丁酸钠对氟中毒模型大鼠的神经保护及乙酰化蛋白组学分析

doi:10.12307/2023.484

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3151-3157.doi: 10.12307/2023.484

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丁酸钠对氟中毒模型大鼠的神经保护及乙酰化蛋白组学分析

李洋杰1，祁荣2，张馨予1，程佳佶3，周柠4，崔雪3，程双4，王正东5，颜南6

沈阳医学院，1基础医学院，2科学实验中心，3公共卫生学院，4医学应用技术学院，5基础医学院解剖学教研室，6医学应用技术学院康复基础教研室，辽宁省沈阳市 110034

收稿日期:2022-05-10 接受日期:2022-08-05 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-19
通讯作者: 颜南，博士，副教授，沈阳医学院医学应用技术学院康复基础教研室，辽宁省沈阳市 110034 王正东，博士，教授，沈阳医学院基础医学院解剖学教研室，辽宁省沈阳市 110034
作者简介:李洋杰，女，1997年生，山东省临沂市人，汉族，沈阳医学院在读硕士，主要从事神经损伤与神经保护效应的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81803200)，项目负责人：颜南；辽宁省教育厅科学研究项目(SYYX202008)，项目负责人：王正东；沈阳市科学技术计划社会治理科技专项(21-108-9-11)，项目负责人：颜南；沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC200238)，项目负责人：颜南；沈阳医学院硕士研究生科技创新基金项目(Y20210503)，项目负责人：李洋杰

Neuroprotective effects of sodium butyrate and acetylation proteomics analysis in fluorosis rats

Li Yangjie1, Qi Rong2, Zhang Xinyu1, Cheng Jiaji3, Zhou Ning4, Cui Xue3, Cheng Shuang4, Wang Zhengdong5, Yan Nan6

1Basic Medical School, 2Science Experiment Center, 3School of Public Health, 4Medical Applied Technology School, 5Department of Anatomy, Basic Medical School, 6Department of Basic Rehabilitation, Medical Applied Technology School, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China

Received:2022-05-10 Accepted:2022-08-05 Online:2023-07-18 Published:2022-11-19
Contact: Yan Nan, MD, Associate professor, Department of Basic Rehabilitation, Medical Applied Technology School, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China Wang Zhengdong, MD, Professor, Department of Anatomy, Basic Medical School, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
About author:Li Yangjie, Master candidate, Basic Medical School, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81803200 (to YN); Liaoning Provincial Department of Education Scientific Research Project, No. SYYX202008 (to WZD); Social Governance Science and Technology Project of Shenyang Science and Technology Program, No. 21-108-9-11 (to YN); Shenyang Municipal Young and Middle-aged Talent Program for Scientific and Technological Innovation, No. RC200238 (to YN); Graduate Student Science and Technology Innovation Fund Project of Shenyang Medical College, No. Y20210503 (to LYJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

蛋白质乙酰化：蛋白质翻译后修饰种类之一，指蛋白在乙酰基转移酶的催化下，将乙酰基团转移并添加在氨基酸残基的过程，在调控染色质结构、基因转录以及蛋白质功能中发挥重要作用。
丁酸钠：去乙酰化酶抑制剂，可升高体内蛋白质乙酰化修饰水平，其有效成分为丁酸，属短链脂肪酸，由肠道微生物发酵膳食纤维而产生的微生物代谢物，为方便应用将其制为钠盐结构形式，近几年作为一种认知增强剂，广泛应用于神经系统疾病的治疗。

背景：乙酰化作为蛋白质翻译后修饰之一可通过调节染色质结构诱导与突触连接、记忆存储相关的基因表达变化。去乙酰化酶抑制剂丁酸钠的神经保护效应在神经系统损伤领域受到重视，但在氟神经毒性领域还未有动物实验证实，其作用靶点也尚不全面。
目的：研究丁酸钠对氟中毒脑损伤模型大鼠的干预作用，并对其可能机制做初步探讨。
方法：初断乳SD雄鼠随机分成3组，氟中毒组和丁酸钠治疗组大鼠自由饮用含氟蒸馏水10周，丁酸钠治疗组大鼠染氟10周后每日给予1 000 mg/kg丁酸钠灌胃处理，持续4周，氟中毒组、对照组大鼠灌胃等量生理盐水。灌胃4周后，Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力，苏木精-伊红染色观察大鼠脑皮质病理变化；高效液相色谱-串联质谱法鉴定各组大鼠脑皮质乙酰化修饰蛋白，并对其进行生物学信息分析。

结果与结论：①与对照组相比，氟中毒组大鼠体质量下降、全脑系数上升。与氟中毒组大鼠相比，丁酸钠治疗组大鼠体质量有所上升，大鼠全脑系数下降。②苏木精-伊红染色结果显示，氟中毒组大鼠出现神经细胞胞浆空泡化，细胞核固缩，核周间隙增宽。丁酸钠治疗组大鼠正常神经细胞数量增多，胞浆空泡化减少，细胞核固缩现象减轻。③GO和KEGG富集分析显示，大量差异乙酰化修饰蛋白显著富集于突触囊泡循环、突触传递、神经递质运输、跨膜物质转运等与突触可塑性相关的通路中。④将蛋白互作网路图数据导入Cytoscape软件，利用不同算法筛选排名前5的关键枢纽蛋白，分别为Hsp8、Rab7a、Nsf、Ezr、Cfl1，可能是氟神经毒性的致病因素以及丁酸钠潜在的治疗靶点。

https://orcid.org/0000-0003-1638-1496(李洋杰)；https://orcid.org/0000-0002-7039-1719(颜南)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 氟中毒, 丁酸钠, 蛋白质组学, 神经系统, 乙酰化修饰, 生物学信息, 学习记忆, 突触可塑性

Abstract: BACKGROUND: Acetylation, one of the post-translational modifications of proteins, can induce changes in gene expression related to synaptic connection and memory storage by regulating chromatin structure. Sodium butyrate, a deacetylase inhibitor, has been confirmed to play a neuroprotective effect in various neurological disease models, but it has not been confirmed in animal experiments in the field of fluorine neurotoxicity, and its targets are still not comprehensive.
OBJECTIVE: To study the effect of sodium butyrate on brain injury induced by fluorosis in rats and to preliminarily explore its possible mechanism.
METHODS: Newly weaned male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups. Rats in fluorosis group and sodium butyrate treatment group were given distilled water containing fluorine for 10 weeks. After 10 weeks of fluoride exposure, rats in the sodium butyrate treatment group were given 1 000 mg/kg sodium butyrate daily for 4 weeks. Fluorosis group and control group were intragastrically given the same amount of normal saline. Morris water maze was used to test the learning and memory ability of rats in each group. Pathological changes of the cerebral cortex were observed by hematoxylin-eosin staining. The acetylated modified proteins were identified by performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and their biological information was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the body mass of rats decreased and the whole brain coefficient increased in the fluorosis group. Compared with the fluorosis group, the body mass of rats increased in the sodium butyrate treatment group, and the whole brain coefficient of rats decreased. Hematoxylin-eosin staining results showed cytoplasmic vacuolation, nuclear pyknosis, and perinuclear space widening in nerve cells of the fluorosis group. In the sodium butyrate treatment group, the number of normal nerve cells increased, cytoplasmic vacuolation decreased, and nuclear pyknosis decreased. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses showed that a large number of differential acetylated modified proteins were significantly enriched in the synaptic vesicle circulation, synaptic transmission, neurotransmitter transport, transmembrane material transport,and other pathways related to synaptic plasticity. The data of protein-protein interaction network were imported into Cytoscape software, and the top five key hub proteins were identified by different algorithms, which were Hsp8, Rab7a, Nsf, Ezr, and Cfl1. These proteins may be the pathogenic factors of fluorine neurotoxicity and the potential therapeutic targets of sodium butyrate.

Key words: fluorosis, sodium butyrate, proteomics, nervous system, acetylation modification, biological information, learning and memory, synaptic plasticity

中图分类号:

李洋杰, 祁荣, 张馨予, 程佳佶, 周柠, 崔雪, 程双, 王正东, 颜南. 丁酸钠对氟中毒模型大鼠的神经保护及乙酰化蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3151-3157.

Li Yangjie, Qi Rong, Zhang Xinyu, Cheng Jiaji, Zhou Ning, Cui Xue, Cheng Shuang, Wang Zhengdong, Yan Nan. Neuroprotective effects of sodium butyrate and acetylation proteomics analysis in fluorosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3151-3157.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析实验入选30只健康初断乳SD雄鼠，分为3组，每组10只，实验过程中无脱失，均纳入结果分析。
2.2 体质量与全脑系数与对照组相比，氟中毒组大鼠精神萎靡，活动减少，皮毛无光泽，食量减少，体质量下降，全脑系数上升(P < 0.05)。与氟中毒组大鼠相比，丁酸钠治疗组大鼠较为活跃，体质量有所上升，大鼠全脑系数下降(P < 0.05)，见图1。

2.3 脑皮质病理学变化对照组神经细胞形态完整，胞浆丰富淡染，核膜完整，核仁明显，未见异常表现。氟中毒组大量神经细胞尼氏体消失，细胞破碎溶解，胞浆空泡化严重，细胞核固缩，颜色明显变深呈蓝紫色，细胞核周围间隙增宽。与氟中毒组相比，丁酸钠治疗组大鼠神经细胞得到一定修复，正常神经细胞数量增多，可见完整的细胞质和细胞核，细胞空泡化减少，细胞核固缩现象减轻，见图2。

2.4 Morris水迷宫检测结果在定位航行实验中，与对照组相比，氟中毒组大鼠逃避潜伏期明显增加(P < 0.01)，丁酸钠治疗组与氟中毒组大鼠相比，逃避潜伏期有所减少(P < 0.05)，见图3A。在空间探索实验中，与对照组相比，氟中毒组大鼠在目标象限的游泳时间和通过逃逸平台的次数减少；与氟中毒组相比，丁酸钠治疗组大鼠在目标象限的游泳时间和通过平台的次数增加(P < 0.05)，见图3B，C。此外，各组大鼠游泳速度无显著差异，说明各组大鼠运动能力无差别。氟中毒组大鼠空间学习记忆能力受损。经丁酸钠处理后，大鼠寻找平台的能力提升，空间学习记忆能力得到一定程度的恢复，见图3D。

2.5 乙酰化修饰蛋白质谱鉴定结果通过LC-MS/MS质谱分析，对照组、氟中毒组、丁酸钠治疗组分别得到5 515，5 915，7 141个肽段，其中包括474，496，578个乙酰化肽段数，乙酰化修饰的肽段数为鉴定到全部肽段数的10%左右。对照组、氟中毒组、丁酸钠治疗组分别鉴定到808，863，1 002个蛋白，其中包括327，338，391个乙酰化蛋白，发生乙酰化的蛋白数量约为鉴定到蛋白总数的25%。与对照组和氟中毒组相比，丁酸钠治疗剂组乙酰化修饰整体水平略有上升，见图4。

对3组的乙酰化修饰蛋白进行韦恩图绘制，3组有114个蛋白重合均发生乙酰化修饰，见图5。值得注意的是，对照组和丁酸钠治疗组有52个蛋白重合均发生了乙酰化修饰，而在氟中毒组大鼠脑皮质中并未发生乙酰化修饰，为下一步挖掘致病因素与治疗机制提供方向。

2.6 乙酰化修饰蛋白GO功能富集分析将上述52个蛋白导入Gene Ontology数据库，并进行功能富集分析，GO分析包括生物学过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)3个部分，选取P值最大的前10个进行柱状图绘制。在生物学过程中，乙酰化修饰蛋白富集较为均匀，包括宿主与病毒相互作用、宿主对共生过程的调节、细胞极性的建立或维持、神经递质运输、神经递质水平的调节、膜对接等生物学过程。在细胞组分中，乙酰化修饰蛋白显著富集于突触功能，包括神经元间突触、突触后密度、不对称突触、突触后膜特化、突触膜、细胞外囊泡、囊泡运输、突触囊泡、Schaffer侧支至海马CA1区突触传递。在分子功能中，乙酰化修饰蛋白显著富集于跨膜物质转运如离子跨膜转运蛋白活性及其磷酸化机制、钙通道调节活性、ATP酶偶联离子跨膜转运体活性、钠与钾跨膜转运蛋白活性及其磷酸化机制等，见图6。

2.7 乙酰化修饰蛋白KEGG通路富集分析将上述52个蛋白导入KEGG Pathway数据库，并利用Metascape软件进行通路富集分析，收集P值< 0.01、最小计数为3且富集因子> 1.5的通路进行气泡图绘制。该修饰蛋白显著富集于胃酸分泌、突触囊泡循环、碳代谢、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、促性腺激素分泌、紧密连接、胰高糖素信号通路、细胞内吞作用等通路中，见图7。

2.8 乙酰化修饰蛋白的互作网络分析将上述52个蛋白导入STRING数据库绘制互作网络图，最低互动分数设置为0.4，隐藏图中断掉的节点，线条粗细表示数据支持的强弱，获得34个蛋白质节点，边数44的蛋白互作网络图，见图8。将蛋白互作数据导入Cytoscape软件，利用cytohubba插件的不同算法筛选排名前5的枢纽蛋白，见表1，将不同算法的枢纽蛋白出现次数排序，取出现次数最多的前5个为关键蛋白，分别为Hsp8、Rab7a、Nsf、Ezr、Cfl1，见图9。与对照组相比，这些蛋白在氟中毒大鼠脑皮质中并无乙酰化修饰，但经过丁酸钠治疗后，该蛋白出现乙酰化修饰的改变，或为氟神经毒性的致病因素以及丁酸钠潜在的治疗机制，为下一步分子生物学领域的验证奠定基础。

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引言

由于地质原因和工业污染，饮用水氟含量超标是困扰许多发展中国家的地球环境健康问题[1]。据报道，非洲最大的国家阿尔及利亚南部和撒哈拉地区的水中氟化物含量为中度至高度水平[2]。氟化物的长期过量接触可引起中枢神经系统的组织病理学变化和各种异常功能破坏，过量的氟可随血液循环系统进入神经系统，诱导海马、大脑皮质和小脑出现显著的神经退行性改变，使该区域神经元出现萎缩、断裂甚至凋亡的迹象[3]。流行病学调查研究显示，氟中毒水平与儿童智商发育情况以及老年人认知水平密切相关，氟中毒亦是影响儿童学习记忆能力以及老年人认知能力的潜在危险因素[4-5]。
近几年高通量蛋白质组学技术的不断发展带动了神经表观遗传学领域的拓展进步，也为氟中毒神经系统损伤的治疗迎来了新的可能。神经表观遗传学与整体神经元功能联结，在学习以及记忆维持等过程中发挥重要作用[6]。乙酰化作为研究最为广泛的蛋白质翻译后修饰之一，由乙酰化转移酶和去乙酰化酶共同调节[7]。去乙酰化酶常作用于肽链中的赖氨酸残基，可通过去除残基上的乙酰基改变蛋白质的染色质结构[8]。丁酸是最早发现可抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性的内源性物质之一，为了方便其应用将其制造为更为稳定的钠盐结构形式[9]。作为一种选择性认知增强剂，丁酸钠在阿尔茨海默病、亨廷顿病、新生儿缺血缺氧性脑病、缺血性脑卒中等多种神经系统损伤疾病模型中被证实有神经保护效应[10-13]。课题组前期体外研究证实，丁酸钠可抑制氟中毒后小胶质细胞过度活化以及炎症因子增多[14]。JIANG 等[15]研究亦证实，丁酸钠可通过抑制神经炎症改善阿尔茨海默病小鼠的突触可塑性损伤。
此外，丁酸钠的有效成分丁酸，属于微生物代谢物短链脂肪酸，是通过肠道菌群发酵膳食纤维所产生的，因此几乎无毒性，但在大脑中的生物利用度低，必须使用高剂量来观察对其大脑中组蛋白去乙酰化酶活性的直接影响[16]。该研究通过动物实验验证丁酸钠对氟神经毒性的保护作用，并通过液相色谱-串联质谱法对各组大鼠的乙酰化修饰蛋白进行生物学信息分析，从神经表观遗传学角度挖掘丁酸钠潜在的治疗机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3-12月在沈阳医学院公共卫生学院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物初断乳SD雄鼠(SPF级)30只，体质量(60±10) g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001，全部动物饲养于沈阳医学院动物实验中心，动物房室温(24±2) ℃，相对湿度(55±5)%，12 h/12 h明暗循环照明条件。该研究经沈阳医学院实验动物伦理委员会批准，批准号：SYYXY2019040602，并按照《辽宁省实验动物管理规定》执行。
1.3.2 实验试剂与仪器氟化钠(Sigma，美国)；丁酸钠(Macklin，中国)；二甲苯(阿拉丁，中国)；无水乙醇(国药，中国)；苏木精(Solarbio，中国)；醇溶(Sangon，中国)；胰酶(Promega，美国)；乙腈(Fisher Chemical，美国)；尿素(Sigma，美国)；石蜡切片机(Leica，德国)；电热恒温鼓风干燥箱(精宏，上海)；智能生物显微镜(Olympus，日本)；JD100电子天平(沈阳龙腾电子，中国)；Morris水迷宫(成都泰盟，中国)；C18液相色谱柱(Thermo，美国)；Q-Exactive质谱仪(Thermo，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 30只初断乳SD雄鼠适应性喂养1周后随机分为3组(10只/组)，分别为氟中毒组、对照组、丁酸钠治疗组。根据丁酸钠神经保护效应的以往文献研究，丁酸钠对大鼠的应用剂量在500-1 000 mg/kg，因此该研究使用1 000 mg/kg丁酸钠作为氟中毒神经系统损伤的拮抗剂[16]。氟中毒组与丁酸钠治疗组全程饮用100×10-6含氟蒸馏水，对照组全程饮用蒸馏水。在饮用含氟蒸馏水10周后，对丁酸钠治疗组大鼠每日灌胃1 000 mg/kg丁酸钠，对照组和氟中毒组灌胃等量生理盐水，丁酸钠处理持续4周，灌胃期间染毒剂量不变。氟中毒组与丁酸钠治疗组大鼠饮用含氟蒸馏水14周后氟斑牙症状明显，结合后续苏木精-伊红染色以及水迷宫实验结果，氟中毒神经系统损伤大鼠模型建立成功。
1.4.2 Morris水迷宫检测丁酸钠灌胃结束(4周)后，各组大鼠进行Morris水迷宫实验检测学习记忆能力。Morris水迷宫系统包括120 cm×50 cm圆形水池、逃逸平台、计算机以及自动追踪成像系统。实验包括5 d的空间探索以及1 d的定位航行2个部分。在定位航行实验中，逃逸平台放置于第四象限，大鼠在100 s内寻找平台，并在平台停留3 s视为寻找成功，记录大鼠找到平台的时间即逃避潜伏期，若大鼠未能在100 s内找到平台，则有研究人员引导大鼠在平台停留15 s。在空间探索定位航行实验中，平台被撤去，记录大鼠在100 s内穿越原平台区域的次数、平台所在象限的时间以及大鼠的总路程。

1.4.3 样本采集 Morris水迷宫结束后称量大鼠体质量，2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。每组3只大鼠行心脏灌流术，依次灌注生理盐水和40 g/L多聚甲醛固定脑组织，40 g/L多聚甲醛浸泡脑组织4 ℃冰箱存放用于苏木精-伊红染色。每组7只大鼠断头取脑组织，生理盐水冲洗后于精密天平称量脑组织湿质量，-80 ℃冰箱存放用于乙酰化蛋白组学检测。
1.4.4 体质量与全脑系数各组大鼠处死前于电子天平称量体质量，麻醉后冰上断头取脑，生理盐水冲洗后精密天平称全脑质量，根据公式计算全脑系数：全脑系数=脑质量(g)/体质量(g)×100。
1.4.5 苏木精-伊红染色脑皮质修块后乙醇梯度脱水，经石蜡包埋切成5 μm薄片，并移到载玻片上烘干，切片脱蜡至水后苏木精-伊红染色，中性树胶封固，光镜下观察脑神经细胞形态变化。
1.4.6 蛋白质提取各组大鼠脑皮质中加入制备好的裂解液后(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制剂)，冰上超声研磨，4 ℃下以 12 000×g离心15 min，将上清液转移到新试管中，弃去细胞碎片，BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，将样品分装后冻存于-20 ℃储存。蛋白溶液以1∶50的质量比添加胰蛋白酶，37 ℃孵育过夜，以完全消化蛋白质混合物，酶解后的肽段去盐后冷冻干燥存放。
1.4.7 液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC MS/MS) 分离后的多肽混合物经Acclaim PePmap C18反相色谱柱分离，反相C18色谱柱安装在
Dionex ultimate 3000纳米LC系统上。使用梯度为5%-80%的乙腈在0.1%甲酸中洗脱45 min，恒定流速。Q Exactive质谱仪进行串联质谱分析，设置为正离子模式和依赖数据的方式，全扫描范围350-2 000 m/z，全扫描分辨率为70 000，MS/MS扫描分辨率为35 000。MS/MS扫描最小信号阈值1.0×105，隔离宽度为2 Da。
1.4.8 数据搜索与生物学信息分析原始质谱数据通过MASCOT检索程序进行数据库检索，筛选假阳性概率FDR值小于1%的乙酰化修饰肽段。固定修饰设置为Carbamidomethyl(C)，可变修饰设置为Acetyl(K)，Acetyl(N-term)，Acetyl(Protein N-term)，Gln-pyro-Glu (N-term Q)，Oxidation(M)。一级肽段质量偏差为15×10-6，二级肽段质量偏差为 20 mmu，允许最大的漏切数量为2。将所得蛋白组学数据导入2019_uni_rattus rattus数据库进行功能注释。通过Gene Ontology Database对乙酰化蛋白进行GO功能显著性富集分析。KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库对乙酰化蛋白进行通路富集分析。STRING数据库绘制蛋白互作网络图，并将蛋白互作数据导入Cytoscape软件，利用cytohubba的不同算法筛选排名前5的关键枢纽蛋白。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠的体质量以及全脑系数；
②Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力变化；③苏木精-伊红染色检测大鼠脑皮质病理学变化；④乙酰化蛋白组学结合生物信息学分析对丁酸钠拮抗氟神经毒性的靶点进行初步挖掘。
1.6 统计学分析应用GraphPad Prism 8进行统计分析，实验数据均使用Mean±SEM表示，组间比较采用One-way ANOVA方差分析中的Dunnett’s多重比较检验方法。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过沈阳医学院生物统计学专家审核。

讨论

在过去的几十年里，表观遗传学机制成为神经科学领域的研究热点之一。多位研究学者揭示了控制基本神经生物学功能和多种神经系统疾病的基因均存在广泛的表观遗传调控[17-18]。染色质修饰酶在响应外部环境刺激以及神经调节等方面发挥了关键作用。DNA的表观遗传修饰能够引发突触可塑性相关基因的可遗传变化，这些变化是维持各种形式记忆的基础[19]。但在氟中毒神经系统损伤领域的研究尚不全面。
已有越来越多的证据表明，乙酰化作为研究最广泛的修饰种类之一，在大脑记忆形成过程中的转录控制中发挥着重要作用[20]。组蛋白去乙酰化酶1-3可诱导神经毒性，在多种神经退行性疾病中均有表达增加的趋势[21-22]。组蛋白去乙酰化酶1-3抑制剂的使用可增加突变型亨廷顿蛋白K444位点的乙酰化，从而促进自噬体降解以增强神经保护[23]。组蛋白去乙酰化酶1和组蛋白去乙酰化酶2的表达上调可诱导组蛋白3和4乙酰化降低，最终导致突触功能障碍和学习记忆能力障碍[24]。因此，通过使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和乙酰化转移酶激活剂增加蛋白乙酰化修饰水平的表观遗传疗法是一种有前途的新兴治疗方法[25]。该研究以神经表观遗传疗法为切入点，通过苏木精-伊红染色和Morris水迷宫证实去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对氟中毒神经系统损伤的改善作用。
为对其治疗靶点进行初步探索，该研究进行乙酰化修饰蛋白质组学鉴定各组的乙酰化修饰蛋白，并筛选了与对照组以及丁酸钠治疗组相比，氟中毒组差异的乙酰化修饰蛋白，对其进行生物信息学分析。GO与KEGG通路富集分析显示，差异乙酰化修饰蛋白同时富集于神经递质转运、突触囊泡循环、突触传递等。突触可塑性包括突触传递可塑性、突触发育可塑性和突触形态的可塑性。记忆最初是作为短期记忆形成的，后来以突触连接的形式稳定下来。这种长期记忆的稳定称为记忆巩固，需要突触可塑性基因的表达和蛋白质合成。Jiang等[26]学者证实，氟化钠可剂量依赖性地诱导大鼠海马神经元损伤和细胞凋亡，减弱海马齿状回区域的神经发生，降低突触标志物即突触素和突触后密度95的蛋白水平，表明氟神经毒性可诱导大鼠突触功能受损。
此外，突触可塑性基因的表达在转录水平受到表观遗传机制的严格调控，其中乙酰化作为研究最广泛的表观遗传修饰，可通过中和赖氨酸正电荷，帮助染色质致密化，促进转录机制的进入，与突触可塑性以及学习记忆功能密切相关[27]。2004年LEVENSON等[28]首次使用丁酸钠在记忆形成的关键阶段人工提高大脑中的组蛋白乙酰化，发现突触传递长时程增强以及恐惧记忆增加。此后丁酸钠作为一种表观遗传疗法被广泛应用于各种神经系统疾病模型。据最新的研究报道证实，丁酸钠可改善阿尔茨海默病小鼠海马中树突棘密度降低和突触后致密蛋白95、突触素的表达减弱[15]。
乙酰化蛋白互作网络的构建将丁酸钠潜在治疗机制的挖掘进一步缩小，该研究利用Cytoscape软件的不同算法筛选蛋白互作网络中排名前5的关键枢纽蛋白，分别为Hsp8、Rab7a、Nsf、Ezr、Cfl1。Hsp8又称Hspa8、Hsc70，属热休克蛋白家族A成员，是一类分子伴侣[29]，在神经元细胞中，Hspa8与突触传递有关。Hspa8底物结合域和羧基末端域可以直接与酪氨酸羟化酶相互作用以调节其活性，将其定位到突触囊泡，从突触前机制控制多巴胺能神经递质的存储与释放，从而最大限度地减少细胞溶质多巴胺水平及其毒性作用[30]。众所周知，α-突触核蛋白聚集发生于帕金森病、阿尔茨海默症等多种神经退行性疾病[31]。延时显微镜证实，在HEK293细胞中，随着Rab7的过度表达，α-突触核蛋白颗粒逐渐清除[32]。在大鼠脑纹状体中，Rab7减少了α-突触核蛋白诱导的多巴胺能轴突末端损伤，此结果似乎与自噬溶酶体运输有关[33]。此外已有研究证实Hsc70可通过识别Rab7介导自噬底物蛋白转移到溶酶体的内腔中[34]。Nsf属囊泡融合ATP酶，是囊泡运输融合途径所必需的蛋白之一。Nsf与可溶性Nsf附着蛋白(SNAP)结合，后者与SNAP受体(SNARE)结合，形NSF-SNAP-SNARE复合物在调节囊泡运输中起着关键作用[35]。
在脑缺血、癫痫、精神分裂症中均存在NSF-SNAP-SNARE共同作用的膜融合机制破坏[36-37]。
Ezrin是一种膜与细胞骨架连接蛋白，Paola Merino通过增加突触后密度中Ezrin丰度，使突触后末端的肌动蛋白聚合，诱导因急性缺血性中风而受损的树突棘和突触接触的恢复[38]。此外，乙酰化修饰参与了Ezrin的功能，Ezrin的FERM结构域中存在4个乙酰化位点，它们可被乙酰转移酶p300/CBP乙酰化[39]。去乙酰化酶抑制剂治疗可以恢复 Ezrin表达，并对肿瘤细胞转移产生不利影响，但其乙酰化修饰在神经系统领域的作用尚未可知[40]。Ezrin依赖的肌动蛋白重塑涉及
Cofilin，Cofilin在神经系统发育中具有重要功能，包括神经发生、神经突伸长、树突棘形成以及突触传递等，这些是正常发挥突触可塑性的关键成分[41]。Cofilin1作为该家族在神经元中的主要代表可通过介导肌动蛋白动力学调控树突棘形态，稳定小鼠长期情境性恐惧记忆以及记忆巩固[42]。此外在Cofilin基因敲除小鼠中存在突触可塑性缺陷，学习与记忆功能损伤[43-44]。
综上所述，该研究使用去乙酰化酶抑制剂丁酸钠应用于氟神经毒性领域的治疗，通过体内实验证实其神经保护效应，并通过乙酰化蛋白质组学结合生物信息学对其治疗机制进行进一步挖掘，筛选了5个关键枢纽蛋白Hsp8、Rab7a、Nsf、Ezr、Cfl1，可能通过神经递质转运、突触囊泡循环、突触传递等与突触可塑性相关的多种途径参与了氟神经毒性的致病机制以及丁酸钠的拮抗机制，但还缺少分子生物学领域的进一步验证，这也是下一步研究方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丁酸钠对氟中毒模型大鼠的神经保护及乙酰化蛋白组学分析

Neuroprotective effects of sodium butyrate and acetylation proteomics analysis in fluorosis rats

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