多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

doi:10.12307/2023.751

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5505-5509.doi: 10.12307/2023.751

• 生物材料基础实验 basic experiments of biomaterials • 上一篇下一篇

多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

罗张荣1，曹亮1，张毅1，皮文俊1，李青2

1贵州医科大学临床医学院，贵州省贵阳市 550025；2贵州医科大学附属医院创伤骨科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-10-12 接受日期:2022-12-12 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-22
通讯作者: 李青，博士，教授，贵州医科大学附属医院创伤骨科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:罗张荣，男，1996年生，四川省达州市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960234，81860516)，项目负责人：李青

Characteristics of neural stem cells of cerebrospinal fluid-contacting neurons verified by multimodal imaging molecules in vitro

Luo Zhangrong1, Cao Liang1, Zhang Yi1, Pi Wenjun1, Li Qing2

1School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 2Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-10-12 Accepted:2022-12-12 Online:2023-12-08 Published:2023-04-22
Contact: Li Qing, MD, Professor, Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Luo Zhangrong, Master candidate, School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960234, 81860516 (to LQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

多模态影像分子：集合了2种及以上成像技术。该实验中的多模态影像分子包含了荧光成像和生物发光成像2种成像方式，可在体内、外示踪触液神经元。前者成像原理是影像分子在触液神经元中表达的绿色荧光蛋白经入射光照射后发出一定波长的出射光，通过荧光显微镜在体外示踪触液神经元，后者成像原理是影像分子在触液神经元中表达的荧光素酶与相应底物反应后发出探针信号，通过小动物活体成像仪在体内示踪触液神经元。
触液神经元：是脊髓中央管内直接接触脑脊液并穿越实质的神经元亚群，100年前该细胞群被首次发现至今，其功能还不甚明了。以往研究认为其主要功能是机械和化学感受器，感受脑脊液的理化性质变化。课题组近期在体内、外首次发现触液神经元具有神经干细胞潜能。由于触液神经元在哺乳动物体内数量稀少，在脊髓中央管附近的细胞占比不超过5%，且目前尚无触液神经元细胞系的建立，因此需要获得纯度高且细胞活性好的触液神经元，同时获得的触液神经元能在体内、外被活体示踪，为将来运用触液神经元体内移植治疗脊髓损伤提供可靠细胞来源。

背景：最近研究发现位于脊髓中央管附近的接触脑脊液神经元(简称触液神经元)具有神经干细胞潜能，但触液神经元在体外研究中纯度不高，且目前尚无体外示踪技术证明其神经干细胞特性。
目的：通过多模态影像分子筛选并在体外验证触液神经元的神经干细胞特性。
方法：根据触液神经元特异性表达Pkd2l1基因，针对Pkd2l1基因上游启动子设计一种使触液神经元特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的多模态影像分子慢病毒(Lentivirus-Pkd2l1-GFP-puromycin-luciferase)。从出生24 h 内C57BL/6 小鼠延髓组织中提取出原代神经干细胞贴壁培养，用多模态影像分子病毒转染含有触液神经元的原代神经干细胞，通过嘌呤霉素筛选并纯化触液神经元。对筛选纯化的触液神经元进行体外悬浮培养并连续传代4代以上，免疫荧光检测第3代触液神经元与神经干细胞标记物Nestin、Sox2共表达情况。通过对第3代触液神经元诱导分化培养，免疫荧光检测触液神经元与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4的共表达情况。

结果与结论：成功构建出多模态影像分子慢病毒，并且筛选纯化后的触液神经元能够存活、增殖并表达绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白阳性触液神经元能在体外连续传代4代以上，并表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2。诱导分化后，绿色荧光蛋白阳性触液神经元表达神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4。结果表明：多模态影像分子病毒能特异性标记触液神经元，触液神经元在体外具有自我更新、多向分化能力，通过多模态影像分子在体外成功验证触液神经元具有神经干细胞特性。

https://orcid.org/0000-0003-3259-2306 (罗张荣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 触液神经元, 神经干细胞, 多模态影像分子, 慢病毒, Pkd2l1

Abstract: BACKGROUND: Recently, it was found that cerebrospinal fluid-contacting neurons near the central canal of the spinal cord have the potential of neural stem cells, but the purity of cerebrospinal fluid-contacting neurons in the in vitro research is not high, and there is no in vitro tracing technology to prove their neural stem cell characteristics.
OBJECTIVE: To verify the characteristics of neural stem cells of cerebrospinal fluid-contacting neurons by multimodal imaging molecules in vitro.
METHODS: According to the specific expression of the Pkd2l1 gene in cerebrospinal fluid-contacting neurons, a multimodal imaging molecular lentivirus was designed to specifically express a green fluorescent protein (GFP) in cerebrospinal fluid-contacting neurons according to the upstream promoter of Pkd2l1 gene. The primary neural stem cells were extracted from the medulla oblongata of C57BL/6 mice within 24 hours of birth, then the primary neural stem cells containing cerebrospinal fluid-contacting neurons were transfected with multimodal imaging molecular virus, and the cerebrospinal fluid-contacting neurons were screened and purified by puromycin. The screened and purified cerebrospinal fluid-contacting neurons were suspended in vitro and passaged continuously for more than four generations. Immunofluorescence was used to observe whether the third generation of cerebrospinal fluid-contacting neurons co-expressed with neural stem cell markers Nestin and Sox2. The third generation of cerebrospinal fluid-contacting neurons was induced to differentiate, and the co-expression of cerebrospinal fluid-contacting neurons with neuronal marker NeuN, astrocyte marker S100 β and oligodendrocyte marker O4 was detected by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: The multimodal imaging molecular lentivirus was successfully constructed, and the purified cerebrospinal fluid-contacting neurons could survive, proliferate and express GFP. GFP+ cerebrospinal fluid-contacting neurons could be passaged continuously for more than four generations in vitro, and express neural stem cell markers Nestin and Sox2. After induced differentiation, GFP+ cerebrospinal fluid-contacting neurons expressed neuron marker NeuN, astrocyte marker S100β and oligodendrocyte marker O4. It is concluded that cerebrospinal fluid-contacting neurons can be specifically labeled by multimodal image molecular viruses and show the ability of self-renewal and multidirectional differentiation, which adequately proves that cerebrospinal fluid-contacting neurons have the characteristics of neural stem cells in vitro.

Key words: cerebrospinal fluid-contacting neuron, neural stem cell, multimodal imaging molecule, lentivirus, Pkd2l1

中图分类号:

罗张荣, 曹亮, 张毅, 皮文俊, 李青. 多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5505-5509.

Luo Zhangrong, Cao Liang, Zhang Yi, Pi Wenjun, Li Qing. Characteristics of neural stem cells of cerebrospinal fluid-contacting neurons verified by multimodal imaging molecules in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5505-5509.

图/表（结果） 3

2.1 成功构建出多模态影像分子慢病毒 Pkd2l1启动子报告基因慢病毒载体模式图设计完成后，由上海吉凯基因化学技术有限公司包装完成。该影像分子慢病毒载体可以在CSF-cNs内特异性表达嘌呤霉素抗性基因，通过嘌呤霉素可筛选纯化CSF-cNs；表达绿色荧光蛋白基因，借助荧光显微镜可体外示踪CSF-cNs；表达荧光素酶基因，与荧光素底物反应后可在小动物活体成像仪下体内示踪CSF-cNs，用于将来的CSF-cNs体内移植后的动态示踪。
2.2 多模态影像分子能够纯化并特异性示踪CSF-cNs 在体外分离出含有CSF-cNs的原代神经细胞并进行贴壁培养24 h后，加入多模态影像分子慢病毒转染CSF-cNs，用嘌呤霉素筛选CSF-cNs，见图2A。在嘌呤霉素作用0，48，72 h后，贴壁的神经细胞逐渐减少，在72 h后只有少量的细胞存活下来，见图2B。将嘌呤霉素筛选后存活的神经细胞继续扩增培养后，在倒置荧光显微下观察到这些细胞表达绿色荧光蛋白，见图2C。将贴壁细胞消化后悬浮培养，3 d后就可见神经球的形成，在倒置荧光显微下观察到这些神经球表达绿色荧光蛋白，见图2D。为了进一步证实这些神经球是由CSF-cNs形成的，将神经球消化成单个细胞后，通过细胞免疫荧光检测是否表达CSF-cNs特异性标记物Pkd2l1，结果显示这些绿色荧光蛋白阳性细胞表达Pkd2l1，见图2E，其中GFP+ Pkd2l1+细胞在所有GFP+细胞中的占比高达99.8%，见图2F。因此，该实验证明了多模态影像分子能够纯化并特异性示踪CSF-cNs，并将GFP作为CSF-cNs在体外的“第二种特异性标记物”。

2.3 纯化的CSF-cNs表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2 筛选后的CSF-cNs在体外生长状态良好，三四天即可大量形成直径150-200 μm的神经球，并可连续传代4代以上，见图3A。为了验证多次传代培养后形成的神经球依然是CSF-cNs，该研究选取第3代神经球，通过细胞免疫荧光检测神经球是否表达CSF-cNs 特异性标记物Pkd2l1，结果显示这些GFP+神经球表达Pkd2l1，见图3B，表明CSF-cNs可在体外长期稳定生长并保持成球能力。为了进一步验证CSF-cNs具有神经干细胞特性[8]，接下来将第3代神经球消化成单个细胞后，通过细胞免疫荧光检测发现CSF-cNs表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2，见图3C，D。

2.4 体外诱导分化后CSF-cNs能分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞在验证了CSF-cNs在体外表达神经干细胞相关标记物后，进一步开展了CSF-cNs的体外分化实验。将第3代神经球消化成单个细胞后进行贴壁分化培养7 d。通过细胞免疫荧光检测发现，CSF-cNs表达神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4，见图4。

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引言

近年来，运用神经干细胞治疗脊髓损伤已经成为一种新的途径[1-3]。然而，脊髓神经干细胞的来源还存在争议。既往研究认为，脊髓中央管内的室管膜细胞是神经干细胞[4]，但后来新的文献报道室管膜细胞并不具有神经干细胞特性[5]。
因此，确认脊髓中央管内神经干细胞的来源对于脊髓损伤的治疗至关重要。
接触脑脊液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)，简称触液神经元，是脊髓中央管内直接接触脑脊液并穿越实质的神经元亚群[6]。100年前该细胞群被首次发现至今，其功能还不甚明了。课题组前期研究发现， CSF-cNs在脊髓损伤后的功能恢复中可能起着关键作用[7]，并先后在体内、外首次证明CSF-cNs具有神经干细胞潜能[8-9]。然而，将CSF-cNs作为脊髓神经干细胞来源并通过细胞移植治疗脊髓损伤还存在一些难点，如CSF-cNs在哺乳动物体内数量稀少，在脊髓中央管附近的细胞占比不超过5%[10-11]，且目前尚无CSF-cNs细胞系的建立，因此需要获得纯度高且细胞活性好的CSF-cNs，同时获得的CSF-cNs能在体内、外被活体示踪。
1999年分子影像概念被首次提出，即在细胞和分子水平活体评价生物过程，其中包括在体内示踪干细胞迁移[12]。干细胞体内示踪技术是以非侵入性方式在活体内示踪干细胞的存活、分布和功能等，主要包括光学成像、放射性核素显像和MRI等。光学成像有2种类型：荧光成像和生物发光成像。核素显像也有2种类型，即单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，SPECT)和正电子发射断层成像术(positron emission tomography，PET) [13]。
单一的成像方式因其固有缺点，无法满足干细胞的植入、分布、存活、迁移、分化和功能等研究的要求。经过20余年发展，分子影像学技术使干细胞活体示踪成为可能，尤其是多模态成像因其独特的优势被越来越广泛地运用于干细胞异体移植的相关研究中 [14]。
为了能在体外获得高纯度高活性的CSF-cNs，该研究首次利用多模态影像分子技术，针对CSF-cNs设计了一种Pkd2l1启动子报告基因多模态影像分子，旨在体外筛选纯化CSF-cNs并进行体外示踪，验证CSF-cNs的神经干细胞潜能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2022年3-9月在贵州医科大学临床医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂及仪器 B27-plus Supplement(50×)(Gibco，Carlsbad，CA，美国)；DMEM-HG (Gibco， Carlsbad，CA，美国)；Neurobasal-A (Gibco，Carlsbad，CA，美国)；L-谷氨酰胺(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)；青霉素-链霉素溶液(100×)(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)；胎牛血清(Gibco，Thermo Fisher Scientific，
Waltham，MA，美国)；多聚D型赖氨酸(美国Sigma公司)；嘌呤霉素(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(Proteintech，Rosemont，IL，美国)；表皮生长因子(Gibco，Carlsbad，CA，美国)；木瓜蛋白酶(Sigma，Louis，MO，美国)；Accutase酶(Innovative cell technologies，CA，美国)，40 g/L多聚甲醛(北京Solarbio公司)；Triton X-100 (北京Solarbio公司)；山羊血清封闭液(北京Solarbio公司)；PBS(北京Solarbio公司)；兔抗Pkd2l1抗体(AB9084，1∶700，Merck Millipore，MA，美国)；鼠抗Nestin抗体(sc23927，1∶200，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，美国)；鼠抗Sox2抗体(1∶400，CST，Danvers，MA，美国)；鼠抗NeuN抗体(Millipore Sigma，Burlington，MA，美国)；鼠抗S100β抗体(1∶500，Proteintech，Rosemont，IL，美国)；鼠抗O4抗体(1∶500，Proteintech，Rosemont，IL，美国)；山羊抗兔IgG(H+L) (goat anti-rabbit Alexa Fluor 594，1∶500，CST，Danvers，MA，美国)；山羊抗鼠IgG(H+L) (goat anti-mouse Alexa Fluor 594，1∶500，CST，Danvers，MA，美国)；DAPI(Thermo Fisher Scientific，上海，中国)；倒置荧光显微镜(Observer AI，Carl Zeiss AG，德国)。
1.3.2 实验动物新生C57BL/6小鼠(出生后24 h内)由贵州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK (黔) 2018-0001。
所有动物实验均严格按照《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行，并经贵州医科大学动物护理伦理委员会批准(编号：2201625)。
1.4 实验方法
1.4.1 多模态影像分子的构建根据UCSC、Ensembl、NCBI网站(http://genome.ucsc.edu，http://www.ensembl.org，https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找Pkd2l1基因的第一个外显子上游

2 500 bp序列。经过序列比对正确后，选择第一个外显子CDS上游2 200 bp作为Pkd2l1启动子，再融合嘌呤霉素(puromycin)抗性基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、荧光素酶(luciferase)基因，建立Pkd2l1启动子报告基因慢病毒载体，见图1。

1.4.2 CSF-cNs分离培养将出生24 h内C57BL/6小鼠置于冰上低温麻醉，在SPF级动物房生物安全柜内处死后用体积分数为75%乙醇浸泡5 min后断头取材，冰上分离小鼠延髓组织，放于解剖液(DMEM-HG培养基+5%青链霉素+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL表皮生长因子)中，用无菌眼科剪将目标组织块反复、均匀剪碎成约0.5 mm3的碎块。将组织块转移至木瓜蛋白酶溶液中，37 ℃条件下消化30 min后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜无血清神经培养液(Neurobasal-A培养基+2%B27+1%青链霉素+1% L-谷氨酰胺+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL表皮生长因子)重悬细胞，将细胞悬液转移到预先用多聚D型赖氨酸包被处理(0.1 mg/mL)的24孔板中贴壁培养[15-16]。
1.4.3 CSF-cNs筛选纯化原代细胞贴壁培养24 h后，向培养基中加入多模态影像分子慢病毒转染12 h后换新鲜无血清神经培养液，继续培养96 h至细胞达到80%融合，用嘌呤霉素
(2 g/mL)筛选至72 h后换液，继续培养存活的CSF-cNs，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.4.4 CSF-cNs传代被筛选纯化的CSF-cNs扩增培养后，采用Accutase酶消化贴壁生长细胞3 min，轻柔吹打重悬，转移至离心管1 000 r/min离心5 min，弃上清，新鲜无血清神经培养液(Neurobasal-A培养基+2%B27+1%青链霉素+1% L-谷氨酰胺+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/mL表皮生长因子)重悬细胞，转移至超低黏附培养板悬浮培养成神经球。当神经球直径达150-200 μm时，采用Accutase酶消化神经球30 min并结合机械吹打将神经球消化成单细胞，后续培养方式同前。

1.4.5 CSF-cNs诱导分化在连续传代培养后，选取第3代神经球于多聚D型赖氨酸预处理的腔室载玻片中贴壁培养，将无血清神经培养液更换为含血清的分化培养液(Neurobasal-A培养基+2%B27 +1%青链霉素+1% L-谷氨酰胺+体积分数为1%胎牛血清)，培养7 d后通过免疫荧光检测CSF-cNs的分化能力。

1.4.6 细胞免疫荧光去掉细胞上清液，用PBS洗涤3次，每次5 min；在室温下用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗涤3次，每次5 min；室温封闭(体积分数为10%山羊血清和0.3%TritonX-100稀释于PBS中) 1 h；吸去封闭液，加入一抗(兔抗Pkd2l1抗体、鼠抗Nestin抗体、鼠抗Sox2抗体、鼠抗NeuN抗体、鼠抗S100β抗体、鼠抗O4抗体)后放于4 ℃冰箱孵育过夜；第2天将标本放在室温下复温60 min，吸去一抗，PBS清洗3次，每次5 min；加入二抗37 ℃恒温箱孵育2 h，吸去二抗后，PBS清洗5次，每次5 min；加入DAPI染色15 min，倒置荧光显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①经多模态影像分子慢病毒转染后CSF-cNs的绿色荧光蛋白表达以及绿色荧光蛋白与CSF-cNs特异性标记物Pkd2l1荧光共标情况；②CSF-cNs的体外连续传代成球情况及神经干细胞标记物Sox2、Nestin的表达；③CSF-cNs经体外诱导分化后神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4的表达。
1.6 统计学分析采用Image J图像处理软件对所有细胞免疫荧光图片进行加工处理，用GraphPad Prism 9绘制统计图。

讨论

神经干细胞首先是由REYNOLDS和WEISS于1992年发现的[17]。神经干细胞的发现为开发神经再生治疗脊髓损伤方案提供了希望[18]。尽管神经干细胞领域的研究已经取得了重大进展，但许多问题仍然没有阐明，如内源性神经干细胞的起源尚未确定，参与激活神经再生和修复的机制尚不清楚，干细胞活化后其增殖能力和分化潜能有限[19-21]。因此，有必要研究成年哺乳动物内源性神经干细胞的起源和激活机制，以便充分了解其在生理或病理状态下神经发生和再生的潜力。以往研究发现，中枢神经系统中维持神经再生的内源性神经干细胞主要存在区域是侧脑室和脊髓中央管室管膜周围的室管膜下区和海马齿状回的颗粒细胞下区 [22-23]，该区域由血管结构、脑脊液及各种神经细胞构成，称之为干细胞巢[24]。
而CSF-cNs是干细胞巢中的一种特殊类型的细胞，其胞体位于室管膜层及脑/脊髓实质内，而突起与脑脊液相接触，这些细胞在发育和成熟过程中保持持续的低分化不成熟状态[10，25-27]。
因此，作者推测CSF-cNs可能是一种特殊类型的神经干细胞。在前期研究中通过体内、外实验首次证明了CSF-cNs的神经干细胞潜能[8-9]。但在体外提取的CSF-cNs纯度不高，经流式细胞分选仪筛选的CSF-cNs活性显著降低，不能用于后续的体内移植和示踪。因此，需要一种新的技术手段解决上述问题。
多模态成像综合2种及以上成像技术，联合各成像技术的优势，更准确有效地实现干细胞活体示踪[28]。由此，为了在体外获得高纯度且活性良好的CSF-cNs，且能在体内、外示踪CSF-cNs，课题组自主设计并成功构建了一种能够特异性示踪并筛选CSF-cNs的多模态影像分子。该影像分子融合了嘌呤霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因，并以慢病毒为载体。当该影像分子慢病毒载体进入CSF-cNs后，可使其特异性表达嘌呤霉素抗性基因，在嘌呤霉素作用下可筛选纯化CSF-cNs；特异性表达绿色荧光蛋白基因，借助荧光显微镜可在体外示踪CSF-cNs，验证CSF-cNs在体外的神经干细胞特性；特异性表达荧光素酶基因，借助小动物活体成像仪可在体内示踪CSF-cNs，用于将来的CSF-cNs体内移植后的动态示踪。
神经干细胞具备自我更新及多向分化潜能2个基本特征。它可以通过对称分裂维持自我更新，亦能够在适当条件下通过不对等的分裂方式产生补充神经组织的各类细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。从原代神经组织中分离出来的神经干细胞可以在贴壁的二维单层培养状态中进行培养，也可以在悬浮培养条件下形成神经球[29-31]。为了在体外验证CSF-cNs的神经干细胞特性，从小鼠体内分离出含有CSF-cNs的原代神经干细胞，并利用多模态影像分子成功筛选出CSF-cNs，筛选出的CSF-cNs因表达绿色荧光蛋白而被示踪，且纯度达99.8%。CSF-cNs在体外悬浮培养能形成神经球并且可连续传代4代以上，且表达神经干细胞标记物。神经球分化培养后，CSF-cNs可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过对绿色荧光蛋白体外示踪的CSF-cNs进行神经球形成实验及体外诱导分化实验，充分验证了CSF-cNs在体外具备自我更新及多向分化能力，即 CSF-cNs在体外具有神经干细胞特性。
综上所述，通过引入多模态影像分子示踪CSF-cNs后，成功筛选出纯度高且活性好的CSF-cNs，并且成功验证了CSF-cNs的神经干细胞特性，为将来运用CSF-cNs体内移植治疗脊髓损伤提供了可靠的细胞来源。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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脊髓损伤是一种高发病率、高致残性疾病，目前尚无有效治疗方法。患者往往留有终身残疾，给家庭、社会带来极大负担和影响，是有待解决的重要医学难题。自从神经干细胞概念提出后，应用神经干细胞替代、修复损伤的神经组织以恢复脊髓功能成为脊髓损伤研究的热点。

目前，利用神经干细胞修复脊髓损伤的方法可分为两大类：①通过外源神经干细胞移植促进脊髓损伤的修复；②通过刺激成体神经干细胞即内源性神经干细胞再生来修复损伤的脊髓组织。虽然神经干细胞移植已经应用于临床脊髓损伤患者，且显示出一定效果。但是，外源神经干细胞移植存在诸多实际限制，如有效性、安全性和伦理问题等。利用成体神经干细胞修复脊髓损伤是一种理想的方法，并且具有独特优势。但是，成年哺乳动物体内神经干细胞数量有限、其来源尚无定论。正常情况下成体神经干细胞处于静息状态，脊髓受到损伤后其被激活、增殖并向损伤部位迁移。然而，成体神经干细胞的来源及激活机制尚不清楚，并且激活后其增殖能力和分化潜能有限。因此，研究成年哺乳动物脊髓中神经干细胞的来源及其增殖、迁移和分化的调控机制，对实现脊髓损伤修复具有重要意义。

成年哺乳动物脊髓中神经干细胞主要存在于脊髓中央管的室管膜及室管膜下区，在该区域由血管结构、脑脊液及各种神经细胞构成了一个特殊的微环境被称作神经干细胞巢。在神经干细胞巢中存在一种特殊类型的细胞，其胞体位于室管膜层及脑/脊髓实质内，因其突起与脑脊液相接触而被称为触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)。尽管，在上个世纪前就提出了CSF-cNs的概念，但是由于缺乏CSF-cNs特异性分子标记物阻碍了对其功能的研究。最近，Huang AL等研究发现CSF-cNs表达多囊肾病2型1通道(polycystic kidney disease 2 like 1，PKD2L1)，其被认为是脊椎动物CSF-cNs的特异性标记物。PKD2L1的发现为研究CSF-cNs特性提供了基础。课题组前期在体内、外首次发现CSF-cNs具有神经干细胞潜能。由于CSF-cNs在哺乳动物体内数量稀少，在脊髓中央管附近的细胞占比不超过5%，且目前尚无CSF-cNs细胞系的建立，因此需要获得纯度高且细胞活性好的CSF-cNs，本实验通过引入多模态影像分子成功筛选出高纯度可连续多次传代的CSF-cNs，且成功在体外示踪并验证了CSF-cNs的神经干细胞特性，为将来运用CSF-cNs体内移植治疗脊髓损伤提供了可靠细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

Characteristics of neural stem cells of cerebrospinal fluid-contacting neurons verified by multimodal imaging molecules in vitro

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