敲低细丝蛋白B对小鼠颅顶成骨前体细胞增殖、迁移及凋亡的影响

doi:10.12307/2024.516

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (32): 5177-5181.doi: 10.12307/2024.516

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

敲低细丝蛋白B对小鼠颅顶成骨前体细胞增殖、迁移及凋亡的影响

王茜1，2，俞丽1，贾麒钰2，黄金勇2，刘泽彪3，张俊2，加依达尔•地力木拉提2，谢增如2，马海蓉1

新疆医科大学第一附属医院，1临床医学研究院，2创伤骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；3华北理工大学附属医院骨科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2023-08-28 接受日期:2023-10-30 出版日期:2024-11-18 发布日期:2023-12-29
通讯作者: 马海蓉，博士，研究员，新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 谢增如，硕士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院创伤骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:王茜，女，1998年生，河北省柏乡县人，汉族，新疆医科大学第一附属医院创伤骨科在读硕士，主要从事细胞实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82060411)，项目负责人：马海蓉；国家自然科学基金项目(82260409)，项目负责人：谢增如；新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(2021D01D21)，项目负责人：马海蓉；新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(2021D01D19)，项目负责人：谢增如；自治区研究生创新项目(XJ2023G166)，项目负责人：王茜

Effects of filament B knockdown on proliferation, migration and apoptosis of mouse MC3T3-E1 cells

Wang Xi1,2, Yu Li1, Jia Qiyu2, Huang Jinyong2, Liu Zebiao3, Zhang Jun2, Jiayidaer•Dilimulati2, Xie Zengru2, Ma Hairong1

1Research Institute of Clinical Medicine, 2Department of Orthopaedic Trauma, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2023-08-28 Accepted:2023-10-30 Online:2024-11-18 Published:2023-12-29
Contact: Hairong, MD, Researcher, Research Institute of Clinical Medicine, Department of Orthopaedic Trauma, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Xie Zengru, Master, Chief physician, Department of Orthopaedic Trauma, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Xi, Master candidate, Research Institute of Clinical Medicine, Department of Orthopaedic Trauma, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Department of Orthopaedic Trauma, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 82060411 (to MHR) and 82260409 (to XZR); Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Nos. 2021D01D21 (to MHR) and 2021D01D19 (to XZR); Graduate Students’ Innovative Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. XJ2023G166 (WX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细丝蛋白B(Filamin B，FLNB)：为二聚体肌动蛋白结合蛋白家族的成员，是一种重要的细胞骨架蛋白，可将肌动蛋白细胞骨架细丝交联成动态结构，为细胞运动和信号传递提供了重要的支架。
肌动蛋白：是一种中等大小的蛋白质，375个氨基酸残基组成，由高度保守的基因编码。肌动蛋白至少表达成6种异构形式，分为α、β、γ三种类型。根据等电点的不同可将高等动物细胞内的肌动蛋白分为 3 类，α 分布于各种肌肉细胞中，β 和 γ 分布于肌细胞和非肌细胞中。

背景：细丝蛋白B(FLNB)能将肌动蛋白细胞骨架交联成动态结构，对细胞的定向移动至关重要，可调控软骨细胞的增殖、分化及凋亡的发生。然而，细丝蛋白B对成骨细胞增殖、迁移及凋亡的影响尚未报道。

目的：探究细丝蛋白B对MC3T3-E1细胞的增殖、迁移及凋亡的影响。
方法：构建敲低细丝蛋白B表达的腺病毒载体(sh-FLNB1、sh-FLNB2、sh-FLNB3)，感染小鼠颅顶成骨前体细胞(MC3T3-E1)，嘌呤霉素药筛，通过Western Blot以及RT-PCR技术检测敲低效率，选取敲低细丝蛋白B效率最佳的MC3T3-E1细胞株作为稳转细胞株。将细胞分为Blank组、mc3t3组、sh-NC组(空载体)、sh-FLNB组(sh-FLNB慢病毒)，Blank组为α-MEM完全培养基无细胞；mc3t3组为单纯α-MEM完全培养基培养；sh-NC组、sh-FLNB组为含有嘌呤霉素2.5 μg/mL的α-MEM完全培养基培养。培养3 d采用CCK-8法和划痕实验检测MC3T3-E1细胞增殖和迁移能力；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；RT-PCR进一步验证细胞凋亡相关基因的表达。

结果与结论：①Western Blot及RT-PCR结果显示，sh-FLNB3组细丝蛋白B敲低效率最佳，差异有显著性意义(P < 0.000 1)，以此作为后续实验稳转细胞株；②CCK-8数据显示，敲低细丝蛋白B后MC3T3增殖能力显著减弱(P < 0.05)；③划痕实验显示，敲低细丝蛋白B后MC3T3的迁移能力明显下降；④流式细胞仪及RT-PCR显示，敲低细丝蛋白B后，MC3T3-E1细胞凋亡率增加，促凋亡因子Bax表达显著上升，抑凋亡因子Bcl-2表达下降(P < 0.05)；⑤结果说明，细丝蛋白B敲低可降低MC3T3-E1细胞的增殖能力，细胞迁移能力下降，并增加细胞凋亡的发生。

https://orcid.org/0009-0006-3349-4125(王茜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 细丝蛋白B, MC3T3-E1细胞, 增殖, 迁移, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Filamin B (FLNB) can crosslink the actin cytoskeleton into a dynamic structure that is essential for the directional movement of cells. It can regulate the proliferation, differentiation and apoptosis of chondrocytes. However, the effect of FLNB on osteoblast proliferation, migration and apoptosis has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of FLNB on the proliferation, migration and apoptosis of MC3T3-E1 cells.
METHODS: The adenoviral vectors for knockdown of FLNB expression (sh-FLNB1, sh-FLNB2, sh-FLNB3) were constructed and infected with MC3T3-E1 cells. After screened by puromycin drug, the efficiency of FLNB knockdown was detected by western blot and RT-PCR. The MC3T3-E1 cell line with the best efficiency of FLNB knockdown was selected as the stable transient cell line of MC3T3-E1 for subsequent experiments. The cells were divided into blank group, mc3t3 group, sh-NC group (empty vector), and sh-FLNB group (sh-FLNB lentivirus). The blank group was cultured in cell-free α-MEM complete medium; the mc3t3 group was cultured in α-MEM complete medium alone; and the sh-NC and sh-FLNB groups were cultured with α-MEM medium containing 2.5 μg/mL puromycin. After 3 days of culture, cell counting kit-8 assay and cell scratch assay were used to detect the proliferation and migration ability of MC3T3-E1; flow cytometry was used to detect cell apoptosis; and RT-PCR was used to detect the expression of apoptosis-related genes.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot and RT-PCR results showed that the efficiency of FLNB knockdown was the best in the sh-FLNB3 (P < 0.000 1), which was used as a stable cell line for subsequent experiments. Cell counting kit-8 data showed that the proliferative ability of MC3T3 cells was significantly weakened after knockdown of FLNB (P < 0.05). Cell scratch assay results showed that the migration ability of MC3T3 cells was significantly decreased after knockdown of FLNB. Flow cytometry and RT-PCR results showed that the apoptotic rate of MC3T3-E1 cells increased after knockdown of FLNB, the expression of pro-apoptotic factor Bax increased significantly, and the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2 decreased significantly (P < 0.05). To conclude, knockdown of FLNB can reduce the proliferation ability of MC3T3-E1 cells, decrease the migration ability of the cells, and increase cell apoptosis.

Key words: Filamin B, MC3T3-E1, proliferation, migration, apoptosis

中图分类号:

王茜, 俞丽, 贾麒钰, 黄金勇, 刘泽彪, 张俊, 加依达尔•地力木拉提, 谢增如, 马海蓉. 敲低细丝蛋白B对小鼠颅顶成骨前体细胞增殖、迁移及凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5177-5181.

Wang Xi, Yu Li, Jia Qiyu, Huang Jinyong, Liu Zebiao, Zhang Jun, Jiayidaer•Dilimulati, Xie Zengru, Ma Hairong. Effects of filament B knockdown on proliferation, migration and apoptosis of mouse MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(32): 5177-5181.

图/表（结果） 4

2.1 成功构建敲低FLNB的MC3T3-E1细胞株
2.1.1 荧光显微镜观察经转染48 h后，于荧光显微镜下观察每组绿色荧光表达情况(图1A)，结果显示所有组别均有绿色荧光表达。
2.1.2 Western Blot和RT-PCR检测结果显示，相较于sh-FLNB1和sh-FLNB2组，sh-FLNB3组FLNB的mRNA和蛋白的表达显著下调(P < 0.000 1，图1B-D)，说明sh-FLNB3的病毒序列的敲低效果最好，因此将sh-FLNB3作为后期实验的稳定敲低FLNB的MC3T3-E1细胞株(注：后面将sh-FLNB3组标注为sh-FLNB组)。

2.2 敲低FLNB对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响经CCK-8法测定sh-NC组、sh-FLNB组细胞1，2，3 d的A值。结果显示：sh-NC组细胞随着时间的增加，增殖能力逐渐上升；而相较于sh-NC组，sh-FLNB组细胞随着时间的延长，增殖能力逐渐下降(P < 0.05)，见图2。结果表明，敲低FLNB减弱了MC3T3-E1细胞的增殖能力。

2.3 敲低FLNB 对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响 mc3t3组和sh-NC组细胞在24 h时开始表现出明显迁移趋势，而相较于mc3t3组和sh-NC组，sh-FLNB组细胞在24 h时的迁移速度明显减弱，尚未表现出明显迁移变化；48 h后，mc3t3组和sh-NC组的划痕基本靠拢，sh-FLNB组的划痕仍存在较大间隙。图3结果提示，敲低FLNB可以明显降低MC3T3-E1细胞迁移能力。

2.4 敲低FLNB对MC3T3-E1细胞凋亡的影响流式结果显示，培养24 h后，mc3t3组和sh-NC组细胞凋亡率相当，无显著性差异，sh-FLNB组表现为细胞总凋亡率呈现上升趋势(P < 0.05)。同样地，PCR结果显示，相较于mc3t3组和sh-NC组，sh-FLNB组随着FLNB的mRNA下调，促凋亡因子Bax mRNA表达显著增加，抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表达显著降低(P < 0.000 1)，见图4。

参考文献

[1] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会. 中国骨质疏松症流行病学调查及“健康骨骼”专项行动结果发布[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2019, 12(4):317-318.
[2] KHOSLA S, HOFBAUER LC. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):898-907.
[3] TSAI JN, LEE H, DAVID NL, et al. Combination denosumab and high dose teriparatide for postmenopausal osteoporosis (DATA-HD): a randomised, controlled phase 4 trial. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(10):767-775.
[4] ENSRUD KE, CRANDALL CJ. Osteoporosis. Ann Intern Med. 2017;167(3):ITC17-ITC32.
[5] COSMAN F, CRITTENDEN DB, ADACHI JD, et al. Romosozumab Treatment in Postmenopausal Women with Osteoporosis. N Engl J Med. 2016;375(16):1532-1543.
[6] KAVEH S, HOSSEINIFARD H, GHADIMI N, et al. Efficacy and safety of Romosozumab in treatment for low bone mineral density: a systematic review and meta-analysis. Clin Rheumatol. 2020;39(11):3261-3276.
[7] ZHOU AX, HARTWIG JH, AKYUREK LM. Filamins in cell signaling, transcription and organ development. Trends Cell Biol. 2010;20(2):113-123.
[8] STOSSEL TP, CONDEELIS J, COOLEY L, et al. Filamins as integrators of cell mechanics and signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2(2):138-145.
[9] GORLIN JB, YAMIN R, EGAN S, et al. Human endothelial actin-binding protein (ABP-280, nonmuscle filamin): a molecular leaf spring. J Cell Biol. 1990;111(3): 1089-1105.
[10] 宋蕊, 张鑫悦, 周红辉,等. FLNB突变致胎儿期拉森综合征的遗传学研究[J]. 解放军医学院学报,2021,42(5):560-564.
[11] LI GH, KUNG AW, HUANG QY. Common variants in FLNB/CRTAP, not ARHGEF3 at 3p, are associated with osteoporosis in southern Chinese women. Osteoporos Int. 2010;21(6):1009-1020.
[12] WILSON SG, JONES MR, MULLIN BH, et al. Common sequence variation in FLNB regulates bone structure in women in the general population and FLNB mRNA expression in osteoblasts in vitro. J Bone Miner Res. 2009;24(12):1989-1997.
[13] 贾麒钰, 黄晓夏, 郭建,等. 整合素靶向肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究,2022,26(30):4780-4786 .
[14] HU J, LU J, LIAN G, et al. Filamin B regulates chondrocyte proliferation and differentiation through Cdk1 signaling. PLoS One. 2014;9(2):e89352.
[15] ZIEBA J, ZHANG W, CHONG JX, et al. A postnatal role for embryonic myosin revealed by MYH3 mutations that alter TGFβ signaling and cause autosomal dominant spondylocarpotarsal synostosis. Sci Rep. 2017:7:41803.
[16] SU YT, GAO C, LIU Y, et al. Monoubiquitination of filamin B regulates vascular endothelial growth factor-mediated trafficking of histone deacetylase 7. Mol Cell Biol. 2013;33(8):1546-1560.
[17] FUKUSHIMA K, PARTHASARATHY P, WADE EM, et al. Intragenic Deletions in FLNB Are Part of the Mutational Spectrum Causing Spondylocarpotarsal Synostosis Syndrome. Genes (Basel). 2021;12(4):528.
[18] VAN DER FLIER A, KUIKMAN I, KRAMER D, et al. Different splice variants of filamin-B affect myogenesis, subcellular distribution, and determine binding to integrin [beta] subunits. J Cell Biol. 2002;156(2):361-376.
[19] ZHANG W, HAN SW, MCKEEL DW, et al. Interaction of presenilins with the filamin family of actin-binding proteins. J Neurosci. 1998;18(3):914-922.
[20] 王茜, 颜举, 黄金勇,等. FilaminB在骨骼系统中的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2023,29(4):606-610.
[21] LU J, LIAN G, LENKINSKI R, et al. Filamin B mutations cause chondrocyte defects in skeletal development. Hum Mol Genet. 2007;16(14):1661-1675.
[22] 黄金勇, 吐尔逊江•达地汗, 郑靖杰, 等. 鹰嘴豆芽异黄酮对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1增殖及分化的研究[J]. 中国骨质疏松杂志,2022,28(12): 1723-1727,1734.
[23] JING WB, JI H, JIANG R, et al. Astragaloside positively regulated osteogenic differentiation of pre-osteoblast MC3T3-E1 through PI3K/Akt signaling pathway. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):579.
[24] VAN DER FLIER A, SONNENBERG A. Structural and functional aspects of filamins. Biochim Biophys Acta. 2001;1538(2-3):99-117.
[25] AYSCOUGH KR. In vivo functions of actin-binding proteins. Curr Opin Cell Biol. 1998;10(1):102-111.
[26] SIDDIQUI JA, PARTRIDGE NC. Physiological Bone Remodeling: Systemic Regulation and Growth Factor Involvement. Physiology (Bethesda). 2016;31(3):233-245.
[27] GEORGES S, RUIZ VELASCO C, TRICHET V, et al. Proteases and bone remodelling. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(1):29-41.
[28] SALHOTRA A, SHAH HN, LEVI B, et al. Mechanisms of bone development and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(11):696-711.
[29] WEIVODA MM, BRADLEY EW. Macrophages and Bone Remodeling. J Bone Miner Res. 2023;38(3): 359-369.
[30] XU X, LAI Y, HUA ZC. Apoptosis and apoptotic body: disease message and therapeutic target potentials. Biosci Rep. 2019;39(1):BSR20180992.
[31] JIANG Y, ZHANG P, ZHANG X, et al. Advances in mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of osteoporosis. Cell Prolif. 2021;54(1):e12956.
[32] LI Z, LI D, CHEN R, et al. Cell death regulation: A new way for natural products to treat osteoporosis. Pharmacol Res. 2023;187:106635.

引言

骨质疏松症是一种全身性骨退行性疾病，骨量的逐渐丧失和骨力学性能的显著退化是其最明显的两大特征，最终导致骨脆性增加和骨折的发生。随着人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为中国面临的重要公共健康问题[1-2]。然而，目前治疗骨质疏松症的药物存在治疗效果欠佳、不良反应明显、无法改善成骨细胞增殖分化、难以逆转骨质疏松症进程等诸多问题[3-4]。Romosozumab，目前针对骨质疏松常用的临床治疗药物，是一种具有双重功能的单克隆抗硬化素抗体[5]，其生物功能是基于结合和抑制硬化蛋白的形成，从而产生增加骨形成和减少骨吸收的疗效。然而，一项RCT研究显示，使用Romosozumab可导致骨关节炎、癌症和心血管事件等不良事件的发生[6]，所以对于骨质疏松的治疗目前仍然具有挑战性。
细丝蛋白B(Filamin B，FLNB)是二聚体肌动蛋白结合蛋白家族的成员，是一种重要的细胞骨架蛋白。FLNB参与多种关键生物学过程，例如细胞增殖、分化和迁移等[7]。临床病例报道显示，FLNB突变可导致脊椎-腕关节融合征、青少年特发性脊柱侧弯以及胎儿期拉森综合征等多种遗传性骨骼疾病的发生[8-10]。近期一项针对中国南方女性的研究发现，FLNB与骨质疏松的发生密切相关，其可能是调节骨密度的易感基因[11]。此外，在一项对767名女性、1 085名英国女性双胞胎和1 315名澳大利亚女性的研究中[12]，发现携带FLNB突变的患者其低创伤脆性骨折的发生率增加，这表明FLNB突变改变了女性的骨骼结构。WILSON等[12]通过单核苷酸多态性分析发现，FLNB与股骨颈和脊柱的骨密度之间有显著相关性。以上多项临床数据显示FLNB在骨骼系统发育过程中的重要性。骨密度是骨质疏松症的重要诊断标准之一，而FLNB又可调控骨密度的变化，说明FLNB在骨稳态过程发挥着重要调控功能。因此，深入探究FLNB在成骨细胞发育过程中的作用，对于深入了解骨质疏松的发病机制以及探索新型骨质疏松治疗靶点，挽救因骨质疏松症所致的骨质流失，具有重大的临床意义和经济社会效益。
目前，FLNB在骨代谢过程中调控成骨细胞的具体作用机制尚不清楚。此次研究以小鼠颅顶成骨前体细胞(MC3T3-E1)为研究对象，建立敲低FLNB的MC3T3-E1细胞稳转细胞系，探究FLNB对MC3T3-E1细胞的增殖及凋亡的影响，为深入了解FLNB在MC3T3-E1细胞中的作用机制以及在骨代谢过程中的生物调控功能奠定基础。期望为骨质疏松的治疗提供新的见解，寻找新的治疗靶点，挽救因骨质疏松所致的骨质流失。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年6月在新疆医科大学第一附属医院科技楼完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料小鼠颅顶成骨前体细胞MC3T3-E1购自普诺赛( 武汉，中国)；敲低FLNB腺病毒载体、促感剂Polybrene(广州源井生物公司，中国)。
1.3.2 主要实验试剂 α-MEM培养基、胎牛血清 (Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries，以色列)；青霉素-链霉素双抗溶液、嘌呤霉素(Biosharp，中国)；CCK-8 试剂盒(Bioss，中国)；PE偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒(Biosciences，美国)；总RNA提取试剂盒 (成都福际，中国)；PCR引物 (生工，中国)；TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)； FLNB抗体、GAPDH抗体(Proteintech，中国)；高效RIPA裂解液(Solarbio，中国)。
1.3.3 主要实验仪器 CO2恒温细胞培养箱、多功能酶标仪(Thermo，美国) ；倒置相差显微镜 (Zeiss，德国)；流式细胞仪 (BD，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 构建敲低FLNB的MC3T3-E1细胞模型取培养生长状态良好的MC3T3细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，每孔加入2 mL完全培养基。24 h后，加入1 mL含有5 μg/mL Polybrene(促感剂)的完全培养基以及20 μL的FLNB腺病毒(sh-FLNB1、sh-FLNB2、sh-FLNB3)，病毒滴度为1×108(TU/mL)，设sh-NC为空载体。加入病毒24 h后移除原有培养基，更换新鲜的完全培养基；48-72 h后于荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。若镜下有大量绿色荧光细胞时，更换含有嘌呤霉素5 μg/mL的完全培养基，筛选7 d。再更换为含有嘌呤霉素2.5 μg/mL的完全培养基培养细胞。
1.4.2 实时荧光定量PCR实验待转染的细胞生长至一定密度时，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录条件：25 ℃5 min、50 ℃30 min、85 ℃5 s。PCR的循环条件：95 ℃ 20 s预变性；95 ℃5 s、60 ℃30 s，共40个循环，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算靶基因的表达水平，标准化为内参基因GAPDH，实验重复3次，引物序列信息见表 1。

1.4.3 Western blot实验实验分为为空载体组(sh-NC)及sh-FLNB1、sh-FLNB2、sh-FLNB3组。sh-NC组加入空载体慢病毒，sh-FLNB1、sh-FLNB2、sh-FLNB3组分别加入sh-FLNB1慢病毒、sh-FLNB2慢病毒，sh-FLNB3慢病毒。用含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基培养细胞。待转染的细胞状态良好且生长至一定密度时，提取细胞总蛋白。用含有新鲜蛋白酶抑制剂PMSF(1 mmol/L)的RIPA缓冲液制备细胞裂解物。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中运行，转移到PVDF膜上，室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，用相应兔抗鼠一抗FLNB(1∶1 000)4 ℃ 摇床过夜，TBST洗涤，室温下山羊抗兔二抗(Proteintech，1∶5 000) 孵育1 h。采用ECL化学发光法显影。采用 ImageJ软件对各条带灰度值进行定量测定，实验重复3次。
1.4.4 CCK-8实验将Blank组、mc3t3组、sh-NC组、sh-FLNB组按照5×103个/孔细胞密度接种于96孔板，每孔加入200 μL完全培养基，每组5个复孔，置于培养箱中培养。Blank组为仅含α-MEM完全培养基无细胞；mc3t3组为单纯α-MEM完全培养基培养的细胞；sh-NC组、sh-FLNB组为含有嘌呤霉素2.5 μg/mL的α-MEM完全培养基培养的细胞。待培养至1，2，3 d，分别取出 96孔板，预热普通恒温培养箱，注入CCK-8溶液 (10 μL/孔)，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪A450测定吸光度，求得各组平均吸光度值，并以此为纵坐标，绘制吸光度值在不同时间改变的柱状图，实验重复3次。
1.4.5 细胞迁移实验完全培养基制备mc3t3组、sh-NC组、sh-FLNB组细胞悬液，以1×105个/孔细胞密度接种于6孔板，并添加α-MEM完全培养基1.5 mL，12 h后弃培养基，取100 μL枪头于每孔做3条平行横行划痕，居中划痕位于孔中央，PBS清洗。mc3t3组加入α-MEM 完全培养基培养，sh-NC组、sh-FLNB组加入含有嘌呤霉素2.5 μg/μL的α-MEM完全培养基，每组2个复孔。分别于0，24，48 h后镜下拍照，拍照时每条划痕应包括5个以上不同视野，对细胞迁移程度进行记录分析，实验重复3次。
1.4.6 流式鉴定细胞凋亡 mc3t3组加入α-MEM完全培养基培养，sh-NC组、sh-FLNB组加入含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的α-MEM完全培养基，以1×105个/孔细胞密度接种于6孔板。培养24 h，收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，每孔加入500 µL 1×Binding Buffer工作液和5 µL AnnexinV-PE、5 µL AnnexinV-7AAD，混匀后上机检测[13]，实验重复3次。
1.5 主要观察指标敲低FLNB对MC3T3-E1细胞增殖能力、迁移能力及凋亡的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 25.0统计学软件对结果数据进行分析，计量数据符合正态分布方差齐，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05时，认为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过新疆医科大学医学院统计学专家审核。

讨论

FLNB是一种细胞肌动蛋白结合蛋白Filamin家族的成员，通过交联肌动蛋白将细胞膜连接到细胞骨架并调节细胞内负责骨骼发育的信号通路来调节细胞骨架网络[8]。FLNB突变会导致多种骨骼疾病的发生。据病理研究显示，FLNB突变可导致多种病理过程发生，如降低软骨细胞和成纤维细胞的运动性以及影响血管生成[14-16]。大量研究表明，FLNB对软骨细胞具有重要调控功能，其通过调控细胞分布以及与糖蛋白Ibα胞浆尾部、微丝蛋白的相互作用，从而调节细胞骨架网络[17-20]。LU等[21]采用原位末端标记法，发现FLNB敲低小鼠的软骨细胞凋亡率增加。在FLNB基因缺陷小鼠中发现，软骨的骨骼发育不良，软骨内和膜内成骨延迟。以上结果表明，FLNB在软骨细胞发育、增殖、分化以及凋亡过程中发挥着重要的调控作用。
FLNB通过调节细胞骨架对软骨细胞实现调控作用，此外，细胞骨架网络对于成骨细胞发育也存在至关重要的作用。因为成骨前体细胞的迁徙和定向移位是骨重建过程中很重要的一个方面。由此，作者提出了FLNB对于成骨细胞增殖、迁移具有重要调控作用的假设。MC3T3-E1细胞因具有能够通过有序发育逐渐获得成熟成骨细胞的功能特征，是目前研究成骨细胞系最常用的体外模型之一[22-23]。此次研究在蛋白和基因层面的结果表明，构建了FLNB敲低的MC3T3-E1细胞稳定转染细胞株；CCK-8法和划痕实验结果显示，FLNB敲低的MC3T3-E1细胞同野生型MC3T3-E1细胞和空载体病毒的MC3T3-E1细胞相比，显示出细胞增殖能力下降、迁移速率显著降低，表明FLNB可以促进成骨细胞的增殖、迁移的发生。
FLNB可通过调节细胞骨架网络的功能为细胞提供机械支持，并且可通过细胞质的运输途径帮助信号转导肌动蛋白网络进行快速组装和拆卸从而使细胞发生迁移运动[24-25]。骨重建包括两个阶段：骨吸收和骨形成，这两个阶段之间的平衡对于维持骨量和系统矿物质稳态至关重要[26-27]。在骨重建过程中，首先经历的是骨吸收阶段，成骨细胞对骨细胞产生的信号或直接的内分泌激活信号作出反应，将破骨细胞前体募集到重塑部位[28]。随后进入逆转期，其显著特征是几乎所有破骨细胞都消失，由成骨细胞完全取代破骨细胞[29]。此次研究显示FLNB可以促进成骨细胞的增殖、迁移的发生，为以后开发干细胞疗法来加速骨重建的完成提供了新的见解。
此次研究在确定FLNB可调控MC3T3-E1细胞增殖及迁移的基础上，进一步探究了FLNB敲低对MC3T3-E1细胞凋亡的情况，结果表明敲低FLNB后，MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加，这意味着FLNB可能在MC3T3-E1细胞凋亡过程中扮演着重要角色。细胞凋亡是机体重要的自稳机制，它能主动清除不需要或异常的细胞，对胚胎发育、维持内环境稳态以及抵抗病原体等正常生理进程发挥重要的作用[30]。骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病，主要是由于破骨细胞的骨吸收和间充质系成骨细胞的骨形成之间的动态平衡失衡所致[31]。程序性细胞死亡(如细胞凋亡、自噬、铁凋亡、热凋亡和坏死)是一种细胞死亡过程，涉及一系列基因表达事件，这些事件通过决定骨细胞的命运，在调节骨代谢方面发挥着重要的作用[32]。此次研究结果显示，敲低FLNB后，MC3T3-E1细胞凋亡发生增加；且RT-PCR显示，促凋亡蛋白Bax的表达显著增加，而抑凋亡蛋白BCL-2的表达显著降低。这表明过度下调FLNB可能通过调控BCL-2家族的基因导致凋亡途径激活，破坏细胞内环境的稳定，调控细胞程序性死亡，从而影响骨质整合。
此次研究仅验证FLNB对成骨细胞增殖、迁移、凋亡变化的影响，尚未涉及FLNB调控成骨细胞分化以及具体相关机制的研究，将在后续实验中进行更加深入的探索。
综上所述，此次研究发现FLNB可以调控成骨细胞的迁移、增殖以及凋亡的发生，为深入了解FLNB在骨骼发育过程的调控功能奠定基础，有望为将来针对骨质疏松症的干细胞疗法开发新的治疗靶点及FLNB所致遗传性骨骼疾病的治疗提供新的诊疗思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

敲低细丝蛋白B对小鼠颅顶成骨前体细胞增殖、迁移及凋亡的影响

Effects of filament B knockdown on proliferation, migration and apoptosis of mouse MC3T3-E1 cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[2]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[3]	梅静怡, 刘江, 肖聪, 刘鹏, 周浩浩, 林展翼. 组织工程血管构建过程中平滑肌细胞增殖变化及代谢模式[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1043-1049.
[4]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[5]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[6]	侯增涛, 董志伟, 张金锋, 杨晓慧, 范筱. 富血小板纤维蛋白调控细胞凋亡修复大鼠膝骨关节炎损伤软骨[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5167-5171.
[7]	卢梦雅, 伍闲, 佘泽宇, 夏帅, 卢曼, 杨永晖. 针刀调控线粒体途径软骨细胞凋亡防治大鼠膝骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5190-5195.
[8]	孙青峰, 白硕, 张振, 申亮, 高蓓瑶, 葛瑞东. 雌激素对肌腱病影响的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5231-5237.
[9]	吴天, 赵越, 胡蓉. 携双抗体纳米微泡对卵巢癌细胞增殖活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 341-346.
[10]	李立斯, 张成栋, 李小龙, 叶姿妤, 蒲超, 杨在君, 匙峰, 肖东琴. 双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 373-379.
[11]	钱龙杰, 苏文利, 朱文献, 王毅鑫. 沉默信息调节因子1激活剂SRT1720减轻大鼠急性颅脑损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4447-4454.
[12]	姜煜, 徐林, 赵亚林, 刘港, 张亚奇, 白惠中, 任敬佩, 曾杰, 穆晓红. 舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4477-4483.
[13]	周明瀚, 张慧, 郑先波, 徐无忌. 不同氧浓度下髓核细胞中PI3K/Akt/HIF-1α信号通路表达对延缓椎间盘退变的意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4491-4497.
[14]	丁强, 熊波, 刘金富, 田照, 容向宾, 陈立民, 陶红成, 李豪, 曾平. 泛凋亡因子在骨质疏松症中的诊断标记物及亚型分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4505-4510.
[15]	陈晨, 郑润泉, 张贵春. 大黄素对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4528-4534.