高氟干预成釉细胞钙稳态差异表达基因的筛选及分析

doi:10.12307/2024.309

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2481-2487.doi: 10.12307/2024.309

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高氟干预成釉细胞钙稳态差异表达基因的筛选及分析

黄婷1，刘霞1，王烛2，陈霆2，陈彬2，白国辉1，吴家媛1，田源1

1遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000；2遵义医科大学口腔医学院，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2023-02-14 接受日期:2023-04-24 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-29
通讯作者: 田源，主任医师，遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000
作者简介:黄婷，女，1995年生，贵州省黔西市人，汉族，硕士，医师，主要从事牙体牙髓病学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960198)，项目负责人：田源；遵义市口腔疾病免疫防治及医用生物材料研发创新人才团队项目(遵市科人才[2022]1号)，项目负责人：白国辉；遵义医科大学附属口腔医院口腔感染性与恶性疾病的病因与防治团队项目[遵市科合HZ字(2020)]，项目负责人：吴家媛

Screening and analysis of differentially expressed genes for calcium homeostasis in ameloblasts with high fluoride intervention

Huang Ting1, Liu Xia1, Wang Zhu2, Chen Ting2, Chen Bin2, Bai Guohui1, Wu Jiayuan1, Tian Yuan1

1Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2School of Stomatology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2023-02-14 Accepted:2023-04-24 Online:2024-06-08 Published:2023-07-29
Contact: Tian Yuan, Chief physician, Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Huang Ting, Master, Physician, Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960198 (to TY); Zunyi Municipal Research and Development Innovation Talent Team Program for Oral Disease Immunoprevention and Medical Biomaterials, No. [2022]1 (to BGH); Oral Infectious and Malignant Diseases Etiology and Prevention Team Program of Affiliated Stomatology Hospital of Zunyi Medical University, No. HZ(2020) (to WJY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氟斑牙：是长期摄入大量的氟所导致的牙釉质发育障碍。
钙稳态：正常生理环境下细胞内和细胞外钙离子浓度保持动态平衡称为钙稳态，当机体受到有害因素的刺激时可出现钙稳态失衡，导致细胞内钙离子浓度异常增加，最终诱发疾病。

背景：氟牙症是长期摄入大量氟所导致的牙釉质发育障碍，病因复杂，其发病机制有待深入研究。

目的：通过转录组测序技术筛选高氟干预成釉细胞与钙稳态相关的差异表达基因，并进一步探索氟斑牙形成的分子机制。
方法：分别用浓度为0，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 mmol/L的NaF处理成釉细胞LS8 24，48，72 h，检测细胞形态、细胞活性与细胞内钙离子浓度。分别用浓度为0，1.6，3.2 mmol/L的NaF处理成釉细胞LS8 24 h，通过转录组测序筛选差异表达基因，并对差异表达基因进行验证。

结果与结论：①处理24 h后，NaF浓度0，0.4，0.8 mmol/L组细胞生长状态良好，细胞的数量增多，细胞轮廓清晰；当NaF浓度≥1.6 mmol/L，随着NaF浓度的增加，细胞体积逐渐皱缩变小、细胞数量减少。处理48，72 h后，NaF浓度0，0.4 mmol/L组细胞数量增加，0.8，1.6，3.2 mmol/L组细胞数量逐渐减少，细胞形态变圆、变小，6.4 mmol/L组细胞皱缩变圆悬浮于培养基中，几乎无细胞贴壁。当NaF浓度相同时，处理24 h后LS8细胞的生长状态最佳。CCK-8检测结果显示，当NaF浓度相同时，随着处理时间的延长，细胞活性减弱；当处理时间相同时，随着NaF浓度的增加，细胞活性减弱。处理24 h后，随着NaF浓度的增加，细胞内钙离子浓度增加。②转录组测序分析发现参与调控细胞钙稳态的基因：Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5的表达显著上调(P < 0.05)，Cacna1a的表达显著下调(P < 0.05)，该结果得到了RT-qPCR检测的验证。③结果显示，NaF对LS8细胞增殖的抑制作用可能与细胞内Ca2+浓度异常增加有关，其机制可能由蛋白质加工合成通路Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5表达上调和钙信号通路Cacna1a表达下调所导致。

https://orcid.org/0009-0002-8135-1744(黄婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 氟中毒, 氟斑牙, 成釉细胞, 氟化钠, 转录组测序, 内质网应激, 钙离子通道, 钙离子探针

Abstract: BACKGROUND: Fluorosis is a disorder of enamel development caused by long-term intake of large amounts of fluoride during enamel development.
OBJECTIVE: To further explore the molecular mechanism of dental fluorosis formation by screening the differentially expressed genes associated with calcium homeostasis in ameloblasts by transcriptome sequencing technology.
METHODS: LS8 cells were treated with 0, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 and 6.4 mmol/L sodium fluoride (NaF) for 24, 48 and 72 hours to observe the effects of different concentrations of NaF on the morphology, cell activity and intracellular Ca2+ concentration of LS8 cells. The differentially expressed genes were screened by transcriptome sequencing and validated.
RESULTS AND CONCLUSION: After 24 hours of treatment, the cells treated with 0, 0.4, and 0.8 mmol/L NaF were in good growth condition, with increased cell number and clear cell outline. When the NaF concentration was ≥ 1.6 mmol/L, the cells were gradually shrunken and became smaller and the number of cells decreased with the increase of NaF concentration. After 48 and 72 hours of treatment, the number of cells increased in the 0, 0.4 mmol/L NaF groups, while gradually decreased in the 0.8, 1.6, 3.2 mmol/L NaF groups, with rounded and smaller cell morphology. The cells in the 6.4 mmol/L NaF group were shrunken, rounded and suspended in the medium, with almost no adherent cells. When treated with the same concentration of NaF, LS8 cells were in optimal growth after 24 hours of treatment. Results from cell counting kit-8 assay showed that when treated with the same concentration of NaF, the cell activity decreased with the increase of treatment time; when the treatment time was the same, the cell activity decreased with the increase of NaF concentration. After 24 hours of treatment, the intracellular Ca2+ concentration increased with the increase of NaF concentration. Transcriptome sequencing analysis identified genes involved in the regulation of cellular calcium homeostasis: Hsp90b1, Canx, Calr, and Hspa5 that were significantly upregulated (P < 0.05) and Cacna1a that was significantly downregulated (P < 0.05). To conclude, the inhibitory effect of NaF on LS8 cell proliferation may be related to the abnormal increase in intracellular Ca2+ concentration, and the mechanism may be caused by the upregulation of the expression of protein processing and synthesis pathways Hsp90b1, Canx, Calr, and Hspa5 and the downregulation of the expression of calcium signaling pathway Cacna1a.

Key words: fluorosis, dental fluorosis, ameloblast, sodium fluoride, transcriptome sequencing, endoplasmic reticulum stress, calcium channel, calcium probe

中图分类号:

黄婷, 刘霞, 王烛, 陈霆, 陈彬, 白国辉, 吴家媛, 田源. 高氟干预成釉细胞钙稳态差异表达基因的筛选及分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2481-2487.

Huang Ting, Liu Xia, Wang Zhu, Chen Ting, Chen Bin, Bai Guohui, Wu Jiayuan, Tian Yuan. Screening and analysis of differentially expressed genes for calcium homeostasis in ameloblasts with high fluoride intervention[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2481-2487.

图/表（结果） 14

2.1 不同浓度NaF对LS8细胞形态的影响处理24 h后，NaF浓度为0，0.4，0.8 mmol/L组细胞生长状态良好，细胞的数量增多，细胞轮廓清晰，细胞有长短不等的数个细胞突起，呈梭形、不规则三角形、多边形等，排列成旋涡状、放射状，细胞之间界限清晰；当NaF浓度≥1.6 mmol/L，随着NaF浓度的增加，细胞体积逐渐皱缩变小、细胞数量减少，悬浮于培养基中的细胞随之增多，见图1。

处理48，72 h，NaF浓度为0和0.4 mmol/L组细胞数量均比24 h时多，细胞生长拥挤，72 h时NaF浓度为0 mmol/L和0.4 mmol/L组细胞生长拥挤成团，细胞间几乎无间隙，48 h和72 h时0.8，1.6，3.2 mmol/L组细胞数量随着浓度增加逐渐减少，细胞形态变圆、变小，培养基中有大量悬浮细胞，而NaF浓度为6.4 mmol/L处理48 h和72 h细胞皱缩变圆悬浮于培养基中，几乎无细胞贴壁，见图2，3。

当处理LS8细胞的NaF 浓度相同时，比较处理24，48，72 h 后的细胞形态，处理24 h后的细胞生长状态最佳。
2.2 不同浓度NaF对LS8细胞增殖的影响通过CCK-8实验得出，NaF处理LS8细胞24 h的半数抑制浓度(IC50)为1.640 mmol/L，48 h的半数抑制浓度(IC50)为1.366 mmol/L，72 h的半数抑制浓度(IC50)为0.996 mmol/L；当NaF处理LS8细胞的时间相同时，随着NaF浓度的增加，细胞增殖活性降低(P < 0.05)，见图4。

2.3 转录组测序分析结果根据CCK-8实验得出NaF 处理LS8细胞 24 h 的半抑制浓度为1.640 mmol/L，因此实验选择NaF 浓度为1.6 mmol/L处理LS8细胞24 h作为中间浓度组(T1)、NaF 浓度为3.2 mmol/L处理LS8细胞24 h作为高浓度组(T2)，选择NaF浓度为0 mmol/L(不加NaF)作为对照组，分为3 个组，每组3 个生物学重复，一共9 个样本，进行转录组测序，每个样品平均产出6.74 G数据，一共检测到16 517个基因。测序的原始数据去除低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后reads质量统计见表3，整体测序数据质量达到分析要求。

2.3.1 差异表达基因分析结果基因差异表达分析显示，NaF浓度为1.6 mmol/L组上调的基因有4 074 个、下调的有3 951 个，NaF浓度为3.2 mmol/L组上调的基因有4 838 个、下调的有4 728 个，由于NaF浓度为1.6 mmol/L和3.2 mmol/L两组差异表达基因数目过多不利于分析，为了更好地说明NaF对成釉细胞的影响，筛选NaF浓度为1.6 mmol/L和3.2 mmol/L两组共同差异表达基因进行分析，Venn分析表明，如图5A绿色部分(T1 up)是NaF浓度为1.6 mmol/L处理LS8细胞24 h 的转录组测序分析，结果得出上调的差异表达基因有779 个；粉色部分(T2 up)是NaF浓度为3.2 mmol/L处理LS8细胞24 h的转录组测序分析，结果得出上调的差异表达基因有1 543 个，两组共同上调的基因有3 295 个。如图5B绿色部分(T1 down)是NaF浓度为1.6 mmol/L处理LS8细胞24 h的转录组测序分析，结果得出下调调的差异表达基因有673 个；粉色部分(T2 down)是NaF浓度为3.2 mmol/L处理LS8细胞24 h的转录组测序分析，结果得出下调的差异表达基因有1 450 个，共同下调基因有3 278 个。

采用edgeR 软件包过滤差异表达基因，并对差异表达基因进行分析，以log2(fold change)为横坐标，-log10(P值)为纵坐标，以q < 0.05(校正P值)为差异表达的阈值制作火山图(图6)。

2.3.2 GO功能富集分析对差异基因进行GO功能富集分析结果显示，GO富集分析中共同上调基因的功能富集，生物过程包括：代谢过程、生物调节、细胞传导、细胞分化、应激反应；细胞组分包括：细胞外基质、细胞膜、细胞外空间、质膜，分子功能包括：蛋白结合、分子载体、抗氧化活性等功能被显著富集，筛选富集较显著的前25 条GO条目，制作柱状图(图7)，其中13 条参与到生物过程中，8 条参与到细胞组分，4 条参与到分子功能。

共同下调差异表达基因的GO功能富集，生物过程包括：代谢过程、生物调控、发育过程、信号调控、免疫系统负调控、细胞增殖；细胞组分包括：细胞外基质、膜、细胞外空间；分子功能包括：蛋白结合、抗氧化活性等功能被显著富集，筛选富集较显著的前25 条GO条目，制作柱状图(图8)，其中13 条参与到生物过程中，9 条参与到细胞组分，3 条参与到分子功能。

2.3.3 KEGG通路富集分析通过KEGG对差异表达基因进行信号通路富集分析，共同上调的差异基因显著富集的通路266 条(图9)，共同下调的差异基因显著富集的通路196 条(图10)。

通过KEGG对差异表达基因进行信号通路富集分析，显著富集的通路主要有蛋白质在内质网中的加工、钙信号通路及代谢通路等，并具有统计学意义。通过对富集的信号通路进一步分析发现，蛋白质在内质网中加工信号通路显著富集的基因(如：Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5、Bax、Xbp1、Atf6、upd1、Sec61a1、Sec61a1)和钙信号通路中显著富集的基因(如：Cacna1a、Itpka、Ptk2b、Ptgf、Calml4、Plcd1、Camk2b、Adra1d、Gna14、Nos1)参与调控细胞的Ca2+浓度。
2.4 RT-qPCR 验证测序结果为进一步验证RNA-seq筛选出的基因的表达水平，实验选择了5 个显著差异基因采用RT-qPCR进行验证，选择差异倍数较高的基因Cacna1a、Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5。RT-qPCR检测结果显示，Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5的表达显著上调，Cacna1a的表达显著下调(P < 0.05)，见图11。通过上述结果进一步验证 RNA-seq测序结果可靠，同时证明了NaF影响LS8细胞基因的表达水平。

2.5 激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化使用Fluo-3，AM试剂盒用激光共聚焦显微镜进行图像采集和数据分析，得到清晰的荧光分布图像(图12)，通过软件ZEN处理及图像量化分析系统进行分析，并换算出随机选定区域内Ca2+的平均荧光强度，从而反映出细胞内Ca2+浓度的变化，结果表明，NaF处理LS8细胞24 h后，随着NaF浓度的增高，检测的细胞内Ca2+荧光强度越强(P < 0.05)，见图13，进一步证明成釉细胞内钙离子浓度随着氟浓度升高而增加。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验、转录组测序及分析，多样本之间差异采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD检验结果，若方差不齐采用Tamhane’s T2检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年12月在遵义医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞成釉细胞株LS8由美国加州大学Malcome Snead教授和第四军医大学段小红教授惠赠。
1.3.2 实验试剂 NaF(> 99%)(阿拉丁公司)；D-MEM糖培养基(Gibco公司)；特级胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、PBS、胰酶细胞消化液、CCK8细胞增殖-毒性检测试剂盒、RAPI 裂解液、Fluo-3，AM钙离子浓度检测试剂盒(北京利维宁生物科技有限公司)；一步法反转录荧光定量试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
1.3.3 实验器材激光共聚焦显微镜(徕卡公司)；多功能酶标仪(美谷分子仪器公司)；高速冷冻离心机(ThermoFisher)；实时荧光定量PCR仪(美谷分子仪器公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养将冻存的LS8细胞在37 ℃水浴锅中快速融化，加入含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的D-MEM高糖培养基(完全培养基)中，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。
1.4.2 不同浓度NaF处理LS8细胞后的细胞形态变化将LS8细胞以1×107 L-1的细胞浓度接种于培养皿中，每皿2 mL，24 h后换液，更换为含NaF 浓度0，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 mmol/L的完全培养基。处理24，48，72 h后，通过倒置显微镜拍摄照片，比较细胞形态学差异。
1.4.3 CCK-8实验检测LS8细胞活性用细胞计数器将LS8细胞浓度调整为1×108 L-1，加入96 孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，外周一圈的孔加入PBS防止培养基蒸发；培养24 h后弃原培养基，更换为含NaF浓度为0，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 mmol/L的完全培养基，并设置空白对照组(加入完全培养基，无细胞)。每组分别进行6个重复实验。处理24，48，72 h后，相继在96 孔板的实验孔中每孔加入10 µL CCK-8溶液，轻轻摇匀96 孔板防止气泡产生，放入培养箱中静置2 h，用酶标仪测定在450 nm 波长处点吸光度值。
1.4.4 转录组测序分析用细胞计数器将LS8细胞浓度调整为1×108 L-1，加入96 孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h后弃原培养基，更换为含NaF浓度为0(对照)，1.6，3.2 mmol/L的完全培养基，每组选择3个生物学重复。处理24 h后，经mRNA提取、cDNA文库构建、HiSeq测序等步骤后，建立NaF处理LS8细胞的转录组数据库，上机测序，利用Bowtie2软件，将得到的Clean reads比对到参考基因序列上，计算各个样品的基因表达水平，主要使用RSEM软件，最后根据与参考序列的比对和定量结果，对差异基因的表达进行分析。
1.4.5 验证测序结果

RT-qPCR检测基因表达水平：用细胞计数器将LS8细胞浓度调整为1×108 L-1，加入96 孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h后弃原培养基，更换为含NaF浓度为0，1.6，3.2 mmol/L的完全培养基，每组选择3个生物学重复。处理24 h后收集总RNA，按照一步法RT-qPCR试剂盒说明书，以RNA为模板RNA→cDNA→qPCR在同一体系中连续进行。反应液在冰上配置，采用20 μL反应体系，引物由上海生工生物工程服务有限公司合成(表1)，按一步法反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行(表2)。

钙离子探针检测细胞内钙离子浓度：将LS8细胞浓度调整为1×108 L-1，每个培养皿加入2 mL细胞悬液，在激光共聚焦培养皿中培养至约有70%的细胞贴壁，弃原培养基，PBS洗涤3 次，更换为含NaF浓度为0，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 mmol/L的完全培养基。处理24 h后，将培养液吸出，用HBSS溶液洗涤细胞3 次；每个皿加入2.5 mL浓度为2.5 µmol/L的Fluo-3，AM工作液，37 ℃培养20 min；将150 µL的胎牛血清和14 850 μL的HBSS溶液混匀，加入培养皿继续培养40 min，用HEPES buffer saline洗涤细胞3 次，37 ℃下培养10 min，激光共聚焦显微镜设置激发波长485 nm、528 nm探测细胞荧光强度，进行图像采集和数据分析。拍摄照片经荧光强度分析软件ZEN处理，利用图像量化分析系统进行图像分析，并换算出随机选定区域内Ca2+的平均荧光强度，从而反映出细胞内Ca2+浓度的变化。
1.5 主要观察指标不同浓度NaF对LS8细胞形态及活性的影响，以及转录组测序筛选差异表达基因结果。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 18.0软件分析，数据以x±s表示，多样本之间差异采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD检验结果，若方差不齐采用Tamhane’s T2检验结果，检验水准α取0.05，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经遵义医科大学附属口腔医院白国辉专家审核。

讨论

牙釉质主要由是成釉细胞增殖分化而形成，在牙釉质形成过程中，如成釉细胞的增殖和分化受到影响将会导致牙釉质发育不全[8-10]。氟斑牙的主要病因是在牙釉质的发育阶段摄入过多的氟所致，但其发病机制尚未明确，因此一直是个研究的热点。
此次实验通过转录组技术，对NaF干预LS8细胞的差异表达基因进行分析，结果显示一共检测到16 517 个基因，其中1.6 mmol/L组上调的基因有4 074 个、下调的有3 951 个，3.2 mmol/L组上调的基因有4 838 个、下调的有4 728 个，由此可见，NaF确实影响了LS8细胞基因的表达。由于差异表达基因差异较大且数目过多，无法对每一个差异表达基因进行分析，故实验只取了部分差异显著且可能与牙釉质形成有关的基因和重要通路进行文献回顾和分析。
3.1 表达差异显著基因 ①上调基因：Hsp90b1作为进化保守的蛋白家族之一，普遍存在于各种生物体中，并在细胞代谢中发挥着重要作用，主要参与细胞内调控蛋白折叠、稳定等的重要作用[11-12]。Hsp90b1与细胞的钙稳态有关被大家广泛认可，据报道Hsp90b1通过影响细胞外钙内流的主要通道SOCE影响细胞的钙稳态，氟斑牙的形成与钙稳态有关，在牙釉质形成时期，机体摄入过多的氟导致钙稳态紊乱，目前关于Hsp90b1与红斑狼疮及肿瘤的转移有关已有报道[13]，但关于Hsp90b1是否是与氟斑牙的形成有关尚未见报道。Canx 是存在于内质网中需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白，人类Canx基因位于染色体5q35上，据报道该基因在牙釉质形成中发挥重要作用，主要作用包括帮助内质网相关蛋白折叠、Ca2+存储等[14-15]。此次实验通过NaF处理LS8细胞后发现Canx表达上调、细胞内钙离子增加，因此推测Canx与氟斑牙的形成有关。Calr是一种高度保守的内质网Ca2+结合蛋白，主要定位于内质网，调节细胞内钙稳态以及细胞正常生理功能；此外，Calr基因突变可引起相应蛋白功能的改变，进而改变其所调控的一系列生理功能，对机体的免疫水平、细胞生长及凋亡等造成不同程度的影响。据报道，Calr过表达使内质网释放Ca2+及细胞外Ca2+内流，从而加重细胞钙超载，激发内质网应激反应[16-17]。因此，Calr基因对细胞内Ca2+具有调节作用，进而对细胞的增殖凋亡产生深远影响，也是近年来临床上研究的热点。Hspa5是热休克蛋白70家族成员之一，位于内质网内，是内质网应激感受器和关键分子伴侣，在蛋白质折叠和转运过程中发挥重要作用[18-20]。Hspa5也有维持细胞内钙平衡的作用，其参与调控合成蛋白质的折叠与转运，与内质网跨膜蛋白结合并抑制其活性，起维持细胞内钙平衡的作用[21-22]。②下调基因：Cacna1a是P/Q型电压阀门钙通道α1A亚型，参与Ca2+运输，是Ca2+通道主要功能单位。目前，已明确Ca2+通道致病性突变基因Cacna1a是失神癫痫的易感基因，通道异常会影响膜兴奋性及依赖钙内流的神经递质释放[23]。有研究通过氟斑牙大鼠动物模型研究证明，过量氟可能通过抑制L型Ca2+通道α1C亚型(Cacna1C)在牙胚发育过程中的表达，从而抑制Ca2+从细胞内转运至矿化前沿微环境，进而影响釉质的形成和矿化，导致氟牙症的形成[24]。此次实验从转录组测序分析KEGG富集的钙离子信号通路中发现Cacna1a 显著下调，因此推测Cacna1a与氟斑牙的形成有关。
3.2 蛋白质加工合成通路内质网是蛋白质合成和加工的重要场所，当内质网钙稳态紊乱或者蛋白质的加工运输障碍时会诱发内质网应激。在应激状态下，内质网的功能紊乱导致未折叠或错误折叠蛋白质的累积，错误折叠蛋白在内质网中的积累会引起内质网应激[25]。此次实验通过NaF干预LS8细胞转录组测序分析发现，内质网应激分子伴侣(Atf4、Xbp1、Atf6、Hsp90b1、Canx、Calr，Hspa5)和促凋亡的基因(bax)表达均上调，表明成釉细胞处于内质网应激状态，因此推测NaF干预LS8细胞发生内质网应激与蛋白质加工合成通路有关。有研究表明，人体吸收过量的氟促使金属基质蛋白酶20和丝氨酸蛋白酶1的分泌减少，蛋白酶的分泌减少会导致基质蛋白的延迟降解、蛋白质潴留，从而诱发内质网应激与氟斑牙的形成有关[26-28]。
3.3 钙信号通路有研究表明，电压门控L型钙通道在大鼠磨牙牙胚中表达，分布于成釉器的各类组成细胞，并且其表达水平与牙胚发育和细胞分化程度密切相关[29]。据报道，成釉细胞内钙稳态的另一个重要调节因子是钙库控制的钙通道，主要作用是使成釉细胞Ca2+内流[30-31]。此次实验通过转录组测序分析发现，NaF通过蛋白质在内质网中的加工和钙信号通路，影响LS8细胞与钙稳态相关的基因Hsp90b1、Canx、Calr，Hspa5、Cacna1a的表达水平，从而使LS8细胞内Ca2+浓度增加，证明NaF影响LS8细胞钙稳态，但究竟通过哪个基因或者几个基因综合作用的结果，还需要进一步深入研究。
3.4 结论 NaF对LS8细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性增加，NaF干预LS8细胞导致细胞内Ca2+浓度异常增加的机制可能与蛋白质加工合成通路Hsp90b1、Canx、Calr、Hspa5基因表达上调和钙信号通路Cacna1a基因表达下调有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高氟干预成釉细胞钙稳态差异表达基因的筛选及分析

Screening and analysis of differentially expressed genes for calcium homeostasis in ameloblasts with high fluoride intervention

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