沉默转录激活因子4抑制脑出血后神经元坏死性凋亡的体外实验

doi:10.12307/2024.147

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 2030-2035.doi: 10.12307/2024.147

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沉默转录激活因子4抑制脑出血后神经元坏死性凋亡的体外实验

冯登峰，魏民，张恒柱

扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001

收稿日期:2023-03-24 接受日期:2023-05-05 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 张恒柱，博士，教授，主任医师，博士生导师，扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001
作者简介:冯登峰，男，1996年生，浙江省宁波市人，汉族，扬州大学在读硕士，主要从事自发性脑损伤的基础研究。
基金资助:
江苏省“333 高层次人才”培养项目(BRA2019026)，项目负责人：张恒柱；江苏省卫生健康委员会(H2018064)，项目负责人：张恒柱

Silencing of activating transcription factor 4 inhibits neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage in vitro

Feng Dengfeng, Wei Min, Zhang Hengzhu

Clinical Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2023-03-24 Accepted:2023-05-05 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Zhang Hengzhu, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Clinical Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
About author:Feng Dengfeng, Master candidate, Clinical Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Supported by:
Jiangsu Province “333 High-Level Talents” Training Project, No. BRA2019026 (to ZHZ); Jiangsu Provincial Health Commission, No. H2018064 (to ZHZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

继发性脑损伤：近年来，神经科学专家聚焦于脑出血的病理生理过程和损伤机制，提出了对继发性脑损伤的定义，指的是血液进入脑组织代谢而诱发的一系列病理损伤，包括血红蛋白毒性、氧化应激、神经炎症、细胞程序性死亡等。因此，除了急性期手术处理，应将焦点放在脑出血基础转化研究，寻找病理相关的治疗靶点。
坏死性凋亡：是指当正常凋亡途径被抑制时，发生的一种受调控的由RIP1和RIP3激酶介导的坏死性细胞死亡方式，又叫程序性坏死。既以坏死的形态为特征，如细胞肿胀和破裂，又与细胞凋亡类似，与坏死不同的是，坏死性凋亡有明确的细胞信号转导机制，而坏死没有。坏死性凋亡参与了脑出血所致的继发性脑损伤，靶向坏死性凋亡相关分子的治疗已在不同动物模型和不同细胞类型中得到验证。

背景：脑出血介导的神经元坏死性凋亡是继发性脑损伤的重要原因。转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是转录激活因子家族成员之一，在脑出血后的继发性脑损伤中扮演重要角色。然而，ATF4在脑出血后的神经元坏死性凋亡中的机制有待明确。

目的：探索沉默ATF4基因对脑出血后神经元坏死性凋亡的影响。
方法：共同培养HT-22小鼠海马神经元细胞系和BV-2小鼠小胶质细胞系，利用氯化血红素刺激神经元构建脑出血体外模型。在0-100 μmol/L区间设置氯化血红素干预细胞的浓度梯度，通过MTT实验评估氯化血红素处理24 h后对神经元细胞活力的影响。然后将共培养细胞分为4组：空白对照组不加任何干预，对照组加入50 μmol/L氯化血红素处理，其余2组在加入氯化血红素48 h前分别用阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)、ATF4小干扰RNA(ATF4 siRNA)干预细胞，再用50 μmol/L氯化血红素处理细胞24 h后，利用PI/Hoechst染色检测神经元坏死性凋亡情况，Western blot检测ATF4、RIP3、MLKL的蛋白表达，双重免疫荧光染色定位于神经元，观察神经元坏死性凋亡的发生程度及ATF4的调控作用。

结果与结论：①50 μmol/L 氯化血红素可以较大程度诱导神经元坏死性凋亡；②对照组和NC siRNA组的PI+/Hoechst+细胞数量高于空白对照组(P < 0.000 1)，ATF4 siRNA组PI+/Hoechst+细胞数量低于对照组(P < 0.000 1)；③与对照组相比，ATF4 siRNA组在抑制ATF4蛋白表达(P < 0.001)的同时，也抑制了RIP3、MLKL蛋白表达(P < 0.001)；④通过对神经元荧光染色定位，与对照组相比，ATF4 siRNA组的RIP3、MLKL蛋白表达明显降低(P < 0.000 1)；⑤结果表明，通过沉默ATF4基因可以直接或间接抑制脑出血后神经元坏死性凋亡相关基因的表达，起到缓解继发性脑损伤的作用。

https://orcid.org/0000-0002-6416-5694 (冯登峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脑出血, 继发性脑损伤, 神经元, ATF4, 坏死性凋亡, 小干扰RNA

Abstract: BACKGROUND: Neuronal necroptosis induced by intracerebral hemorrhage is an important cause of secondary brain injury. Activating transcription factor 4 (ATF4) is a member of the transcription activator family, which plays an important role in secondary brain injury after intracerebral hemorrhage. However, the mechanism of ATF4 in neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of ATF4 silencing (ATF4 small interfering RNA, ATF4 siRNA) on neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage.
METHODS: The HT-22 mouse hippocampal neuron cell line and the BV-2 mouse microglial cell line were co-cultured, and hemin was used to mimic an in vitro model of intracerebral hemorrhage. A gradient concentration of hemin was used to treat cells and was set in the interval of 0-100 μmol/L, and the cell viability was evaluated by MTT assay after 24 hours of administration of hemin. The cells were divided into four groups: the blank control group without any intervention; the control group was treated with hemin (50 μmol/L), and the other two groups were treated with negative control small interfering RNA (NC siRNA) and ATF4 small interfering RNA (ATF4 siRNA) 48 hours before administration of hemin. After the cells were treated with hemin (50 μmol/L) for 24 hours, PI/Hoechst staining was used to detect neuronal necroptosis. Western blot assay was used to detect the protein expression of ATF4, receptor-interacting protein 3 (RIP3), and mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL), and double immunofluorescent staining was located in neurons to observe the level of neuronal necroptosis and the regulatory effect of ATF4 on it.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 50 μmol/L of hemin could induce neuronal necroptosis to a greater extent. (2) The number of PI+/Hoechst+ cells in the control group and NC siRNA group was higher than that in the blank control group (P < 0.000 1). The number of PI+/Hoechst+ cells in the ATF4 siRNA group was lower than that in the control group (P < 0.000 1). (3) Compared with the control group, the ATF4 siRNA group not only inhibited the expression of ATF4 protein (P < 0.001), but also inhibited the expression of RIP3 and MLKL protein (P < 0.001). (4) Through double immunofluorescent staining, compared with the control group, the protein expression of RIP3 and MLKL was significantly reduced in the ATF4 siRNA group (P < 0.000 1). (5) The results show that the silencing of the ATF4 gene can directly or indirectly inhibit the expression of genes related to neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage, and play a vital role in alleviating secondary brain injury.

Key words: intracerebral hemorrhage, secondary brain injury, neuron, activating transcription factor 4, necroptosis, small interfering RNA

中图分类号:

冯登峰, 魏民, 张恒柱. 沉默转录激活因子4抑制脑出血后神经元坏死性凋亡的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 2030-2035.

Feng Dengfeng, Wei Min, Zhang Hengzhu. Silencing of activating transcription factor 4 inhibits neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 2030-2035.

图/表（结果） 5

2.1 氯化血红素对神经元增殖的影响为了探索构建脑出血体外模型所用到氯化血红素的有效浓度，实验选用不同浓度(0，10，25，50，100 μmol/L) 氯化血红素处理共培养细胞24 h，MTT实验结果显示，细胞活力随着氯化血红素浓度上升呈下降的趋势，与空白对照组相比，50 μmol/L氯化血红素对神经细胞增殖活力有明显的抑制作用，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图1。与100 μmol/L氯化血红素组相比，50 μmol/L氯化血红素作为安全范围内的最低浓度，对神经细胞增殖活力的抑制更有效，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 沉默ATF4对脑出血后神经元坏死性凋亡数量的影响与空白对照组相比，其余3组神经细胞坏死性凋亡数量(PI+/Hoechst+)明显增多(P < 0.000 1)；与对照组相比，NC siRNA组PI+/Hoechst+细胞数量无明显差异；与对照组相比，ATF4 siRNA组神经细胞坏死性凋亡数量明显减少(P < 0.001)，见图2。

2.3 沉默ATF4对脑出血后神经细胞坏死性凋亡蛋白表达的影响与空白对照组相比，用氯化血红素构建脑出血体外模型24 h后，ATF4蛋白表达明显升高(P < 0.000 1)；与对照组相比，ATF4 siRNA组ATF4蛋白表达被明显抑制(P < 0.001)，见图3。为了进一步明确沉默ATF4，对脑出血后神经细胞坏死性凋亡蛋白表达的影响，由Western blot结果可以看出，与空白对照组相比，对照组、NC siRNA组和ATF4 siRNA组的神经细胞坏死性凋亡蛋白(RIP3、MLKL)表达明显上升(P < 0.000 1)；与对照组相比，ATF4 siRNA组的坏死性凋亡蛋白表达明显被抑制(P < 0.001)，见图3。

2.4 沉默ATF4对脑出血后神经元坏死性凋亡的调控作用为了将ATF4对脑出血后神经细胞坏死性凋亡的调控作用进一步定位于神经元，而不是对小胶质细胞调控而产生的效应，使用双重免疫荧光染色(NeuN+坏死性凋亡蛋白，NeuN是神经元的标志性抗体)。各组NeuN、RIP3染色图片见图4A，首先通过NeuN阳性细胞定位为神经元，再对各组之间RIP3荧光密度进行对比，脑出血后神经元坏死性凋亡较空白对照组明显升高(P < 0.000 1)，而ATF4 siRNA组的神经元坏死性凋亡较对照组明显降低(P < 0.000 1)，见图4B；MLKL的免疫荧光染色结果同RIP3，见图5A，B。上述结果进一步证实了ATF4对脑出血后神经元坏死性凋亡具有调控作用。

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引言

脑出血一般代指的是自发性脑出血，是患者服用药物或自身病理状态等各种原因而非创伤导致的脑血管破裂，进一步造成脑组织内出血[1]。脑出血是出血性脑卒中发病率最高的亚型，其致死率、致残率极高。在欧美发达国家，脑出血的平均发病率占所有卒中的10%-15%，而在以中国为首的发展中国家，占比高达20%-30%[1]。目前对于脑出血后的诊疗策略主要是手术清除血肿和术后临床护理，但经过长期不断改良的临床实践发现，这些并不能明显改善脑出血患者的预后[2]。近年来，神经外科领域聚焦于脑出血的病理生理机制，提出脑出血后血肿直接导致原发性脑损伤，而后续血肿诱导的继发性脑损伤主要包括铁离子毒性、氨基酸兴奋性毒性、细胞自噬、氧化应激、炎症反应、神经细胞凋亡、神经细胞坏死性凋亡等一系列病理生理过程，将进一步影响脑出血后的神经功能缺损[3-4]。
坏死性凋亡是细胞在促炎因子刺激下发生的程序性坏死[5]。小胶质细胞是神经系统中主要的免疫细胞，当机体处于病理状态时，小胶质细胞被激活，吞噬凋亡的神经元或释放大量炎症因子[6]。首先，炎症因子如肿瘤坏死因子α与其受体结合，再募集蛋白分子上的死亡结构域，三者形成复合物，激活下游细胞死亡途径[7]。当受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)蛋白通过其死亡结构域被募集，将进一步募集受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)，形成参与坏死性凋亡的复合体，被称为“坏死体”[8]。多项关于缺血性脑卒中的研究报道，继发性脑损伤中的血液代谢产物会进一步导致神经细胞坏死性凋亡[9-11]。
在哺乳动物神经细胞中，激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)参与多种生理活动，如代谢和能量平衡、应激反应、学习和记忆等[12–14]。当细胞处于应激状态时，ATF4的表达升高，将可能进一步诱导C/EBT同源蛋白(C/EB phomologous protein，CHOP)，促进细胞凋亡[15]。目前，大部分研究着眼于脑出血后ATF4促进神经元凋亡影响继发性脑损伤[16–18]，而其在坏死性凋亡等其他继发性损伤机制中的研究较少。因此，探索ATF4基因在脑出血后继发性脑损伤中对神经元坏死性凋亡的调控作用，将对后期的临床治疗有重要意义。在该实验中，使用小干扰RNA选择性沉默ATF4基因，探讨ATF4基因在脑出血后对神经元坏死性凋亡的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2022年7月至2023年3月在江苏省苏北人民医院医学实验中心完成。
1.3 材料小鼠海马神经元细胞系HT-22、小鼠小胶质细胞系BV-2(普诺塞，中国)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶消化液、青霉素/链霉素混合液、碘化丙啶染色试剂盒、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国)；胎牛血清(Clark，美国)；氯化血红素(Merck，美国)；GAPDH抗体(塞维尔，中国)；ATF4、RIP3、MLKL抗体和山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology，美国)；MTT试剂盒(索莱宝，中国)；ChemiDoc化学成像发光系统(Bio-Rad，美国)；酶标仪(Tecan，中国)；正置荧光显微镜、倒置荧光显微镜(Carl Zeiss，德国)等。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养 HT-22细胞和BV-2细胞复苏后，用含体积分数10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM完全培养基置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，每2 d进行培养基全换液，待细胞在培养皿上生长到80%密度以上，进行1∶4传代或冻存。
1.4.2 脑出血体外模型构建将HT-22细胞和BV-2细胞(第10代)消化，以5∶1比例混合后按1×107细胞数量接种于100 mm培养皿中培养12 h，于共培养细胞体系中添加氯化血红素干预24 h构建脑出血体外模型，进行后续实验。
1.4.3 MTT检测细胞增殖活力为了探索构建脑出血体外模型所用到氯化血红素的有效浓度，进行MTT实验检测细胞增殖活力，将HT-22和BV-2细胞消化后共培养(5∶1)于96孔板，细胞密度为每孔5×103，分为对照组和氯化血红素干预组(浓度梯度设置为0，10，25，50，100 μmol/L，用DMEM完全培养基稀释)，每组设置6个重复副孔，恒温培养箱中培养24 h，隔天换液后，每孔加入10 μL MTT溶液于恒温培养箱中继续培养2 h，使用酶标仪测定在490 nm波长处的吸光度值(A490 nm)。
1.4.4 siRNA沉默实验在HT-22细胞和BV-2细胞共培养体系(5∶1)中加入阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)、ATF4小干扰RNA(ATF4 siRNA)干预48 h，siRNA稀释至终浓度为20 μmol/L，弃除含有干扰RNA的培养基，PBS多次洗涤后，加入含有50 μmol/L氯化血红素的培养基构建脑出血体外模型，继续在孵箱中连续培养24 h。ATF4 siRNA序列如下：正义序列，5’- GGA GUU AGU UUG ACA GCU AAA-3’；反义序列，5’- UAG CUG UCA AAC UAA CUC CAG-3’。
1.4.5 PI/Hoechst染色将HT-22细胞和BV-2细胞消化后共培养(5∶1)于6孔板中，细胞密度为每孔1×106，将细胞分为4组：空白对照组添加DMEM完全培养基，对照组DMEM完全培养基中加入50 μmol/L氯化血红素处理，其余2组在加入50 μmol/L氯化血红素48 h前分别用阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)、ATF4小干扰RNA(ATF4 siRNA)干预细胞。干预完成后弃除旧培养基，PBS洗涤3次，按比例加入细胞染色缓冲液、 Hoechst染色液和PI染色液(1 mL缓冲液/5 μL Hoechst/5 μL PI)，在4 ℃冰箱中静置染色30 min，PBS洗涤1次，在倒置荧光显微镜下观察。
1.4.6 细胞免疫荧光染色将细胞爬片提前放置于24孔板内，将HT-22细胞和BV-2细胞消化后共培养于24孔板，细胞密度为每孔1×105，将细胞分为4组：空白对照组加入DMEM完全培养基培养，对照组DMEM完全培养基中加入50 μmol/L氯化血红素处理，其余2组在加入50 μmol/L氯化血红素48 h前分别用阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)、ATF4小干扰RNA(ATF4 siRNA)干预细胞，每组3个副孔，氯化血红素干预24 h后，PBS润洗爬片3次，每次5 min；吸干表面水分，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS润洗3次，每次5 min；吸干表面水分，用0.3% Triton X-100破膜20 min，PBS润洗3次，每次5 min；吸干表面水分，用5% BSA封闭2 h；抗原-抗体反应：提前根据说明书按比例稀释一抗(NeuN+RIP3，NeuN+MLKL，稀释终浓度均为1∶200)，滴加于细胞爬片上，置于4 ℃冰箱中过夜孵育；第2天回收一抗后，PBS润洗切片3次，每次5 min；提前根据说明书按比例稀释二抗(驴抗鸡荧光二抗+山羊抗兔荧光二抗，稀释终浓度为1∶1 000)，吸干爬片表面水分，将二抗滴加于细胞爬片上，室温孵育2 h，PBS润洗切片5次，每次5 min(滴加二抗以后所有过程应避光)；吸干爬片表面水分后，用含DAPI的抗荧光淬灭剂封固，正置荧光显微镜下观察。
1.4.7 Western blot检测坏死性凋亡蛋白表达将HT-22细胞和BV-2细胞消化后共培养(5∶1)于6孔板中，细胞密度为每孔1×106，将细胞分为4组：空白对照组添加DMEM完全培养基，对照组DMEM完全培养基中加入50 μmol/L氯化血红素处理，其余2组在加入50 μmol/L氯化血红素48 h前分别用阴性对照小干扰RNA(NC siRNA)、ATF4小干扰RNA(ATF4 siRNA)干预细胞。干预完成后，弃除旧培养基，PBS清洗细胞3次，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液收集蛋白，冰上反应30 min，在4 ℃离心机中以12 000 r/min离心20 min，收集上清液，利用BCA蛋白定量试剂盒、酶标仪测定各组吸光度值计算蛋白浓度，将各组间蛋白定量到20 μg上样量，100 ℃蛋白变性后储存样品；分别在60 V恒压条件下进行蛋白浓缩，120 V恒压条件下进行蛋白分离，电泳完成后，将电泳后的凝胶与PVDF膜于200 mA恒流、4 ℃条件下进行转膜1.5 h；转膜完成后用TBST稀释的5% BSA溶液室温环境中封闭1 h；将条带按照适当位置裁切后置于ATF4、RIP3、MLKL抗体(均以1∶1 000稀释)、GAPDH抗体(1∶2 000稀释)中4 ℃孵育过夜，TBST洗涤条带3次，每次10 min，然后在二抗(山羊抗兔二抗，以1∶1 000稀释)中孵育1 h，再次用TBST洗涤条带3次，每次10 min；于化学成像发光系统将条带显影后，使用Image J软件进行分析。
1.5 主要观察指标 ①MTT实验测定不同浓度氯化血红素(0-100 μmol/L)对神经元细胞增殖能力的影响；②PI/Hoechst染色检测沉默ATF4对神经细胞坏死性凋亡数量的影响；③Western blot检测沉默ATF4后对神经细胞坏死性凋亡蛋白表达的影响；④细胞免疫荧光检测沉默ATF4基因后神经元坏死性凋亡的发生程度。
1.6 统计学分析使用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析，并制作柱状图表，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章中统计学方法已由扬州大学统计学专家审核。

讨论

脑出血发生后，会出现原发性脑损伤和继发性脑损伤。前者的主要治疗手段是手术清除血肿和术后紧密的临床护理[2]，但患者的预后仍然没有得到较大的改善，后者是由血肿诱发的一系列病理过程，包括细胞自噬、炎症反应、神经元凋亡等[19]。近年来，神经外科领域聚焦于脑出血的病理生理机制，不少动物和细胞研究证实，靶向脑出血后的继发性脑损伤将对患者预后的神经功能缺损有保护作用[4，20-22]。因此，对脑出血更有效的治疗需要对继发性脑损伤的治疗靶点进行更全面的探索。
神经细胞死亡是发生继发性脑损伤的一个重要原因[23-24]。坏死性凋亡是一种新近提出的细胞程序性死亡方式，是指当正常凋亡途径被抑制时，发生的一种受调控的由RIPK1、RIPK3和MLKL 3种酶介导的坏死性细胞死亡方式，既以坏死的形态为特征，如细胞肿胀和破裂，又与细胞凋亡类似，与坏死不同的是，坏死性凋亡有明确的细胞信号转导机制，所以其又被称为程序性坏死[25-27]。自坏死性凋亡首次报道以来只有10余年时间，对其相关分子机制的认识有了很大进展。坏死性凋亡参与了脑出血所致的继发性脑损伤，脑出血后神经细胞坏死性凋亡由神经炎症诱发，在继发性脑损伤中起着重要作用[10，28]。在神经系统中，小胶质细胞扮演着免疫细胞的角色，机体处于病理状态时小胶质细胞被激活成M1炎性表型，释放大量炎症因子，启动炎症信号的级联反应。小胶质细胞激活后会分泌大量炎症因子如肿瘤坏死因子α，后者与肿瘤坏死因子受体α结合后进一步募集RIPK1，激活下游细胞死亡途径[7]。在既往的研究中显示，神经元在体内由于所处的复杂环境，在病理状态下得以呈现相关的表现，尤其是大脑中的常驻免疫细胞，小胶质细胞的激活会对中枢神经系统的许多病理变化起到关键作用[29-33]。多项体外研究刺激小胶质细胞后，将其培养基上清用于诱导神经细胞坏死性凋亡[9]。该研究在体外将神经元与小胶质细胞共培养，再对它们给予氯化血红素刺激以激活坏死性凋亡现象。
ATF4在神经系统中参与众多生理过程，包括能量平衡、应激反应等[34]。当细胞处于氨基酸缺失、氧化应激和内质网应激状态时，ATF4表达上调，并能增强细胞缺氧耐受能力，进而调节病理发生发展的相关过程。而当细胞长时程处于应激状态时，ATF4诱导CHOP表达，促进细胞凋亡。以往的研究表明，脑出血后神经细胞处于氧化应激、内质网应激等应激状态时，激活ATF4后进一步诱导CHOP蛋白表达，促进神经元凋亡[35]。在缺血再灌注损伤的小鼠模型中发现，造模成功小鼠发生内质网应激，激活ATF4后进一步介导神经细胞坏死性凋亡[36]。另外，ESTORNES 等[37]研究也表明，内质网应激可以通过RIPK1/RIPK3/MLKL通路介导坏死性凋亡。此次研究在脑出血体外模型中发现，脑出血发生后，PI阳性细胞(PI+/Hoechst+)明显增多，表明神经元坏死性凋亡增加，而对神经元选择性沉默ATF4后，PI阳性细胞(PI+/Hoechst+)明显减少；Western blot结果显示脑出血后ATF4表达上调，与此同时，神经细胞坏死性凋亡蛋白表达也增加，而使用ATF4 siRNA暂时沉默该基因后，坏死性凋亡现象得到相对抑制。通过细胞免疫荧光实验定位神经元，结果与Western blot实验结果同步，说明了ATF4对于调控脑出血后神经元坏死性凋亡有着重要作用。
尽管这项研究说明了在脑出血后的继发性脑损伤中，通过抑制ATF4基因表达，可以直接或间接减少神经元坏死性凋亡，起到保护神经元的作用。但该研究仍存在局限：第一，ATF4可以由多条通路激活[38-40]，比如经典的内质网应激中的蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kunase，PERK)信号通路，是否由内质网应激介导神经元坏死性凋亡仍未知；第二，ATF4是否以直接或间接的方式影响脑出血后神经元坏死性凋亡。MENG等[35]研究发现ATF4通过激活CHOP蛋白表达，进而促进脑出血后的神经元凋亡；虽然此次研究证明了通过沉默ATF4可以抑制脑出血后神经元坏死性凋亡，这为探索脑出血后继发性脑损伤的靶向治疗提供了更完善的知识，然而如果将ATF4直接或间接通过其他基因作用于坏死性凋亡通路研究，将使该靶点治疗运用于临床更具有意义；第三，该研究仅在体外探究了ATF4对神经元坏死性凋亡的影响，体内相关实验仍有待完善。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

沉默转录激活因子4抑制脑出血后神经元坏死性凋亡的体外实验

Silencing of activating transcription factor 4 inhibits neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage in vitro

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