无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.006

中国组织工程研究

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无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

周婷婷¹，卫超¹，陈晓东^2○，李海¹，汪铮¹

1上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所，上海交通大学仁济干细胞临床研究中心，上海市 200001；2Department of Restorative Dentistry, Division of Biomaterials, the University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, Texas

收稿日期:2012-12-10 修回日期:2013-01-24 出版日期:2013-07-02 发布日期:2013-07-02
通讯作者: 李海，博士，副教授，上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所，上海市 200001 haili_17@yahoo.com 并列通讯作者：汪铮，博士，副教授，上海交通大学医学院附属仁济医院消化科，上海市消化疾病研究所，上海交通大学仁济干细胞临床研究中心，上海市 200001 zheng.w.dr@gmail.com
作者简介:周婷婷★，女，1986年生，湖北省巴东县人，土家族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事干细胞相关研究。 Guxinglei1005@126.com
基金资助:
卫生部内科消化重点实验室专项基金(30972751)；国家自然科学基金(30971468)。

Primary culture of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in serum free medium

Zhou Ting-ting¹, Wei Chao¹, Chen Xiao-dong², Li Hai¹, Wang Zheng¹

1Department of Digestion, Renji Hospital of Shanghai Jiao Tong University Medical School, Shanghai 200001, China; 2Department of Restorative Dentistry, Division of Biomaterials, the University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, Texas, USA

Received:2012-12-10 Revised:2013-01-24 Online:2013-07-02 Published:2013-07-02
Contact: Li Hai, M.D., Associate professor, Department of Digestion, Renji Hospital of Shanghai Jiao Tong University Medical School, Shanghai 200001, China haili_17@yahoo.com Corresponding author: Wang Zheng, M.D., Associate professor, Department of Digestion, Renji Hospital of Shanghai Jiao Tong University Medical School, Shanghai 200001, China zheng.w.dr@gmail.com
About author:Zhou Ting-ting★, Studying for master’s degree, Department of Digestion, Renji Hospital of Shanghai Jiao Tong University Medical School, Shanghai 200001, China Guxinglei1005@126.com
Supported by:
the Specific Foundation for Key Laboratory of Digestion Medicine, Ministry of Health, No. 30972751*; the National Natural Science Foundation of China, No. 30971468

摘要/Abstract

摘要：

背景：以含血清培养基培养的脐带间充质干细胞，存在着进一步应用的障碍。
目的：建立无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞。
方法：取脐带华通氏胶(Wharton’s Jelly)，采用机械法将组织胶切碎，1-3 mm3大小，分别培养到含胎牛血清完全培养液中以及无血清培养液中。培养第11，14，17天收获细胞并进行相关检测。在符合2006年制定的干细胞最低评估标准的基础上，以集落形成单元指标评估何种培养体系能获得较多高质量的原代细胞。
结果与结论：无血清培养体系相对于经典的含血清的培养体系而言，细胞生长速度更快。另外，培养第11天，集落形成实验表明无血清培养体系下能获得更多的集落。因此，无血清培养体系可以保持间充质干细胞的特性，为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 原代培养, 无血清, 有血清, 替代, 集落形成单元, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The application of mesenchymal stem cells derived from umbilical cord cultured in serum-containing medium has some obstacles.
OBJECTIVE: To establish serum free medium system for primary culture of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Wharton’s Jelly was isolated from umbilical cord, minced, 1-3 mm3, and subsequently incubated in either serum containing medium or serum free medium. Some cells were harvested on days 11, 14 and 17 for some detection. Based on the minimal criteria established by the International Society for Cellular Therapy in 2006, mesenchymal stem cells were assayed with colony forming unit-fibroblast.
RESULTS AND CONCLUSION: The mesenchymal stem cells grew rapidly in serum free medium condition compared with serum containing medium. On day 11, the number of colonies was larger in serum free medium condition than that in serum containing medium. Thus, serum free medium could maintain properties of mesenchymal stem cells and provide possibility a credible alternative to serum containing medium for primary culture of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, umbilical cord blood-derived stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, primary culture, serum free, serum containing, replacing, colony forming unit, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

周婷婷，卫超，陈晓东，李海，汪铮 . 无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.006.

Zhou Ting-ting, Wei Chao, Chen Xiao-dong, Li Hai, Wang Zheng. Primary culture of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in serum free medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.006.

图/表（结果） 5

2.1 不同培养体系下培养不同时间脐带间充质干细胞原代的生长情况采用含血清培养体系和无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞5-7 d，倒置显微镜下可观察到先前种植的组织块周围出现少量散在贴壁的梭形细胞。培养2周左右，可观察到组织块周围环绕细胞，并随着培养时间的延长，环形的半径越来越大，细胞排列密度越来越高，见图1。

2.2 不同培养体系原代脐带间充质干细胞的数量变化情况人脐带来源间充质干细胞在组织块种植的第5天左右开始出现，到第7天仍只有少量细胞，第10天以后出现较多的细胞。实验比较含血清培养体系以及无血清培养体系下，第11，14，17天的细胞数量变化，见图2。其中，原代培养到第11天，无血清培养体系细胞数量相对于含血清培养体系较多，但是，统计结果显示差异无显著性意义(P=0.08)，可能是由于样本量过少引起的(n=3)，但是两者有数量变化趋势。

2.3 不同培养体系经典干细胞原代表面标志的变化两种培养体系下获得的细胞均高表达CD44[37]，CD73，CD166[38-39]，CD105和HLA-ABC(约为95%)等，不表达CD34，CD31，CD80，HLA-DR，CD45(<2%)等[40]，见图3。
2.4 不同培养体系下干细胞原代亚群表面标志的变化两种培养体系下干细胞亚群标志SSEA-4表达很低，在含血清培养体系中CD146先升高后下降[41]，最高超过50%，SSEA-4表达量最高值不超过7%[42-43]。无血清培养条件下，以上表面标志均没有明显变化。另外，两种培养条件下均不表达骨髓间充质干细胞高表达的CD271[44]，见图4。
2.5 不同培养条件下成软骨分化结果含血清培养条件下和无血清培养条件下，脐带间充质干细胞均可以成软骨分化成功，见图5。
2.6 不同培养条件下集落形成实验检测结果的变化无血清培养体系相对于含血清体系，原代干细胞增殖能力明显提高，并且在培养到14 d时达到高峰；含血清培养体系中，随着培养时间的延长，形成的集落数逐渐呈下降趋势。另外，在不同的培养时间，观察发现集落形成实验中无血清培养体系下形成的集落数均多于含血清培养体系下形成的集落数，并且在11 d和14 d时，差异有显著性意义，见图6。

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引言

间充质干细胞不仅能够进行自我更新，并且能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和内皮细胞等^[1-2]。另外，干细胞还具有免疫调节作用^[3-7]。间充质干细胞已经被广泛应用于移植物抗宿主疾病[8]、缺血性心力衰竭^[9]、恶性胶质瘤等^[10]。骨髓间充质干细胞是首先被发现的间充质干细胞^[11]，关于骨髓间充质干细胞的研究非常多^{[8, 12-21]}。但是，骨髓间充质干细胞具有一些不足之处，如：取材相对不易，骨髓抽取过程给患者带来很大的痛苦，短期内不能对同一供者进行取材，扩增较慢，对于体弱和老年患者不适用，给临床应用带来诸多不便。
脐带Wharton’s Jelly来源的间充质干细胞除了具备骨髓间充质干细胞的特点，还有着自身的优势：体外容易扩增，能分泌不同的细胞因子，比如粒巨集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子^[22]，免疫原性低^[23]，不存在太多的伦理学争议，不会导致供者额外的创伤或痛苦等，这些特点给脐带间充质干细胞带来了更广阔的应用前景^{[4, 24-27]}。此外，据已有研究证明，骨髓间充质干细胞与脐带间充质干细胞在表型、分化能力以及蛋白表达等方面略有不同^[28]。这些特点使得脐带间充质干细胞成为细胞替代治疗或者免疫调节治疗更具希望的选择。
然而，到目前为止，国内外并没有提出一个得到公认的、方便实用的脐带间充质干细胞的培养方法，特别是关于脐带间充质干细胞的原代培养，大多数研究者仍采用经典的培养基加体积分数为5%-20%胎牛血清进行间充质干细胞培养^[29-35]。然而，异种血清存在着诸多安全隐患，对脐带间充质干细胞在临床应用造成了很大的局限性。实验经过多重筛选，建立无血清培养体系，观察该体系下，脐带间充质干细胞原代培养与传统含血清培养有无差异。

材料方法

设计：细胞学体外对比观察。
时间及地点：于2012年2至10月在仁济医院上海市消化疾病研究所干细胞实验室完成。
材料：经产妇同意，并由产妇或其代理人签署知情同意书，采集足月健康剖宫产胎儿脐带，长度约20 cm，4 h内进行处理。实验经医院伦理委员会批准。
无血清替代含血清培养体系实验所需的主要试剂及仪器：

实验方法：
人脐带间充质干细胞原代分离及培养：①Wharton’s Jelly分离：用含30-50 mL DMEM/F12的无菌采集瓶采集健康足月剖宫产胎儿脐带，脐带长约20 cm。尽量洗尽血凝块，按血管螺旋走式剔除脐带的两条动脉和一条静脉。用有齿镊将Wharton’s Jelly撕下，放入无菌培养皿中，并用无菌DPBS(约10 mL)浸泡。②洗涤胶体：将获得的胶体转移至50 mL离心管，加DPBS 20-30 mL，混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清。③制备胶浆：用灭菌的组织剪将胶体剪成1-3 mm3体积大小，并将胶体转至50 mL离心管，加20-30 mL DPBS洗涤，2 000 r/min离心5 min，弃上清。④种植：按每75 cm2培养瓶接种0.5 mL胶体，同时，分别加入10 mL含血清完全培养液(DMEM/F12+体积分数为10%胎牛血清+1% Glutamine+1% Glutamax+1%NEAA)和无血清培养液(UltraCULTURETMSerum-free Medium+ 2% UltroserTMSerum Substitute +1% Glutamine+1% Glutamax+1% NEAA)，采用倒置法，放入体积分数为5% CO2恒温增湿培养箱中，培养4 h，然后将培养瓶翻转。培养5 d以前，尽量不要移动培养瓶。至培养5-7 d，见有细胞爬出时首次换液，以后每3 d换液。
显微镜下观察：培养第5，8，11，14，17天，倒置显微镜下观察细胞生长情况。
细胞计数：于原代培养至11，14和17 d收获细胞，并进行计数，方法如下：①弃去旧培养液，每75 cm2培养瓶加入10 mL左右DPBS，轻轻吹打，尽量除去组织块。②消化：每75 cm2培养瓶加入4 mL 0.125%胰酶-EDTA，放入培养箱，消化3 min。③中止：按照之前的培养体系，分别加入新鲜培养液进行中止，收集细胞。④离心：2 000 r/min，5 min，弃上清。⑤漂洗：各加入5 mL DPBS，混匀。⑥离心：2 000 r/min，5 min，弃上清。⑦过滤：加入1 mL培养液，混匀，细胞中混有组织块，用100 μm过滤网进行过滤。⑧计数：使用细胞计数仪进行计数。
人脐带间充质干细胞表面标志鉴定：分别收集原代培养11，14，17 d细胞，计数，以(1-5)×105/管进行流式细胞术检测，FITC-CD34，FITC-CD31，FITC-CD45，FITC-CD44，FITC-CD73，PE-CD105，FITC-HLA-ABC，FITC-HLA-DR，FITC-CD146，FITC-SSEA-4，PE-CD271，采用一步法，方法如下：①漂洗：1 mL流式细胞缓冲液(PBS+体积分数为1%胎牛血清+ 0.1%NaN3)漂洗细胞1次。②离心：2 000 r/min，5 min，弃上清。③重悬：将细胞重悬在100 μL流式细胞缓冲液中。④孵育抗体：每管中加入1 μL流式抗体，IgG1和IgG3分别为同型对照。混匀，避光，室温孵育15-30 min。⑤漂洗：1 mL流式细胞缓冲液漂洗细胞1次。⑥离心：2 000 r/min，5 min，弃上清。⑦固定：每管中加入 100 μL 10 g/L多聚甲醛固定细胞，待上机。
FITC-CD166采用两步法：①-⑥方法同前。⑦孵育二抗：加入1 μL Goat anti mouse-IgG，室温避光，孵育15 min。⑧离心并固定。⑨24 h内FACSCalibur对样本进行检测，应用Flowjo7.6软件进行结果分析。
成软骨分化：根据成软骨分化说明书进行操作(STEMPRO®Chondrogenesis Differentiation Kit，Gibco)，将无血清和含血清培养条件下培养11 d，收获细胞进行成软骨分化诱导，操作方法如下：收集两种培养体系下11 d的原代细胞，计数，调整细胞浓度为1.6×1010 L-1，加入5 μL到24孔板每孔中，在37 ℃恒温高湿培养环境中培养2 h，加入成软骨诱导液1 mL，以后每两三天换液，培养14 d。
集落形成单元(CFU-F)：将收集的细胞制备单细胞悬液，调整浓度，以300个细胞/孔的细胞密度接种到6孔板的3个孔中[36]，分别按照之前的培养体系采用无血清培养体系和含血清培养12 d以后，40 g/L多聚甲醛固定，1%结晶紫染色。
主要观察指标：将脐带Wharton’s Jelly分别在含血清培养体系和无血清培养体系中培养，第11，14，17天收获细胞，比较两种不同培养条件下细胞数量，应用流式细胞术检测细胞表面标志的表达量，成软骨分化实验检验细胞分化能力，集落形成实验检测细胞增殖能力。
统计学分析：由第一作者采用SAS 8.2软件完成统计处理，样本量(n)=3。实验数据以x(_)±s表示，其中细胞计数先转换为Log10，然后进行统计处理，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞具有自我更新能力和多向分化能力^[11]，同时还具有双向免疫调节功能的细胞^[45]。由于间充质干细胞的这些特点，使其现已成为细胞替代治疗以及免疫调节治疗极具希望的选择。骨髓间充质干细胞作为最早发现的间充质干细胞，研究得更加深入，也得到更为广泛的应用。但是，骨髓间充质干细胞存在着自身的不足。脐带间充质干细胞凭借自身的特色，包括低免疫原性，均质性，容易获得，对于供者无伤害性，无伦理学争议等，又成为替代骨髓间充质干细胞最佳的选择之一。有文献报道，脐带Wharton’s Jelly来源的间充质干细胞是众多多能干细胞中治疗血液疾病和再生医学惟一安全的异体干细胞类型^[46]。

但是，到目前为止，仍然没有公认的、统一的方法来分离、扩增以及鉴定间充质干细胞。不仅如此，多种传统方法对于培养间充质干细胞很大程度上依赖于胎牛血清。但是，异种血清的使用存在着很多不确定因素^[47]，比如，血清批次之间的差别，异种蛋白的免疫原性，潜在的病原体等，异种血清的种种潜在危害，使其生物安全性受到普遍质疑^[48]，据已有文献报道，心肌内注射胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞可导致心律失常^[49]。培养方法的缺陷，导致脐带间充质干细胞极大优势被束缚，成为干细胞临床应用的绊脚石，给干细胞的临床应用带来了极大的限制。

由于异种血清应用的种种限制，使得有些研究者企图采用异体或者自体血清来代替胎牛血清，促进细胞增殖，保持间充质干细胞的分化潜能。但是，随着细胞的增殖扩增以及干细胞临床应用的推广，血清的需求量会不断增大，如何获取大量人血清又成为临床应用的极大限制^[50]。因此，建立标准的培养方法，筛选出适合干细胞培养的无血清培养体系，成为目前工作的重心所在。

实验将脐带Wharton’s Jelly来源的原代细胞在无血清培养体系与传统含体积分数10%胎牛血清的培养体系下培养，观察比较细胞形态，并在不同时间(11，14和17 d)分别收获细胞，计数并进行检测。实验结果表明，无血清培养体系下也能获得与经典含血清培养体系一样的具有贴壁生长特性、形态为梭形似成纤维细胞的细胞。不同时间计数均表明，无血清培养条件下细胞生长比含血清培养条件下更加迅速，虽然11 d时两者计数比较起来差异无显著性意义(P=0.08)，但是仍然有差异趋势，统计学无差异可能是由于11 d时细胞刚开始增殖不久，仅显示了差异趋势，差异无显著性意义。流式细胞术检测表明，两种培养条件下培养的干细胞均高表达CD44，CD105，CD166，CD90和HLA-ABC，不表达造血和内皮相关表面标志CD34，HLA-DR，CD80，CD45和CD31。基于2006年国际细胞治疗学会提出关于分离和扩增间充质干细胞的最低标准，其中包括CD73表达阳性率必须高于95%^[40]。干细胞表面标志检测，无血清培养到14 d及以后，含血清培养到17 d，CD73表达明显下降，可能是由于细胞数量增加，排列过于密集，使细胞之间完全接触导致，不符合最低标准的要求。从另一方面也提示，脐带原代细胞培养传代时间不宜过晚，要严格根据细胞汇合程度进行判断，否则可能导致细胞质量下降。无血清培养体系培养11 d，以及含血清培养体系培养至11 d和14 d，均满足最低标准的要求。另外，软骨分化实验表明，无血清培养体系所培养的干细胞同传统培养方法一样均能成功分化成软骨细胞，说明两种条件下培养的原代细胞均具有分化能力，满足最低标准^[40]。最后，以集落形成实验检测结果作为主要研究指标，来反应单个细胞分裂增殖能力。所有满足最低标准的细胞中，无血清培养到11 d，形成的集落数最多，说明细胞分裂增殖能力最强。所以，无血清培养体系培养11 d可以替代含血清培养体系。但是，亚群表面标志CD146的差别提示无血清和含血清培养体系之间仍存在一些差别。这些差别是否会影响干细胞的分化方向还需要进行更深入的研究。

实验结果表明，无血清培养体系培养脐带间充质干细胞原代到第11天，能够收获形态、表面标志表达情况与传统血清培养体系相似，同样具有分化能力，但是数量更多以及增殖能力更强，无血清培养体系可能为干细胞临床应用在数量以及安全性方面提供了更多的保障，值得进一步推广。

无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

Primary culture of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in serum free medium

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