率变化。
结果与结论：经生理盐水保存后人脐带来源间充质干细胞内活性氧水平升高，细胞裂解液丙二醛含量呈时间依赖性增加，抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶活性均降低。添加N-乙酰半胱氨酸的移植保存液组比不添加组保存人脐带来源间充质干细胞后细胞活性氧水平降低、贴壁率升高。说明在临床常用移植保存液中人脐带来源间充质干细胞内活性氧升高是其活性下降的一个因素，在保存液中添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸后能够一定程度的改善保存效果。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 人脐带间充质干细胞, 氧化应激, 活性氧, 衰老, 谷胱甘肽, 丙二醛, 超氧化物歧化酶, 应激水平, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The viability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells is often declined with the commonly used transplantation storage solution in clinics, which may influence the therapeutic effects of cellular transplantation. However, reasons for this are still unknown.
OBJECTIVE: To investigate the role of oxidative stress in the reduction of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells viability in the storage process during clinical transplantation and to observe the effects of radical scavenger on the results.
METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were harvested and cultured in normal saline for 0, 2, 4 and 6 hours at room temperature. Intracellular reactive oxygen levels were detected at those time points. Antioxidant enzyme activities and levels of malondialdehyde were measured to determine the intracellular oxidative stress levels after storage. Cell adhesion rate changes were retested after adding N-acetyl cysteine to the storage solution.
RESULTS AND CONCLUSION: The reactive oxygen levels in human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were increased significantly after normal saline storage and levels of malondialdehyde were increased in a time-dependent manner. Activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were all reduced. Addition of N-acetyl cysteine into the storage medium decreased the reactive oxygen levels and improved the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells viabilities. Experimental findings indicate that, increased reactive oxygen species in human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells is one of the reasons for reduced cell viability. Adding the radical scavenger N-acetyl cysteine can improve the storage effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, umbilical cord/umbilical blood stem cells, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, oxidative stress, active oxygen, senescence, glutathione, malondialdehyde, superoxide dismutase, stress level, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

牛玉虎，陈彦，张建林，雷鑫，董艳婷，崔蕾，牛勃. 移植保存液中脐带间充质干细胞活性与氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5785-5792.

Niu Yu-hu, Chen Yan, Zhang Jian-lin, Lei Xin, Dong Yan-ting, Cui Lei, Niu Bo . Oxidative stress effect on viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in storage solution of transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5785-5792.

图/表（结果） 9

2.1 人脐带来源间充质干细胞鉴定
形态学观察：原代人脐带来源间充质干细胞达80%-90%融合后传代培养，细胞逐渐趋于均匀一致的长梭形，呈平行或漩涡状生长，见图1。

人脐带来源间充质干细胞分化能力：细胞成骨诱导21 d后，茜素红染色，见大量玫瑰红色钙结节形成，见图2A；细胞成脂诱导21 d后，油红O染色，细胞浆内均可见红色脂滴的形成，见图2B。

人脐带来源间充质干细胞表面标志物测定：流式细胞仪表型鉴定结果显示，经分离培养而来的人脐带间充质干细胞具有典型的间充质干细胞表面标志性特征， CD44、CD105、 CD29均呈阳性表达，不表达CD34、CD45，见图3。

2.2 经保存后人脐带来源间充质干细胞活性变化 通过用锥虫蓝染色对人脐带来源间充质干细胞保存活性进行初步评估。结果发现，人脐带来源间充质干细胞保存于生理盐水中，细胞活性呈时间依赖性下降，见图4。

2.3 经保存后人脐带来源间充质干细胞活性氧变化 人脐带来源间充质干细胞经氯化钠溶液保存0，2，4， 6 h后通过DCFH-DA和流式分析检测细胞内活性氧的产生。24 ℃人脐带来源间充质干细胞经生理盐水保存2，4，6 h后细胞内活性氧水平明显增高(P < 0.05)，且在保存2 h达到峰值，见图5。

2.4 抗氧化酶检测 24 ℃条件下，经生理盐水保存后对人脐带来源间充质干细胞裂解液中抗氧化酶活性进行检测发现细胞内抗氧化物酶活性降低。与未保存时比较，保存2 h时差异无显著性意义，但随着时间的延长，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶活性均下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.5 经保存后人脐带来源间充质干细胞丙二醛含量变化 见图7。

室温下经生理盐水保存后测定人脐带来源间充质干细胞裂解液中丙二醛含量，结果表明经生理盐水保存后细胞裂解液中丙二醛含量与未保存时细胞裂解液相比，保存2 h时差异无显著性意义，然而随着时间的延长，丙二醛含量逐渐增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 添加N-乙酰半胱氨酸后人脐带来源间充质干细胞内活性氧含量变化 24 ℃条件下，人脐带来源间充质干细胞在添加与未添加N-乙酰半胱氨酸的生理盐水中保存2 h，观察细胞内活性氧水平。与未添加组比，细胞内活性氧显著下降(P < 0.05)，见图8。

2.7 添加N-乙酰半胱氨酸后人脐带来源间充质干细胞贴壁能力变化 向保存液中添加5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸，人脐带来源间充质干细胞室温保存6 h后，细胞贴壁率为(60.22±2.59)%，与未添加组(53.47±2.96)%比较，提升约10%，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.8 添加N-乙酰半胱氨酸后对人脐带来源间充质干细胞特性的影响 结果表明添加N-乙酰半胱氨酸后未影响人脐带来源间充质干细胞的多向分化能力见图9；表面标记，见图10。

经添加N-乙酰半胱氨酸的生理盐水保存后的人脐带来源间充质干细胞仍高表达CD29、CD44和CD105，不表达CD34、CD45；并且仍具有多向分化的能力。

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引言

人脐带来源间充质干细胞是具有自我更新能力且能够向多个方向分化的一类干细胞^[1-2]，是干细胞治疗尤其是再生医学研究的的理想来源。随着干细胞移植的发展人脐带来源间充质干细胞的应用越来越广泛，但其治疗效果差异较大^[3-5]。主要原因是间充质干细胞的生物学特性易受多个因素的影响，例如细胞来源^[6]、标本采集过程^[7]、细胞培养条件^[8]、移植细胞数量^[9]、移植细胞时机^[10]、移植细胞给入途径以及受者个体差异均会对间充质干细胞特性及移植效果产生影响^[11-12]。在众多因素中，移植前细胞质量对间充质干细胞移植治疗效果的影响最为直接，而移植前细胞质量又与移植前保存条件密切相关。人脐带来源间充质干细胞在移植前不可避免的需要在移植液中保存，所以实验推测移植保存液可能会对细胞产生影响。通过观察经保存液保存后的细胞活性发现，短时间保存细胞后细胞活性下降。虽然人脐带来源间充质干细胞的其他生物学特性未受到大的影响，但细胞活性的下降会直接影响细胞移植后的治疗效果。因此，明确人脐带来源间充质干细胞保存后活性下降的机制，并干预该过程，对提高人脐带来源间充质干细胞移植前存活率及获得更好的治疗效果，具有重要意义。

生理盐水(0.9%氯化钠)注射液是经典的药物溶媒，虽然其对人脐带来源间充质干细胞保存的适用性并未得到评估却常被用作细胞移植的保存介质，因此这次实验移植保存液选用0.9%氯化钠注射液。

研究发现，临床常用移植保存介质对人脐带来源间充质干细胞保存效果的影响主要是引起部分人脐带来源间充质干细胞死亡。引起细胞死亡的相关机制很多^[13-17]，细胞内氧化应激水平升高是一个最常见的因素。在缺血、缺氧、辐射等不良环境刺激下^[18-20]，细胞内氧化应激水平均可出现明显增高，引起细胞损伤，有研究报道缺血再灌注时的氧化应激水平升高可导致间充质干细胞的大量死亡^[21]。细胞内活性氧的大量聚集可导致细胞活性下降，因此，细胞内氧化应激水平的升高是细胞死亡的一个常见因素。所以一方面当人脐带来源间充质干细胞脱离正常培养条件转移至临床移植液中时，处于缺乏必须营养成分及生理条件的环境时，首先考虑活性氧的升高是否是细胞活性下降的一个因素，另一方面，考虑当降低保存过程中人脐带来源间充质干细胞的氧化应激水平时是否会改善移植细胞的存活能力。目前两者均无研究报道，这正是课题研究的主要内容。

因此，实验对人脐带来源间充质干细胞经保存后氧化应激水平进行了测试，并通过在移植保存液中添加自由基清除剂，观察氧化应激在移植保存过程中对人脐带来源间充质干细胞活性的影响。

材料方法

设计：体外细胞学实验。

时间及地点：于2010年12月至2012年6月在山西医科大学生物化学和分子生物学实验室完成。

材料：

脐带来源：脐带均来源于健康足月新生儿剖宫产后，由山西医科大学第二医院妇产科提供，均与孕妇签署知情同意书。

氧化应激对移植保存液中脐带来源间充质干细胞活性实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

人脐带来源间充质干细胞的分离与培养：脐带经PBS充分洗涤并剔除动静脉后，充分剪碎至约1 mm³大小，接种到T-25 cm²细胞培养瓶中，加入5 mL含体积分数10%胎牛血清、200 mg/L青霉素、200 mg/L链霉素的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养。4 d后首次换液，7 d后半量换液，10 d后全量换液除去非贴壁细胞及脐带组织块；以后每3 d换1次液。当细胞生长达到80%融合时，按1∶3比例进行传代接种，第3代细胞用于后续试验。

细胞多向分化能力及表型分析测定：取第3代人脐带来源间充质干细胞，使用脂肪细胞诱导培养基和成骨细胞诱导培养基分别诱导培养人脐带来源间充质干细胞向脂肪细胞及成骨细胞分化，通过油红O及茜素红染色后观察；采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD29、CD44、CD34和CD45的表达情况。

锥虫蓝染色：取第3代人脐带来源间充质干细胞于 24 ℃生理盐水分别保存0，2，4，6 h，分别于各时间点离心，离心半径10.5 cm，1 000 r/min，5 min去上清，重悬细胞并充分混匀，取18 µL细胞悬液与0.4%锥虫蓝2 µL以体积比9∶1充分混匀，滴加到血球计数板计数腔内，在倒置显微镜下观察，计数，观察过程于3 min内完成。

细胞内活性氧水平的测定：接种人脐带来源间充质干细胞于6孔板中，待其75%融合，常规消化贴壁细胞，制备成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL工作浓度为10 μmol/L的DCFH-DA(终浓度为 100 μmol/L)，充分混匀37 ℃条件下避光孵育30 min后，用PBS洗涤细胞3次，以去除细胞外荧光剂，1 000 r/min离心5 min，500 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪分析荧光强度。

抗氧化酶活性检测：经胰蛋白酶消化收集细胞，PBS清洗后离心，将形成的细胞球块悬浮在50 µL裂解缓冲液(1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L EGTA、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂)中，冰上孵化30 min并且每 10 min漩涡震荡器混合1次。按超氧化物歧化酶测试盒、过氧化氢酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒说明分别测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性。

丙二醛检测：将人脐带来源间充质干细胞用PBS洗涤3次，制备成单细胞悬液，收集于EP管中，再次经PBS漂洗后，再加1 mL PBS重新吹打成细胞悬液。冰水浴中超声细胞破碎仪进行细胞破碎，取细胞上清液 100 μL。依据丙二醛试剂盒说明书要求操作，在波长为532 nm处，测各管吸光度值；按照如下公式计算：

贴壁实验：将人脐带来源间充质干细胞制成细胞悬液以2×10⁶/组保存于添加与未添加5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸的生理盐水中分别保存6 h，保存后将细胞转移至24孔板待其贴壁后结晶紫染色计数。

主要观察指标：①人脐带来源间充质干细胞多向分化能力和表型特征。②24 ℃下，生理盐水保存人脐带来源间充质干细胞0，2，4，6 h后细胞活性、活性氧含量及抗氧化酶活性的变化。③保存液中添加N-乙酰半胱氨酸后人脐带来源间充质干细胞活性氧的变化。④保存液中添加N-乙酰半胱氨酸对人脐带来源间充质干细胞贴壁率的影响。⑤添加N-乙酰半胱氨酸后对人脐带来源间充质干细胞多向分化能力和表型特征的影响。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。应用GraphPad Prism 5、Microsoft Office Word 2007和Adobe Photoshop 6.0进行图表绘制。采用单因素方差分析(one way ANOVA)进行两组及多组样本均数的比较，两组间比较采用独立样本t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

目前细胞移植是全球研究的热点，而移植疗效很大程度上取决于细胞活性。移植前细胞不可避免的需要转移至移植保存液中保存，而移植保存液一般不提供细胞生长所需营养成分，这将导致细胞所处环境发生改变，进而使细胞活性改变^[22-23]。研究发现经保存液生理盐水保存后人脐带来源间充质干细胞活性下降，且随着保存时间的延长活性下降越来越明显，针对这一现象实验进行了进一步的研究，旨在探寻细胞在移植前保存过程中最大程度保持细胞活性的方法，以达到更好的细胞移植效果。

活性氧是一类化学性质活泼且具有较高氧化活性的分子或离子，主要包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等^[24]。生理条件下，活性氧主要参与清除体内细菌、异物及在细胞信号传导过程中发挥重要作用^[25]。同时体内的自由基清除系统可以及时清除氧自由基，不致使其堆积产生危害；病理情况下，当某些因素作用于细胞，使机体的氧自由基过量生成或抗氧化防御系统受损，氧自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏，活性氧产生的速率大于被清除的速率时，就会造成活性氧的蓄积，导致氧化应激的出现，引起大分子(主要为脂质、蛋白质和DNA)的氧化损伤。活性氧的大幅增高，可引起细胞膜脂质过氧化、细胞膜的完整性丧失而引起细胞死亡^[26]。Saito等^[27]与Avery等^[28]发现，活性氧，特别是脂质过氧化产物与细胞死亡密切相关。本实验进一步检测脂质过氧化产物丙二醛水平的变化以验证保存过程中氧化应激的水平。

丙二醛是反映脂质过氧化程度的一个重要指标，其含量测定可间接反映脂质过氧化损伤程度。当活性氧水平过高时，可与生物膜中的磷脂、酶、膜受体相关的多不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质发生反应生成LPO、丙二醛，降低细胞膜流动性与通透性，造成细胞正常功能的改变^[29]。而从本研究也观察到，丙二醛水平在保存过程中同样明显升高。

机体的抗自由基物质种类很多，主要酶包括超氧化物歧化酶过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。超氧化物歧化酶主要清除O₂^-，H₂O₂、OH^-的清除则主要靠过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶来完成。各种因素造成体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性下降，将导致体内氧自由基蓄积，使氧化应激增加^[30-31]。因此，通过检测3种酶的活性可作为氧化应激态的证据之一。

以上3个结果可从一定程度上解释目前移植保存介质对人脐带来源间充质干细胞保存效果不佳的原因，而进一步在保存介质中添加自由基清除剂为保存效果的改善提供了希望。

自由基清除剂是指具有延迟、抑制和阻断氧化损伤的一类物质的总称，N-乙酰半胱氨酸是一种经典的活性氧自由基清除剂，它是还原型谷胱甘肽的前体物质，可以改善氧化应激诱导的不同种类细胞的损伤情况^[32-35]，所以选用N-乙酰半胱氨酸作为移植保存介质中的添加成分。

锥虫蓝染色法是细胞学实验中最常用的判断细胞活性的技术手段。实验中首先选用锥虫蓝染色对人脐带来源间充质干细胞保存活性进行初步评估。结果发现，人脐带来源间充质干细胞保存于移植保存介质中，细胞活性呈时间依赖性下降。贴壁实验是作者筛选出的可准确反映保存后人脐带来源间充质干细胞生物学功能的一项指标。有文献报道，改善细胞内氧化应激水平，可提高间充质干细胞贴壁能力，进而改善其在缺血缺氧条件下的生存情况^[36-38]。

实验结果表明经保存后活性降低的人脐带来源间充质干细胞经检测其活性氧水平明显增加，作为移植保存液对人脐带来源间充质干细胞的影响的一个结果，活性氧清除剂能降低细胞内活性氧水平，但未能较大程度的改变移植保存液导致的细胞活性明显下降。添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸后根据贴壁实验结果发现其提高细胞贴壁率最高为10%左右，对细胞活性的改善有限，所以得出结论氧化应激是导致其活性下降的一个因素；N-乙酰半胱氨酸可作为最适保存液中一种有效的添加成分；这样一来提示继续探寻保存过程细胞活性下降机制的必要性，以期找到最佳保存效果的移植保存液。

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目前尚无关于脐带来源间充质干细胞移植保存方面的指南。MSCs移植前常用的移植保存介质包括0.9%氯化钠溶液、5%葡萄糖溶液、勃脉力 A（Plasmalyte A）、1%HSA与5%HSA，其中以0.9%氯化钠溶液最为常用。本文的优势在于探寻针对最常用保存液中脐带来源间充质干细胞活性下降原因，对解决实际问题意义重大。在查阅文献中得到如下结论：氧化应激存在于正常生理与病理情况下，影响细胞各项生命活动。在缺血、缺氧、辐射、等不良环境刺激下，细胞内氧化应激水平均可出现明显增高，引起细胞损伤。缺血再灌注时大量细胞死亡就是因为细胞内氧化应激水平急剧升高引起。帕金森病引起黑质细胞死亡的一个重要因素也是氧化应激水平的升高。过量的氧化应激产物会导致细胞损伤甚至死亡。骨髓间充质干细胞对氧化应激有一定的耐受力，然而过量的氧化应激产物依然会影响骨髓间充质干细胞正常生物学功能。骨髓间充质干细胞在衰老，生长接触抑制等情况下是由于细胞内自由基产物增多，会造成细胞损伤。自由基清除剂具有延迟、抑制和阻断氧化损伤的作用。NAC是一种经典的活性氧自由基清除剂。
目前对于提高干细胞移植前的活性已有一些研究，有研究组提出将间充质干细胞过表达生存基因可提高其生存能力，但对于干细胞进行基因改造，可能会改变干细胞本身的生物学特性。因此本研究对移植保存液中引起细胞活性下降机制以及如何生理性的提高人脐带来源间充质干细胞活性的方法进行了探索。本实验的创新点在于发现活性氧升高是移植保存液中人脐带来源间充质干细胞活性下降的一个原因，通过添加自由基清除剂可一定程度上提高细胞活性，有利于细胞移植。实验不足之处在于由于条件和时间的限制，未能继续探求导致脐带间充质干细胞移植前活性下降的其他可能原因。

移植保存液中脐带间充质干细胞活性与氧化应激的影响

Oxidative stress effect on viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in storage solution of transplantation

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