不同培养基对小鼠卵母细胞体外成熟质量及发育潜能的影响

doi:10.12307/2024.124

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 2024-2029.doi: 10.12307/2024.124

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

不同培养基对小鼠卵母细胞体外成熟质量及发育潜能的影响

田银1，赵艳华2，黄国宁1，李竞宇1

1重庆市妇幼保健院、重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，重庆市 400013；2哈尔滨医科大学，黑龙江省哈尔滨市 150081

收稿日期:2023-02-07 接受日期:2023-03-21 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 李竞宇，博士，副研究员，重庆市妇幼保健院、重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，重庆市 400013 黄国宁，主任医师，重庆市妇幼保健院、重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，重庆市 400013
作者简介:田银，女，1994年生，重庆市人，汉族，2019年重庆医科大学毕业，硕士，研究实习员，主要从事卵子及胚胎发育相关研究。
基金资助:
1重庆市妇幼保健院、重庆医科大学附属妇女儿童医院生殖医学中心，重庆市 400013；2哈尔滨医科大学，黑龙江省哈尔滨市 150081

Effects of different culture media on quality and developmental potential of mouse oocytes after in vitro maturation

Tian Yin1, Zhao Yanhua2, Huang Guoning1, Li Jingyu1

1Chongqing Health Center for Women and Children; Center for Reproductive Medicine, Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China; 2Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang Province, China

Received:2023-02-07 Accepted:2023-03-21 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Li Jingyu, MD, Associate researcher, Chongqing Health Center for Women and Children; Center for Reproductive Medicine, Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China Huang Guoning, Chief physician, Chongqing Health Center for Women and Children; Center for Reproductive Medicine, Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China
About author:Tian Yin, Master, Assistant researcher, Chongqing Health Center for Women and Children; Center for Reproductive Medicine, Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China
Supported by:
1Chongqing Health Center for Women and Children; Center for Reproductive Medicine, Women and Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China; 2Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

时差成像(Time-Lapse)：胚胎培养过程中，摄像机在相同的时间间隔内对培养的胚胎连续拍照，以获得胚胎在整个培养过程中的持续变化过程。
受精后钙震荡：精子进入卵母细胞释放磷脂酶Cζ，激活钙调蛋白-三磷酸肌醇信号通路，使储存于内质网腔中的钙离子通过三磷酸肌醇受体返回胞质中，胞浆内钙离子迅速升高诱发卵母细胞钙震荡。

背景：近年，未成熟卵母细胞体外成熟技术的需求逐渐增加。卵母细胞成熟受多种因素影响，其中培养基的选择尤为重要，目前尚无统一方案。

目的：用不同成熟培养基对生发泡期卵母细胞体外成熟，研究其对卵母细胞质量及发育潜能的影响。
方法：用G-1TM PLUS培养基、CZB培养基和M16培养基对生发泡期卵母细胞体外成熟，并以体内成熟卵母细胞为对照组，比较各组间的体外受精和早期胚胎发育能力。对于各组成熟后卵母细胞，采用免疫荧光方法评估线粒体功能，共聚焦显微镜实时成像系统检测钙震荡情况。

结果与结论：①3组之间第一极体排出率无明显差异(P > 0.05)；②G-1TM PLUS组体外受精率(52.86±11.24)%高于M16组(37.76±6.70)%和CZB组(30.62±5.51)%；CZB组的囊胚率(36.23±6.63)%低于对照组(78.16±4.17)%、G-1TM PLUS组(55.75±7.63)%和M16组(53.36±6.33)%；③与对照组相比，仅CZB组的纺锤体长宽比增加；④CZB组线粒体功能差于对照组、G-1TM PLUS组及M16组，并出现CZB组线粒体异常凝集现象；⑤受精后CZB组及M16组的钙震动频率显著高于G1组和对照组。综上所述，在小鼠卵母细胞体外成熟过程中，G-1TM PLUS、CZB及M16培养基的体外成熟率无差异，但G-1TM PLUS培养基有更高的受精率和囊胚形成率。

https://orcid.org/0009-0000-1965-7406 (田银)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 卵母细胞, 体外成熟, 培养基, 钙震荡, 体外受精, 胚胎发育

Abstract: BACKGROUND: In recent years, the demand for in vitro maturation of immature oocytes has increased. Oocyte maturation is affected by many factors, among which the selection of medium is particularly important, and there is currently no unified plan.
OBJECTIVE: To compare the in vitro maturation of germinal vesicle stage oocytes with different maturation media and to investigate its effects on oocyte quality and developmental potential.
METHODS: Germinal vesicle oocytes were matured in G-1TM PLUS medium, CZB medium and M16 medium, and mature oocytes in vivo were used as control group to compare in vitro fertilization and early embryo development among various groups. The immunofluorescence method was used to evaluate mitochondrial function in mature oocytes of each group. Calcium oscillation was detected by confocal microscopy real-time imaging system.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was no significant difference in the first polar body ejection rate among the three groups (P > 0.05). (2) The rate of in vitro fertilization was higher in the G-1TM PLUS group (52.86±11.24)% than that in the M16 group (37.76±6.70)% and the CZB group (30.62±5.51)%. The blastocyst rate was lower in the CZB group (36.23±6.63)% than that in the control group (78.16±4.17)%, G-1TM PLUS group (55.75±7.63)% and M16 group (53.36±6.33)%. (3) Compared with the control group, the length-to-width ratio of the spindle in the CZB group increased (P < 0.005). (4) The mitochondrial function of the CZB group was worse than that of the control group, G-1TM PLUS group and M16 group, and abnormal mitochondrial agglutination occurred in the CZB group. (5) The frequency of calcium oscillations in the CZB and M16 groups was significantly higher than that in the G1 and control groups. In conclusion, during in vitro maturation of mouse oocytes, in vitro maturation rate was not significantly different among G-1TM PLUS, CZB and M16 media, but the G-1TM PLUS medium had a higher rate of fertilization and blastocyst formation.

Key words: oocyte, in vitro maturation, culture medium, calcium oscillations, in vitro fertilization, embryo development

中图分类号:

田银, 赵艳华, 黄国宁, 李竞宇. 不同培养基对小鼠卵母细胞体外成熟质量及发育潜能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 2024-2029.

Tian Yin, Zhao Yanhua, Huang Guoning, Li Jingyu. Effects of different culture media on quality and developmental potential of mouse oocytes after in vitro maturation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 2024-2029.

图/表（结果） 5

2.1 不同培养基对卵母细胞成熟及发育潜能的影响对各组卵母细胞成熟率进行统计，结果显示：3组之间第一极体排出率无明显差异(P > 0.05)，G1组(n=154)为79.87%，CZB组(n=154)为73.38%，M16组(n=149)为79.19%，见图1A，表1。以体内成熟卵母细胞为对照组，统计各组体外受精后的受精及发育情况，对照组(n=171)受精率为(75.04±11.96)%，G1组(n=202)为(52.86±11.24)%，CZB组(n=172)为(30.62±5.51)%，M16组(n=247)为(37.76±6.70)%，其中体外成熟组的受精率显著低于对照组(P < 0.05)；在体外成熟组中，G1组受精率显著高于M16组(P < 0.05)，M16组显著高于CZB组(P < 0.05)，见图1B，表2。对照组囊胚率为(78.16±4.17)%，G1组为(55.75±7.63)%，CZB组为(36.23±6.63)%，M16组为(53.36±6.33)%，体外成熟组的囊胚率均显著低于对照组(P < 0.05)；在体外成熟组中，CZB组显著低于G1组及M16组(P < 0.05)，见图1B，表2。利用时差成像观察胚胎发育速度，与对照组相比，G1组无明显差异，M16组和CZB组胚胎发育速度显著减缓，见图1C，D。

2.2 不同成熟培养基对卵母细胞纺锤体形成的影响对各组MⅡ期卵母细胞的纺锤体及染色体进行染色，并统计纺锤体的长宽比及染色体排列异常率，结果显示：对照组(n=17)的纺锤体长宽比为1.76±0.20，G1组(n=22)为1.67±0.92，CZB组(n=19)为2.09±0.42，M16组(n=17)为1.90±0.19，见图2A，B。与体内成熟对照组相比，CZB组的纺锤体长宽比显著增加(P < 0.005)，而G1组和M16组无明显改变；在体外成熟组中，CZB组的纺锤体长宽比显著高于M16组，而M16组显著高于G1组(P < 0.05)。对照组染色体排列异常率为5.34%，G1组为8.46%，CZB组为24.44%，M16组为10.82%。CZB组显著高于对照组、G1组和M16组(P < 0.05)；对照组、G1组和M16组之间无差异(P > 0.05)，见图2C。

2.3 不同成熟培养基对卵母细胞线粒体功能的影响用JC-1染色评估线粒体膜电位，结果显示：对照组(n=14)相对荧光强度为0.88±0.23，G1组(n=36)为1.00±0.27，CZB组(n=35)为0.70±0.26，M16组(n=35)为1.09±0.36。CZB组的线粒体膜电位显著低于其他组(P < 0.05)；对照组、G1组和M16组之间无显著差异，见图3A，C。用Mitotracker进行线粒体定位检测，统计线粒体异常分布及凝集率，结果显示：对照组(n=42)为14.29%，G1组(n=43)为16.28%，CZB组(n=41)为41.46%，M16组(n=44)为18.18%。CZB组的线粒体异常率显著高于其他组(P < 0.05)；对照组，G1组和M16组之间无显著差异，见图3B，D。

2.4 不同成熟培养基对卵母细胞钙震荡的影响用FLUO-4AM染色评估胞内钙离子浓度，结果显示：对照组(n=30)相对荧光值为1.14±0.34，G1组(n=45)为1.00±0.27，CZB组(n=44)为1.40±0.38，M16组(n=44)为1.67±0.28。M16组胞浆内钙离子浓度显著高于CZB组(P < 0.05)，CZB组显著高于G1组和对照组(P < 0.05)，G1组和对照组无明显差异(P > 0.05)，见图4A，B。用FLUO-2AM染色进行受精后钙震荡追踪，见图4C-F，分析1 h内的震动频率，结果显示：对照组(n=15)为(6.53±1.58)次/h，G1组(n=15)为(6.16±1.14)次/h，CZB组(n=12)为(10.17±4.86)次/h，M16组(n=12)为(13.08±9.37)次/h。CZB组及M16组的震动频率显著高于G1组和对照组(P < 0.05)，G1 组和对照组无明显差异(P > 0.05)，见图4G。

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引言

卵母细胞体外成熟技术是指从窦卵泡中获得未成熟卵母细胞并在体外进行成熟培养，从而获得成熟卵母细胞的过
程[1]。对于急需生育力保存的女性，如肿瘤患者等，可以在不使用激素超排的情况下，进行未成熟卵的采集，联合卵母细胞体外成熟技术实现生育力保存[2-3]，缩短患者等待放化疗的时间；对于激素敏感性的肿瘤患者，体外成熟技术可有效避免因为超排导致的病情恶化[2-3]；对于多囊卵巢综合征患者，体外成熟可防止由于超促排诱发的卵巢过度刺激综合征[4-7]。卵母细胞成熟包括核成熟和胞质成熟。核成熟是指双线期阻滞的生发泡期卵母细胞(germinal vesicle，GV)恢复减数分裂到第二次减数分裂中期(MⅡ期)[8]；胞质成熟是指在核成熟的同时伴随着母源蛋白质的合成以及线粒体的重新分布及激活等[9]。卵母细胞体外成熟受多种因素影响，如启动方案[10]、体外培养系统[11]、培养基成分等[12-13]，其中培养基是卵母细胞体外成熟的基石。一些研究表明不同的体外成熟培养基可获得类似的成熟率[14-16]，而一些文章发现囊胚培养基比体外成熟培养基具有更高的成熟率[17-18]。但是，这些研究均未对卵母细胞成熟后的受精和发育潜能进行深入探讨。因此，不同培养基体外成熟对卵母细胞质量的影响还需要进一步研究。
小鼠作为模式动物常被用于体外成熟的研究。最早的小鼠胚胎培养基是以Krebs-Ringer碳酸盐培养液为基础的BMOC培养基，随后基于BMOC的其他培养基先后被发明[19]，包括M16培养基[20]、CZB培养基[21]、KSOM培养基等[22]。人常用体外成熟培养基包括G1培养基(卵裂期培养基)、TCM-199培养基、HTF培养基及P1培养基等[14，23]。M16和CZB培养基是小鼠实验常用的体外成熟培养基，但关于两者对体外成熟影响的比较未见深入研究。G1作为卵裂期培养基被用于早期胚胎发育培养，有临床研究报道，卵裂期培养基相比商用体外成熟培养基具有更高的成熟率[24]，但未对受精及发育潜能做进一步对比。在临床应用中，受精率及发育潜能低是影响体外成熟技术推广的主要因素。因此，该研究以小鼠生发泡期卵母细胞为研究对象，选择M16、CZB及G1培养基进行体外成熟，研究不同成熟培养基对卵母细胞质量及发育潜能的影响，为体外成熟的优化提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计胚胎学实验设计，采用单因素方差分析对多组结果进行比较分析。
1.2 时间及地点实验于2021年4月至2022年1月在人类胚胎工程重庆市重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄ICR小鼠，雄性20只，体质量36-42 g，雌性200只，体质量25-30 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验方案经重庆市妇幼保健院实验动物福利伦理委员会批准，批准号为2021008。实验遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和国家法规。
1.3.2 胚胎培养液 M2操作液(Sigma，货号：M7167)：G-1TM PLUS培养基(Vitrolife，货号：10128)；M16培养基(Sigma，货号：M7292)；CZB培养基(Sigma，货号：MR-019-D)；KSOM培养基(Sigma，货号：MR-212-D)；HTF受精液(Sigma，货号：MR-070-D)。
1.3.3 抗体及染料 JC-1染料(碧云天，货号：C2006-1)；Mitotracker染料(碧云天，货号：C1094)；FITC-α-tubulin直标抗体(Sigma，货号：F2168)；FLUO-4AM染料(碧云天，S1060)；FLUO-2AM染料(碧云天，S1052)。
1.3.4 其他试剂透明质酸酶(Sigma，货号：H4272)；细胞松弛素B(Sigma，货号：14930-96-2)。
1.4 实验方法
1.4.1 生发泡期卵母细胞获取及体外成熟培养从小鼠腹腔分离卵巢，置于M2操作液中，在体视镜下反复钳夹卵巢，使生发泡期卵母细胞从卵巢中游离出来，用移卵针将卵母细胞移入提前平衡过夜的成熟培养基中清洗3次，将细胞均分为3组，分别加入G-1TM PLUS、CZB和M16培养基中，标记为G1组、CZB组及M16组，然后将其置于细胞培养箱中(37 ℃、体积分数5%CO2)培养14-15 h，计算卵母细胞成熟率(MⅡ数/GV+MⅠ+MⅡ数)。
1.4.2 体内成熟MⅡ期卵母细胞获取小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素10 IU，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素 10 IU，13-14 h后取下小鼠输卵管膨大部，置于M2操作液中，在体视镜下划破输卵管膨大部，让卵丘复合物流出。用移卵针将卵移入透明质酸酶中消化脱颗粒细胞2 min，加M2操作液终止消化后用移卵针将卵置于M2操作液中清洗3遍，作为对照组。
1.4.3 体外受精(In vitro fertilization，IVF)及囊胚培养 ①精子获能：取出雄鼠附睾，置于M2操作液中，于体视镜下划破附睾尾，挤出精子，吸取少许精子于提前平衡过夜的HTF获能液中获能1 h。②MⅡ期卵母细胞激光破透明带：将对照组、G1组、CZB组及M16组中的MⅡ期卵母细胞置于M2操作液中，于显微操作仪上用激光做透明带打孔。③体外受精：将打孔后的卵母细胞置入提前平衡过夜的HTF中，加入获能后活性较强的精子，置于培养箱中受精，6 h后取出放入KSOM培养基中培养，统计受精率、2细胞率、4细胞率、囊胚率。
1.4.4 胚胎时差成像在时差成像培养皿中加入KSOM，盖上石蜡油，放入培养箱中平衡过夜。将受精卵放入提前平衡的时差成像培养皿中，放入Time-Lapse培养系统并成像至囊胚，拍摄帧率：15 min/frame。
1.4.5 活细胞JC-1、Mitotracker及FLUO-4AM染色 ①荧光染料配备：用M2操作液稀释JC-1(1∶200)，置于培养箱中平衡30 min；用二甲基亚砜溶解Mitotracker，配置1 mmol/L的浓储液，然后用M2操作液稀释到终浓度500 nmol/L，置于培养箱中平衡30 min；用二甲基亚砜溶解FLUO-4AM，配置5 mmol/L的浓储液，用M2操作液稀释到终浓度5 μmol/L，置于培养箱中平衡30 min。②染色：取各组MⅡ期卵母细胞，置于相应染色液中，于培养箱中染色30 min后免疫荧光拍照。
1.4.6 免疫荧光染色收集各组MⅡ期卵母细胞，用含有0.2%聚乙烯醇的PBS洗涤3次，每次5 min，然后置于40 g/L多聚甲醛中室温条件下固定1 h；再将卵母细胞转移至含有 0.1% TritonX-100的PBS母液中透膜处理30 min，转移前洗涤3次，每次5 min；然后将卵母细胞转移至封闭液(含3%牛血清白蛋白)中封闭处理，室温下孵育1 h；加入FITC-α-tubulin抗体在4 ℃冰箱孵育过夜；PBS-PVA洗涤3次，每次5 min；用Hoechst染核15 min，PBS-PVA洗涤3次，每次5 min；抗荧光淬灭剂封固；在共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)下拍照，利用ImageJ软件统计荧光平均强度。
1.4.7 钙震荡检测 ①MⅡ期卵母细胞FLUO-2AM染色：染色方法同FLUO-4AM；②单精子胞浆注射：精子超声断尾，各组卵母细胞置于含细胞松弛素B的M2操作液中做单精子注射，注射结束后立即置于荧光显微镜下(带细胞培养系统，37 ℃，体积分数为5%CO2)进行时差成像拍摄1 h，拍摄帧率10 s/frame。
1.5 主要观察指标第一极体排出率，受精率，囊胚率；线粒体功能，受精后钙震荡情况。
1.6 统计学分析使用IBM SPSS Statistics 25.0进行统计分析。成熟率、发育率及线粒体异常分布率均用χ2检验，时差成像数据、JC-1相对荧光强度、胞浆内钙离子相对荧光强度、钙震荡频率用单因素方差分析。文章统计学方法已通过重庆医科大学卫生统计学教研室专家审核。

讨论

培养基为卵母细胞体外成熟提供了营养物质及基础环境，培养基不同可能会影响卵母细胞的质量及发育潜能[25]。临床研究中，由于卵母细胞来源、启动方案以及体外培养时间的不一致[14]，缺乏不同培养基对卵母细胞体外成熟质量、受精和发育潜能影响的系统研究。因此，利用小鼠卵母细胞进行不同培养基体外成熟效率的研究是十分重要的。CZB和M16为小鼠常用体外成熟培养基，G1为卵裂期胚胎培养基，可用于小鼠卵母细胞体外成熟培养。该研究系统比较了G1、CZB及M16培养基对小鼠卵母细胞体外成熟质量及发育潜能的影响，结果表明：3种培养基中卵母细胞体外成熟率无差异，但G1培养基中体外成熟卵母细胞具有更高的受精率及囊胚率；而CZB培养基中卵母细胞的受精率及囊胚率最差，并可见明显的纺锤体形态异常和线粒体功能异常。
受精率低是影响辅助生殖临床结局的一个重要原因[26]。在受精过程中，精子进入卵母细胞后释放PLCζ，PLCζ激活钙调蛋白-IP3信号通路使储存于内质网中的钙离子通过IP3受体返回胞质中[27]，胞内钙离子迅速升高，这一过程称为受精后的钙震荡[28-29]。因此，胞内钙离子浓度异常会影响钙震荡激活，进而导致受精失败[30]。该研究发现体外成熟组之间体外受精的受精率差异较大，其中G1组的受精率显著高于CZB组和M16组。对各组卵母细胞的钙离子浓度进行了检测，发现G1组钙离子浓度与对照组无明显差异，而M16组和CZB组钙离子浓度显著升高。进一步对受精后的钙震荡进行跟踪，发现G1组震动频率与对照组类似，而M16组和CZB组震动频率显著增加。因此，M16组和CZB组异常偏高的钙离子浓度及较快的震动频率可能是影响其受精率的主要原因。研究报道细胞内钙离子浓度的维持需要培养基中钙离子的支持[31]，该研究发现G1中的钙离子浓度低于CZB和M16[20-21，32-33]，见表3，因此推测CZB组和M16组偏高的钙离子浓度及受精后钙震动频率可能是由于其较高的钙离子浓度引起的。
线粒体的重排及激活是保障卵母细胞成熟及后续发育的关键[34]，在卵母细胞成熟及早期胚胎发育期间，通过糖酵解途径提供能量，线粒体是糖酵解提供ATP的主要场所[35]。线粒体功能可影响卵母细胞成熟过程中纺锤体的形成及染色体的重排[36]，进一步影响卵母细胞的发育潜能[37]。该研究检测了体外成熟后卵母细胞线粒体的功能及排布，CZB组与对照组相比线粒体功能及排布异常，同时纺锤体形态及染色体排列异常明显增高，且发育率在体外成熟组中最低。G1组与对照组相比线粒体功能及排布无明显差异，同时纺锤体形态和染色体排列均无明显异常，发育率在体外成熟组中最高，且在发育速率上与对照组接近。在体外成熟过程中，CZB组卵母细胞线粒体功能及排列异常影响卵母细胞成熟后纺锤体和染色体的排列，进一步影响卵母细胞发育潜能。
综上所述，在G1、CZB及M16三种成熟培养基中卵母细胞的第一极体排出率无差异，但G1卵裂期培养基中卵母细胞受精率及囊胚率高于CZB、M16体外成熟培养基，这可能与G1培养基中钙离子浓度较低及胞质成熟更好有关。因此，在体外成熟培养基选择上可以倾向于选择低钙的卵裂期培养基，但由于物种差异，若需临床应用还需要进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同培养基对小鼠卵母细胞体外成熟质量及发育潜能的影响

Effects of different culture media on quality and developmental potential of mouse oocytes after in vitro maturation

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