时钟基因调控低氧训练肥胖大鼠白色脂肪组织棕色化

doi:10.12307/2024.234

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2473-2480.doi: 10.12307/2024.234

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

时钟基因调控低氧训练肥胖大鼠白色脂肪组织棕色化

史东子1，2，张华3，孟昶2，李昕睿2，董盼盼2，田雪文1，王清路1

1山东体育学院，山东省科学健身指导中心，山东省济南市 250102；2齐鲁医药学院，山东省高校生物医学工程技术重点实验室，山东省淄博市255300；3广东科学技术职业学院，体育健康学院，广东省珠海市 519090

收稿日期:2022-06-28 接受日期:2023-02-24 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-29
通讯作者: 王清路，博士，教授，山东体育学院，山东省科学健身指导中心，山东省济南市 250102
作者简介:史东子，女，1992年生，山东省莒县人，汉族，齐鲁医药学院毕业，主要从事运动与脂肪代谢方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31701042)，项目负责人：田雪文

Clock genes regulate the browning of white fat in obese rats undergoing hypoxia exercise

Shi Dongzi1, 2, Zhang Hua3, Meng Chang2, Li Xinrui2, Dong Panpan2, Tian Xuewen1, Wang Qinglu1

1Shandong Scientific Fitness Guidance Center, School of Sports and Health, Shandong Sport University, Jinan 250102, Shandong Province, China; 2Key Laboratory of Biomedical Engineering & Technology in Shandong Province Universities, Qilu Medical University, Zibo 255300, Shandong Province, China; 3School of Sports and Health, Guangdong Polytechnic of Science and Technology, Zhuhai 519090, Guangdong Province, China

Received:2022-06-28 Accepted:2023-02-24 Online:2024-06-08 Published:2023-07-29
Contact: Wang Qinglu, PhD, Professor, Shandong Scientific Fitness Guidance Center, School of Sports and Health, Shandong Sport University, Jinan 250102, Shandong Province, China
About author:Shi Dongzi, Shandong Scientific Fitness Guidance Center, School of Sports and Health, Shandong Sport University, Jinan 250102, Shandong Province, China; Key Laboratory of Biomedical Engineering & Technology in Shandong Province Universities, Qilu Medical University, Zibo 255300, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 31701042 (to TXW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

时钟基因：主要调控生物体的昼夜节律，可以对光、温度、摄食、化学因子等环节刺激的信号产生反应，该类基因与生物体各类物质代谢均具有相关性。
白色脂肪棕色化：是脂肪降解的关键，低氧训练可以诱导脂肪降解，驱动白色脂肪棕色化。棕色脂肪组织中含有丰富的线粒体，可通过解偶联蛋白1介导的氧化磷酸化途径，将氢离子回流势能转化为热能，消耗体内储存的能量实现脂肪降解。

背景：低氧训练可以促进机体脂肪的降解，外界环境变化可影响动物昼夜节律，但昼夜节律变化对脂肪组织棕色化及脂肪降解的调控机制尚不明确。

目的：阐明时钟基因对低氧训练大鼠附睾脂肪组织棕色化的调控机制。
方法：喂养高脂饲料构建肥胖大鼠模型，造模成功后抽取40只肥胖大鼠随机分为4组，即常氧安静组、低氧安静组、常氧训练组、低氧训练组，每组10只，进行4周的干预。安静组大鼠不实施干预；低氧组大鼠全天生活在氧浓度为13.6%的低氧仓中；训练组第1周为适应性训练，后3周训练速度和时长保持不变。测量肥胖大鼠体质量、体长和肾周脂肪质量；并使用血脂生化检测试剂盒检测肥胖大鼠血清中三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇水平；油红O染色观察肝脏脂肪含量变化；苏木精-伊红染色评价各组大鼠附睾脂肪组织棕色化变化；转录组测序技术结合生物信息学分析脂肪组织中转录组水平变化；采用qRT-PCR检测附睾脂肪组织中PGC-1α、Beclin1、KLF2、Perilipin1 mRNA的表达变化情况。

结果与结论：①低氧训练干预使营养性肥胖大鼠体质量、脂体比、Lees’s指数、血清总胆固醇、三酰甘油以及低密度脂蛋白胆固醇浓度显著降低(P < 0.01)，高密度脂蛋白胆固醇浓度显著升高(P < 0.01)；②油红O染色和苏木精-伊红染色显示，相比于常氧安静组、低氧安静组和常氧训练组，低氧训练更能有效促进大鼠肝脏组织中脂肪动员和附睾旁脂肪组织棕色化；③转录组测序结果显示，低氧训练时钟基因Dbp、Nr1d1、Sik1以及脂肪组织棕色化基因Ppargc1a(PGC-1α)等表达显著上调(P < 0.05)，而Arntl(Bmal1)显著下调(P < 0.05)，同时伴随物质代谢相关基因的表达增强；④qRT-PCR结果证实低氧训练时脂肪组织棕色化基因PGC-1α和脂代谢基因Perilipin1表达量均显著升高(P < 0.01)；⑤结果证实时钟基因在低氧训练促进脂肪组织棕色化过程中起到重要作用。

https://orcid.org/0000-0002-4389-8565(史东子)；https://orcid.org/0000-0002-2891-9399(王清路)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 低氧训练, 肥胖大鼠, 脂肪棕色化, 时钟基因, 昼夜节律

Abstract: BACKGROUND: Hypoxic exercise can promote the degradation of body fat, and changes in the external environment can affect the circadian rhythm of animals, but the mechanisms by which changes in circadian rhythm regulate adipose tissue browning and fat degradation are unclear.
OBJECTIVE: To elucidate the mechanism of clock gene regulation on epididymal adipose tissue Browning in obese rats undergoing hypoxia exercise.
METHODS: Forty obese rats were randomly selected and divided into four groups (n=10 per group): normoxic sedentary group, hypoxic sedentary group, normoxic exercise group, and hypoxic exercise group for 4 weeks of intervention. The rats in the sedentary groups were not intervened, while those in the hypoxic groups lived in a hypoxic chamber with an oxygen concentration of 13.6% for the whole day. In the exercise groups, adaptive training was performed in the 1st week, and the speed and length of training remained unchanged for the last 3 weeks. The body mass, body length and perirenal fat mass of obese rats were measured. Serum levels of triacylglycerol, total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol, and high-density lipoprotein cholesterol in obese rats were detected by a biochemical assay kit. Liver fat content was observed by oil red O staining. Hematoxylin-eosin staining was used to evaluate the browning of epididymal adipose tissue of rats in different groups. RNA sequencing combined with bioinformatics analysis was used to analyze transcriptome changes in adipose tissue. The mRNA expressions of PGC-1α, Beclin 1, KLF 2 and Perilipin 1 in epididymal adipose tissue were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Hypoxic exercise intervention significantly decreased body mass, body fat percentage, Lee’s index, serum triacylglycerol, total cholesterol, and low-density lipoprotein cholesterol levels (P < 0.01), and significantly increased high-density lipoprotein cholesterol level (P < 0.01). Oil red O staining and hematoxylin-eosin staining results showed that hypoxic exercise was more effective in promoting fat mobilization in liver tissue and promoting the browning of parepididymal adipose tissue compared with normoxic sedentary group, hypoxic sedentary group, and normoxic exercise group. RNA-seq results showed that hypoxic exercise significantly upregulated the expression of clock genes Dbp, Nr1d1, Sik1 and adipose tissue browning gene Ppargc1a(PGC-1α) and downregulated the expression of Arntl(Bmal1), accompanied by the enhanced expression of genes related to substance metabolism. qRT-PCR indicated that hypoxic exercise significantly increased the mRNA expression levels of PGC-1α and Perilipin1 (P < 0.01). Therefore, these findings indicate that clock genes play an important role in promoting adipose tissue browning during hypoxic exercise.

Key words: hypoxic exercise, obese rat, fat browning, clock gene, circadian rhythm

中图分类号:

史东子, 张华, 孟昶, 李昕睿, 董盼盼, 田雪文, 王清路. 时钟基因调控低氧训练肥胖大鼠白色脂肪组织棕色化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2473-2480.

Shi Dongzi, Zhang Hua, Meng Chang, Li Xinrui, Dong Panpan, Tian Xuewen, Wang Qinglu. Clock genes regulate the browning of white fat in obese rats undergoing hypoxia exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2473-2480.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析根据朱磊[14]对肥胖大鼠建模的判断标准，60只SD大鼠最终建模成功49只，随机挑选40只用于分组训练实验。40只大鼠全部进入结果分析，无脱落。
2.2 实验干预对肥胖大鼠形态学及血脂指标的影响高脂饮食喂养8周后，肥胖模型组大鼠体质量相比普通饲料对照组明显升高(P < 0.01)；大鼠的血脂4项指标总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇上升明显(P < 0.01)，高密度脂蛋白胆固醇下降，说明建模成功。肥胖大鼠经过4周实验干预后，常氧训练组和低氧训练组体质量、Lee’s指数和脂体比等均显著下降(P < 0.01)，其中低氧训练组的脂体比下降最明显，与常氧训练组形成显著对比(P < 0.01)，说明运动结合低氧最有利于减重降脂，见图2。

在实验干预后，常氧训练组、低氧安静组和低氧训练组大鼠的血脂指标比常氧安静组均有显著变化(P < 0.01)，表现在血清总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平下降，而参与胆固醇逆向转运的血清高密度脂蛋白胆固醇水平上升，结果见图3。以上结果说明低氧和运动的干预方式可从不同程度改善大鼠的肥胖，其中低氧结合运动的效果最明显。

2.3 低氧训练促进脂肪动员和棕色化取常氧安静组、低氧安静组、常氧训练组和低氧训练组大鼠肝脏组织，利用油红O染色分析肝脏组织中脂肪含量变化，结果如图4显示，低氧安静组、常氧训练组和低氧训练组均能显著降低肝脏组织脂肪含量，而低氧训练组降低效果最强，说明低氧训练能有效促进肝脏脂肪代谢。通过苏木精-伊红染色观察附睾旁脂肪组织发现，低氧训练有效减少脂肪细胞内脂肪含量，促进脂肪细胞变小，细胞内脂肪积累变少，见图4。

2.4 低氧训练导致昼夜节律改变脂肪组织RNA-seq数据基因本体论分析显示，常氧训练组/常氧安静组在昼夜节律、生物过程的正调控、代谢过程、多细胞有机体生物过程上存在显著变化；低氧训练组/常氧安静组除昼夜节律等发生显著变化外，大鼠对外界信号刺激反应等生物过程中也表现出显著变化；低氧训练组/常氧安静组与低氧安静组/常氧安静组相比，除昼夜节律失衡加强外，在多细胞有机体过程和代谢过程等生物过程也呈现显著差异。总之，与单纯运动干预相比，低氧训练干预在昼夜节律和三酰甘油脂解的调控上具有显著优势，见图5。

2.5 低氧训练加强物质代谢和改变脂肪组织微环境见图6。

KEGG结果显示，运动组/安静组在昼夜节律、果糖和甘露糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、胰高血糖素信号通路、雌激素信号通路、多巴胺能突触等信号通路显著性上调。低氧训练组/常氧安静组中机体组织发育、内分泌系统、环境适应、免疫系统、神经系统发生改变，参与运输和分解代谢的细胞过程增多，碳水化合物代谢的信号通路显著性上调。低氧安静组/常氧安静组中内分泌系统、环境适应、免疫系统、神经系统发生改变。低氧训练组/常氧训练组中碳水化合物代谢信号通路显著性上调。可见运动加强了物质代谢，而低氧改变了脂肪组织微环境。
2.6 低氧训练改变时钟基因表达基于RNA-seq数据，对各组基因本体论和KEGG结果关键基因表达变化进一步分析，结果如表2所示。

常氧训练组与常氧安静组相比，大鼠附睾脂肪组织中Dbp基因显著上调(P < 0.05)，表现在肝脏发育、昼夜节律等生物过程。常氧训练组/低氧安静组分析中，Hba-a3基因表达量上升，主要表现在氧气运输、蛋白质复合物寡聚化的生物过程。低氧安静组/常氧安静组分析中，Nr1d1、Sik1基因表达显著上调，通过葡萄糖的代谢调节、单糖的生物合成、糖异生的调节、昼夜节律过程等生物过程进行三酰甘油生物合成过程的负调控。有Medag、Arntl(Bmal1)、Fam111a基因表达显著下调，参与脂肪细胞的分化、氧化应激诱导的早衰、B型胰腺细胞发育的调控、病毒基因组复制的负调控等生物过程。
低氧训练组/常氧安静组分析中，在低氧安静组/常氧安静组原有上下调基因的基础上，脂肪酸转运的负调控、甘露糖代谢过程、黑素体组装、蛋白质分解代谢的调节等生物过程的调控增多，表现在Thbs1、Mpi、Rab38、Rnf144a基因的下调表达。同时在脂肪组织棕色化、促红细胞生成的反应、肽基脯氨酸修饰等过程的调控上，Ppargc1a(PGC-1α)、Mt2A、Fkbp5等基因的表达增多。
2.7 附睾脂肪组织棕色化相关基因表达 qRT-PCR结果(图7)显示，相对于常氧安静组，常氧训练组、低氧安静组和低氧训练组Hlf2表达均下调，该基因下调可抑制脂肪积累[15]。低氧安静组大鼠附睾旁脂肪组织中Beclin1基因表达增加，即低氧可诱导自噬，但是低氧训练组并没引起Beclin1表达上升。常氧训练组和低氧训练组均使附睾旁脂肪组织中PGC-1α基因表达上调，PGC-1α继而激活AMPK/PGC-1α信号通路促进脂肪组织棕色化[16]。常氧训练和低氧训练组附睾旁脂肪组织中Perilipin1基因表达上调，促进脂解[17]。Perilipin1特异性地在脂肪组织中表达，Perilipin1磷酸化能促进三酰甘油[18]。运动和低氧干预后脂解激素Perilipin1基因表达上调，说明干预可促进脂解过程的发生。综上可见，低氧训练激活脂肪组织AMPK/PGC-1α信号通路促进脂肪组织棕色化，加速脂解激素Perilipin1基因表达上调和抑制脂肪积累基因Hlf2表达下调。

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引言

随着经济发展和人民生活方式的改变，国内肥胖发病率正逐年上升，肥胖是白色脂肪组织过度蓄积引发的代谢障碍，可进一步诱发胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征及心脑血管疾病。研究表明高原低氧训练不仅能够提升肌肉处理乳酸的缓冲能力及机体效能，而且降低体质量和体脂的作用更显著[1]，在许多国家已经被用作肥胖类疾病治疗的方案[2]。低氧训练能够改善脂代谢，降低血脂水平，抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸分解和氧化，这是低氧训练明显降重、减脂的机制[3]。研究显示，低氧环境可增强正常成年人骨骼肌葡萄糖的吸收[4]，也可以改变生物体昼夜节律，改变昼夜节律的控制基因——时钟基因，时钟基因的表达变化加强了对糖脂代谢的调节，从而实现低氧干预促进肥胖大鼠减重[5-6]。
与降脂减重密切相关的变化是白色脂肪棕色化，该变化是脂肪降解的关键，低氧训练是否可以驱动白色脂肪棕色化及其机制如何，目前尚不清楚。棕色脂肪组织中含有丰富的线粒体，可通过解偶联蛋白1介导的氧化磷酸化途径，将氢离子回流势能转化为热能，消耗体内储存的能量实现脂肪降解[7]。其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG)共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是一种调节细胞能量代谢的转录共激活因子，高表达于棕色脂肪组织且表达水平具有昼夜振荡特点[8-9]，而在昼夜节律和物质代谢之间的整合者之一是时钟基因Nr1d1[10-11]。Nr1d1的整体缺失导致脂肪生成增加、脂肪组织扩张以及对饮食引起肥胖的过度反应[11]，也导致PGC-1α信号通路失活[12]。NR1D1蛋白与Bmal1启动子中的ROR元件结合并抑制其转录，从而导致Bmal1下调，引起生物钟在整体上改变。从以上可知，低氧训练可以促进肥胖大鼠降脂减重、白色脂肪组织棕色化，物质代谢与时钟基因之间存在关联，但是低氧训练对机体时钟基因表达变化及改变内脏脂肪棕色化转变的机制尚不清楚。由于大鼠附睾旁脂肪细胞因子表达量较少，但炎症因子分泌相对较高且脂解作用较强，因而此次研究建立肥胖大鼠模型并开展低氧训练，通过附睾脂肪组织形态学、分子生物学和RNA测序(RNA sequencing，RNA-seq)生物信息学分析，解析低氧训练影响昼夜节律并促进附睾白色脂肪组织棕色化的机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，采用双因素方差检验分析。
1.2 时间及地点实验于2019年1月至2020年12月在齐鲁医药学院实验动物中心完成大鼠建模、低氧训练；于2021年1月至2022年3月在山东体育学院完成形态学、分子、生物信息学等实验和数据分析。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用70只3周龄健康雌性SD大鼠，体质量(57±5) g，购自武汉华联科生物技术有限公司，动物合格证号：42010200002516。在适应性喂养3 d后，随机选取10只作为普通饲料组，其余大鼠喂养高脂饲料(脂肪供能比为60%的高脂饲料，购自华阜康，批号：D12492)构建肥胖大鼠模型，共喂养8周。大鼠饲养在齐鲁医药学院屏蔽级动物房，保持环境清洁、通风，环境温度(23±2)℃，相对湿度(55±2)%，昼夜循环时间12 h，期间自由采食、饮水。每周定时测量大鼠体质量和体长，记录摄食量。所有动物实验程序均经齐鲁医药学院伦理委员会和山东省动物调查委员会批准(批准号：第 2015206 号)。所有动物实验均按照中华人民共和国卫生部出版的《实验动物护理和使用指南》进行。
1.3.2 试剂及仪器 LineGene 9600 Plus实时定量PCR仪购自杭州博日科技股份有限公司；BX51金相显微镜购自奥林巴斯；血脂生化检测试剂盒总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇等购自建成生物工程研究所；qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Trizol试剂、反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；油红O和苏木精-伊红染色相关试剂以及其他化学试剂购自碧云天生物技术有限公司。
1.4 方法
1.4.1 实验分组和干预设计高脂饲养8周后选取体质量超过普通组20%的营养肥胖型大鼠作为模型组，肥胖模型组40只大鼠血清三酰甘油、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著升高(P < 0.05)，高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低(P < 0.05)，建模成功后转为普通饲料喂养。按随机数字表法分为4组，分别为常氧安静组、常氧运动组、低氧安静组和低氧运动组，每组10只。

按照冯俊鹏等[13]的干预方案，干预计划为期4周。安静组大鼠不实施干预，保持笼内正常活动；低氧组大鼠全天生活在氧体积分数为13.6%的低氧仓中(模拟海拔 3 500 m居住环境)；运动组大鼠进行跑台训练，训练在每天17时开始，每天1 h，每周5 d。第1周为适应性：常氧训练组和低氧训练组的跑台速度分别从13 m/min提高到25 m/min，从11 m/min提高到20 m/min，时长均从20 min/d增加到60 min/d；后3周速度和时长保持不变(图1)。

1.4.2 形态学指标和血液指标检测实验干预结束后，大鼠禁水禁食12 h，腹腔注射50 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，测量大鼠体长和体质量，并计算脂体比和Lee’s指数。脂体比=肾周脂肪(g)/体质量(g)×100%；Lee’s指数=体质量(g)1/3/体长(cm)×103。
采用眼龇取血方法获得外周血，3 000 r/min离心获得血清，采用血脂生化检测试剂盒测定血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇；取肝脏、附睾旁脂肪等用生理盐水清洗后备用。

1.4.3 qRT-PCR分析取0.1 g附睾脂肪组织用剪刀剪碎，倒入玻璃匀浆管中，充分研碎，使组织匀浆化，用Trizol试剂提取总RNA，再用试剂盒进行反转录得到对应 cDNA，利用 SYBR Green 染料进行qRT-PCR。反应总体积为20 μL，其中SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)体系(TianGen Biotech，Beijing)16.8 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.6 μL，cDNA模板2 μL。RT-PCR试验测定基因引物见表1，所有基因引物参照GenBank数据库，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

qRT-PCR于LineGene 9600 Plus实时定量PCR仪(杭州博日科技股份有限公司)上进行，经95 ℃、7 min预变性后，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，热循环40次。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt法计算相对表达量，每次实验重复3次。
1.4.4 脂肪组织转录组分析取每组3份大鼠附睾旁脂肪组织送生工生物工程(上海)股份有限公司进行组织RNA-seq测序分析，测序数据进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。
1.4.5 肝脏和附睾旁脂肪组织切片观察取肝脏和附睾脂肪1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm大小组织块，置于包埋盒的冷冻切片包埋剂Optimal cutting temperature compound(OCT)中，然后迅速将冷冻盒置于液氮中降温冷冻，冷冻5 min后置于德国徕卡冷冻切片机中切片。
苏木精-伊红染色：切片放入丙酮或体积分数95%乙醇瓶固定2 min后，进行苏木精染色(2 min)，水洗。分化液(数秒)1%盐酸乙醇，蓝化液(数秒)冷蓝液泛蓝液，伊红染色(2 min)，水洗。体积分数70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→100%乙醇*2次(均数秒)中性树胶封固，置于蔡司显微镜下观察脂肪组织的形态。
油红O染色：切片在40 g/L多聚甲醛中固定5 min，蒸馏水洗，60%异丙醇洗，60%油红O染色液10-15 min，60%异丙醇分色，蒸馏水洗，苏木精复染，自来水洗1-3 min蓝化，蒸馏水洗，甘油封固，观察组织中脂质含量(红色)。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠体长、体质量、脂体比；②各组大鼠血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平；③各组大鼠附睾脂肪组织中PGC-1α、Beclin1、KLF2和Perilipin1基因mRNA水平；④各组大鼠肝脏和附睾脂肪组织中脂肪细胞大小、脂肪含量；⑤附睾脂肪组织中转录组变化。
1.6 统计学分析数据以x±s表示，使用SPSS 20.0软件进行统计，对方差进行同质性测试后，针对低氧和运动两种因素的组间比较，多组间采用双因素方差分析，两组间行t检验。实验重复3次，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经齐鲁医药学院生物统计学专家孔浩教授审核。

讨论

3.1 运动促进白色脂肪棕色化高脂饮食会扰乱大鼠进食行为和改变肝脏及脂肪组织的分子水平的昼夜节律[19-20]。工作时间不规律、被迫暴露在光照下的轮班工人或夜班人员，他们的睡眠结构受到干扰，肥胖患病率增加[21-22]，可见不良的生活习惯和营养过剩造成国内人群肥胖患病率逐年上升。肥胖成为心血管病、糖尿病等疾病的重要危险因素，如今越来越多的研究致力于解决肥胖。运动是公认的改善脂代谢的手段，可以预防和治疗脂代谢相关疾病。在运动状态下，骨骼肌释放多种肌肉因子促进皮下白色脂肪棕色化，进而引起能量消耗增加，比如β-氨基异丁酸通过PGC1-α途径调控棕色化过程的基因表达；鸢尾素诱导白色脂肪棕色化；白细胞介素17A信号轴可以抑制饮食诱导的肥胖和代谢紊乱，促进脂肪组织“褐变”[23-24]。研究发现长期高海拔低氧暴露可以降低体质量，调节激素改善胰岛素敏感性和糖代谢，脂肪分解代谢提高，即低氧环境可以起到降脂减重的作用[25]。
棕色脂肪组织被认为是治疗人类糖尿病和肥胖的主要靶点[7]。棕色脂肪组织通过降低胰岛素抵抗和增加胰岛素分泌具有抗2型糖尿病作用[26-27]。Ppargc1a(PGC-1α)是类固醇受体和核受体的转录共激活剂，是整合哺乳动物生物钟和能量代谢的昼夜节律振荡器的关键组成部分。有研究发现，有氧耐力运动可上调骨骼肌中的PGC-1α，在应激状态(运动、缺氧、营养物质消耗等)下，ATP被消耗，AMP/ATP比例变化，AMPK作为生物体内的“能量感受器”，可通过多个位点磷酸化PGC-1α，增加骨骼肌线粒体发生，促进白色脂肪褐变，调控葡萄糖代谢、脂肪酸β氧化等[28-30]。运动可促进白色脂肪褐变，有利于代谢稳态[31]。PGC-1α作为白色脂肪棕色化的上游调控基因，在此次实验结果中显示低氧训练可以显著上调该基因表达，这与以往研究一致。
3.2 低氧训练改变时钟基因表达昼夜节律主要由位于下丘脑视交叉上核的中枢生物钟和外周组织(心、肺、肝等)的外周生物钟组成，可以对光、温度、摄食、化学因子等环节刺激的信号产生反应。核心时钟基因蛋白中，Bmal1、Clock可以形成异源二聚体激活Cry、Per等负调节因子的表达，反馈抑制Bmal1/Clock转录，从而调节物质代谢[32]。另外，孤儿核受体Nr1d1(Rev-erb α)和ROR α既是Bmal1/Clock的靶基因，也能分别抑制和促进Bmal1转录[33]，Dbp、Tef、Hlf等时钟基因也参与其中，从而表现为机体生命活动以24 h为周期的振荡[34]。缺氧诱导因子1α是最常见的氧传感蛋白之一，与CLOCK、Bmal1、Per1/2和Cry1/2属于转录调节因子PAS结构域超家族的一部分[35]。PAS 结构域使蛋白质能够感知氧气、光或新陈代谢[36]，缺氧可通过缺氧诱导因子1α重置生物钟[37]。
诸多研究证实缺氧诱导因子1α可以结合许多核心时钟基因的启动子，从而调节时钟基因的表达，例如PER1、PER2和 CRY1等基因[38-39]，即低氧响应和时钟基因转录网络之间存在直接的交叉，过表达的Bmal1/Hif1-α异质二聚体复合物可以激活低氧与时钟基因网络的“对话”[39]，进而调节物质代谢过程。研究发现，Bmal1/Clock复合体能够经过E-BOX基序与HSL和ATGL的启动子结合，从而调节脂分解[40]。
此次研究中建立了营养肥胖型大鼠模型，进行常氧和低氧跑步训练4周，低氧训练组的脂体率显著下降，总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇血清水平下降，参与胆固醇逆向的血清高密度脂蛋白胆固醇水平上升；苏木精-伊红染色显示，低氧训练组大鼠肝脏细胞脂肪含量降低，油红O染色证实低氧训练有效减少附睾旁脂肪细胞内脂肪含量，促进棕色化转变；另外对附睾旁脂肪组织转录组进行RNA-seq分析，发现时钟基因Dbp、Nr1d1、Sik1等表达显著上调，而Arntl(Bmal1)显著下调；同时伴随物质代谢增强相关基因的表达变化。
时钟基因(Bmal1和Nr1d1)控制脂质和氨基酸代谢的转录程序[41]。并且Nr1d1协调调节胆固醇生物合成通路中编码重要酶的绝大多数基因[11]，该基因缺乏会导致脂肪酸利用增加和高血糖[12]，与脂代谢密切相关。在常氧训练组时钟基因Dbp表达上调，Dbp是一种与胰岛素抵抗正相关的关键脂肪因子[42]，通过上调脂肪细胞分化改善胰岛素敏感性[43]。它的上调表现在昼夜节律和肝胆功能调节方面，同时该组大鼠体质量减轻、血脂下降，说明运动通过改变时钟基因强化肝胆对糖脂的代谢功能。
低氧干预的两组大鼠体质量下降、血脂降低，在显著表达的差异基因里，Sik1过表达，它可以抑制下游糖异生基因如PEPCK和G6Pase的表达[44]，降低SREBP-1c靶基因的表达水平[45]，调控血糖和肝脏脂肪生成。Thbs1的表达显著下调，即低氧改善了饮食诱导大鼠的肥胖相关炎症和胰岛素敏感性[46]。低氧训练组大鼠体质量下降尤为显著，血脂含量达到各组最低，有更多参与代谢的基因差异表达，Medag作为促进前脂肪细胞向脂肪细胞分化的成脂基因，它的表达明显下调，说明脂肪生成和葡萄糖摄取的减少[47]。主控性时钟基因Bmal1和主抑制性时钟基因Nr1d1普遍参与了2个低氧组的生物过程，表现为Bmal1表达减少、Nr1d1增加，即低氧诱导了时钟基因对糖脂代谢的调节。
3.3 时钟基因参与白色脂肪组织棕色化此次研究通过建立营养肥胖型大鼠模型进行低氧训练，证实低氧训练可以显著降低肥胖大鼠体质量，其中时钟基因发挥重要作用。在缺氧环境下，昼夜节律主控基因Arntl和Nr1d1的表达更明显，有流行病学研究表明，高海拔地区的肥胖、2型糖尿病、缺血性心脏病的发生率较低与缺氧有关[48]。有证据表明，缺氧暴露可影响人类的睡眠和昼夜节律模式，其核心体温振荡、24 h血糖节律和几种循环代谢物都受到干扰，缺氧诱导因子途径已经被证明对肌肉骨骼肌摄取和代谢非常重要[39]。生理范围内的氧循环足以以依赖缺氧诱导因子1的方式使细胞时钟同步，一些时钟基因通过缺氧诱导因子1α响应氧水平的变化[37]。低氧安静组和低氧训练组的生信分析结果中均出现Sik1基因和Nr1d1基因表达上调，表现在葡萄糖代谢、糖异生、昼夜节律等生物过程。有研究发现，过表达Sik1可降低cAMP转录共激活因子的磷酸化水平，抑制了它与CREB的结合，可降低对下游糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的激活[49-52]。孤儿核受体Nr1d1/Rev-erb α作为复杂转录机制的组成部分，它的周期性积累可引发核心时钟组件ARTNL/BMAL1的周期性抑制，还参与了代谢功能的调节，可抑制PEPCK和G6PC1调节糖异生，抑制PPARG调节脂肪细胞分化，实现脂肪组织棕色化转变；通过影响SREBP通路和Cyp7A1转录，正向调节胆汁酸合成[53]。进一步通过STRING(https://cn.string-db.org/)对时钟基因和脂肪组织棕色化基因预测分析发现，二者之间存在密切互作(图8)。

此次研究对脂肪组织棕色化关键基因PGC-1α分析发现，运动干预促进PGC-1α高表达，低氧干预后该基因表达下调；在低氧结合运动干预后，该基因表达可高于常氧安静组，说明缺氧以缺氧诱导因子1α依赖的方式抑制PGC-1α通路，导致该蛋白含量降低[24]，运动可刺激该基因表达，促进线粒体生物发生和机体能量维持，加强脂肪棕色化。
综上所述，此次研究通过构建低氧训练肥胖大鼠模型，发现低氧训练更能有效促进肝脏组织中的脂肪动员和附睾旁脂肪组织棕色化；RNA-seq和qRT-PCR结果显示，低氧训练昼夜节律时钟基因和脂肪组织棕色化基因表达显著上调，同时伴随物质代谢相关基因的表达增强。结果证实，控制昼夜节律的时钟基因在低氧训练促进脂肪组织棕色化过程中起到重要作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

时钟基因调控低氧训练肥胖大鼠白色脂肪组织棕色化

Clock genes regulate the browning of white fat in obese rats undergoing hypoxia exercise

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