1.1 设计 随机对照动物实验，体外细胞学实验。多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较进行LSD-t检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年5月至2023年3月在河南省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及细胞 100只SPF级雄性SD大鼠，每组10只，体质量(140±20) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2020-0037。动物饲养于标准环境下，条件为温度(25±2)℃、湿度55%-65%、光暗交替(12 h/12 h)。实验获得河南省中医院实验动物伦理委员会审查，伦理审查编号：HNSZYY-20200582。
人单核细胞THP-1，编号SCSP-567，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.3.2 独活寄生汤的制备 独活寄生汤饮片由河南省中医院提供。药物组成及剂量均参照导师临床应用，对原方进行加减。方剂组成：独活20 g、桑寄生15 g、牛膝15 g、杜仲10 g、党参10 g、茯苓10 g、当归10 g、芍药10 g、桂枝5 g、防风5 g、川芎5 g、熟地10 g、细辛3 g、秦艽5 g、甘草5 g。以8倍纯水浸泡上述成分2 h后煎煮2次，每次30 min，取2次煎煮药液过滤、混合，浓缩至1 mL原液=2 g生药，储存至4 ℃备用。参考Meeh-Rubner公式，根据人临床剂量和大鼠给药剂量进行等效换算[10]。
1.3.3 试剂与抗体 秋水仙片(每片0.5 mg，云南昊邦制药有限公司，批号为210911)；尿酸钠晶体(MSU，美国Sigma-Aldrich公司，货号：U2875)；佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate，PMA)和多聚甲醛组织固定液(美国Sigma公司，货号：P1585和21200490)；DMEM细胞培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶消化液(美国gibco公司，货号：8121581、42F3281K、2289329、2323073)；生物素标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG、生物素标记山羊抗小鼠 IgG(中国上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0408、A0412)；PINK1抗体、Parkin抗体、NLRP3抗体、白细胞介素1β抗体、LC3B抗体、线粒体外膜转位蛋白20(TOM20)抗体、MitoTracker™ Red、转染试剂Lipofectamine™ 2000(美国赛默飞世尔科技公司，货号：PA1-16604、PA5-13399、MA5-23919、12-7114-82、PA5-32254、PA5-52843、M7512、11668500)；人NLRP3酶联免疫(ELSIA)以及大鼠白细胞介素1β、C-反应蛋白酶ELSIA试剂盒(英国Abcam公司，货号：ab274401、ab277086、ab256398)；人白细胞介素1β和大鼠尿酸ELISA试剂盒(上海科顺生物科技有限公司，货号：KS12749 和KS13844)。
1.3.4 实验仪器 Allegra X-30高速离心机(美国贝克曼库尔特公司)；RCO-3000-5 CO2的培养箱(美国REVCO公司)；DL-CJ-ZNDI超净工作台(北京东联哈尔仪器)；DK-600 型恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；Varioskan酶标仪(美国Thermo公司)；Contour光学显微镜(德国布鲁克集团)；BX41荧光显微镜(日本Olympus公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 痛风性关节炎模型构建 60只大鼠随机分为6组：对照组、模型组、阳性对照组(秋水仙片，给药剂量为0.3 mg/kg)、独活寄生汤低、中、高剂量组(6.9，13.8，27.6 g/kg)。自适应喂养7 d后，各给药组对应药物灌胃；对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃(10 mL/kg)，每日1次，连续给药7 d。第5天给药1 h后，按文献方法在大鼠右后踝关节处注射100 mg/mL的尿酸钠晶体混悬液200 μL[11]，制备痛风性关节炎模型；对照组注射等体积无菌生理盐水。将关节囊对侧鼓起作为注入的标准。
1.4.2 大鼠踝关节周径和肿胀度 在造模前、造模6，12，24，48 h分别使用游标卡尺测量大鼠右侧踝关节同一部位的周径(用记号笔在每只大鼠的右后足踝关节处作标记)。关节的肿胀度=(测定周径-初始周径)/初始周径×100%。
1.4.3 步态评分 分别于造模后24，48 h按照文献方法对大鼠步态进行观察评分[12]。评分标准为：0分，正常行走；1分，轻微跛行，受试下肢略有弯曲；2分，中度跛行，受试下肢刚触及地面；3分，重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走。
1.4.4 关节炎症指数 分别于造模后24，48 h按照文献方法对大鼠进行关节炎症指数评分[13]。评分标准为：0分，关节部位正常；2分，关节皮肤红斑，轻度肿胀，骨性标志可见；4分，关节明显红肿、骨性标志消失、但肿胀局限于关节部位；6分，关节以外肢体肿胀。
1.4.5 样品制备 上述指标测定结束后，腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，腹主动脉取血后静置30 min，2 000 r/min离心15 min(半径13.5 cm)，制备血清。分离大鼠踝关节滑膜组织，将部分滑膜组织固定于40 g/L的多聚甲醛中备用。
1.4.6 大鼠踝关节病理分级程度 取大鼠右侧踝关节滑膜组织，40 g/L多聚甲醛溶液进行固定。按照脱钙、脱水浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色步骤进行操作，置于光学显微镜下观察组织病理形态变化。
通过Mankin’s评分对各组大鼠的病理组织学情况进行检查[14]，评分标准如下：0分表示软骨无损伤；1分表示软骨表层不平整，基质染色轻染或者正常，无裂隙形成；2分表示软骨表层不平整，同时伴随有裂隙，细胞的数目减少且排列不整齐，基质轻染；3分表示软骨缺失或破坏，潮线消失，软骨厚度变薄。
1.4.7 ELSIA检测尿酸、C-反应蛋白、NLRP3和白细胞介素1β水平 参照ELISA试剂盒说明书步骤，每个样品做3个复孔，检测各组大鼠血清、踝关节组织或细胞中尿酸、C-反应蛋白、NLRP3、白细胞介素1β的水平。利用酶标仪测定450 nm条件下的吸光度值。
1.4.8 免疫印迹法检测PINK1/Parkin/NLRP3通路相关蛋白表达 取踝关节滑膜组织或人单核细胞THP-1，加入RIPA裂解液于冰上进行裂解并反复吹打使其松散，离心提取蛋白上清液(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，加入上样缓冲液变性，BCA蛋白定量法检测其蛋白含量。凝胶电泳后转印至PVDF膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h(4 ℃)。分别加入1∶1 000的PINK1、Parkin、NLRP3、LC3B及1∶1 500的TOM20，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，将ECL显影液滴于PVDF膜在曝光仪中测定各组蛋白条带的吸光度，Image J分析条带灰度值。
1.4.9 含药血清的制备 将40只雄性SD大鼠按照随机数字表法进行分组，分别灌胃生理盐水(收集空白血清)，不同剂量独活寄生汤(6.9，13.8，27.6 g/kg)连续给药7 d。末次给药2 h后对动物采用戊巴比妥钠麻醉，收集血清后放入水浴锅，56 ℃灭活30 min。0.22 μm无菌滤膜抽滤除菌后分装，-80 ℃保存备用。
1.4.10 细胞培养及分组 用含体积分数10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养人单核细胞THP-1，于37 ℃、含有体积分数5% CO2的培养箱中进行培养，取对数生长期的细胞进行实验(下同)。①为了检测独活寄生汤含药血清对THP-1细胞存活率、PINK1/Parkin/NLRP3信号通路及线粒体自噬相关蛋白的影响，将细胞分为空白对照组、模型组、独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组(分为6.9，13.8，27.6 g/kg)。
各组细胞经100 ng/mL PMA处理24 h后，空白对照组加入10%空白血清，模型组加入100 μg/mL的尿酸钠和10%空白血清，独活寄生汤含药血清组在添加尿酸钠的基础上加入10%的含药血清，处理时间为24 h。②为了检测PINK1信号在独活寄生汤含药血清诱导THP-1细胞NLRP3、白细胞介素1β表达及线粒体自噬的影响，将细胞分为空白对照组、模型组、独活寄生汤含药血清组、PINK1 siRNA+独活寄生汤含药血清组[15]。Negative control siRNA(NC-siRNA)和PINK1 siRNA由上海吉玛制药有限公司合成。按照Lipofectamine™ 2000说明书进行转染，转染浓度为50 nmol/L，转染时间为24 h。经PMA、尿酸钠和独活寄生汤高剂量含药血清处理后用于后续研究。
1.4.11 四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞活性 将细胞以5×103个/孔的密度种到96孔板中，每孔100 μL，处理结束后弃去上清液，加入新鲜培养液及MTT溶液孵育4 h，弃去上清后加入二甲基亚砜溶液混合均匀，酶标仪检测吸光度A值(波长490 nm)，每组重复进行3次。
1.4.12 免疫荧光双染法检测线粒体自噬水平 取对数生长期THP-1细胞，无菌玻片裁剪后浸泡于浓硫酸中过夜，纯水洗涤并烘干消毒。待细胞处理结束后加入200 nmol/L的MitoTracker™ Red染色30 min。固定、透化和封闭后加入LC3B抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜；染色后加入二抗(1∶200)，室温避光孵育1 h。荧光显微镜截取图像，应用Image J测量每个视野中LC3B和MitoTracker覆盖层的相对荧光强度。
1.4.13 免疫荧光法检测NLRP3和白细胞介素1β蛋白表达 处理结束后将细胞用40 g/L多聚甲醛固定，加入通透剂室温下通透20 min，无菌PBS漂洗后加入封闭液，室温下封闭30 min；滴加一抗室温孵育过夜，无菌PBS漂洗后滴加荧光二抗，室温避光孵育90 min，无菌PBS漂洗；滴加DAPI染色液，室温下染色15 min进行染核；洗去DAPI，晾干滴加封片剂封固，置于荧光显微镜下观察拍照，并用Image J软件统计荧光强度。
1.5 主要观察指标 ①通过大鼠行为学、组织病理学以及ELISA检测独活寄生汤对痛风性关节炎大鼠的治疗作用；②通过免疫印迹和ELISA检测各组大鼠踝关节组织中PINK1/Parkin/NLRP3通路相关蛋白表达以及白细胞介素1β水平的变化；③通过免疫印迹和ELISA检测独活寄生汤对THP-1细胞痛风性关节炎模型PINK1/Parkin/NLRP3信号的影响；④通过siRNA干扰结合免疫荧光染色检测PINK1/Parkin对线粒体自噬水平和NLRP3表达的影响。
1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行数据的分析和处理，数据以x±s表示。对于相关的计量资料进行正态性检验和方差齐性检验。对多组间的数据比较采用单因素方差分析，而组间两两的比较则通过LSD-t检验。以P < 0.05表示数据差异有显著性意义。文章统计学方法已经河南中医药大学生物统计学专家审核。
