低氧训练时心肌组织细胞低氧诱导因子1α与凋亡相关蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：运动对心肌细胞凋亡的影响有了比较多的研究，但低氧训练对心肌细胞凋亡的研究不多见。低氧诱导因子1α是否控制了Bcl-2家族的表达而影响凋亡发生，尚未明确。
目的：分析低氧训练时心肌组织低氧诱导因子1α蛋白表达情况与凋亡蛋白的相互关系。
方法：将健康雄性SD大鼠60只，随机分为6组：①对照组常温常氧下喂养，不运动。②低氧组在低氧环境下喂养，不运动。③运动组常温常氧下运动。④低住高练组常氧下居住，低氧、常氧训练交替进行。⑤高住低练组低氧下居住，常氧下训练。⑥高住高练低练组低氧下居住，低氧、常氧训练交替进行。运动组大鼠负荷跑台训练8周，训练每周6 d，运动速度和运动时间连续递增，运动速度从开始的10 m/min、持续时间为15 min递增至第8周的25 m/min、持续时间为50 min。低氧程度由开始从海拔1 500 m增加到第8周达到海拔3 600 m。训练结束后，运用苏木精-伊红染色、TUNEL法和蛋白免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织细胞低氧诱导因子1α、Bcl-2、Bax的表达变化。
结果与结论：①常氧时低氧诱导因子1α几乎不表达，低氧可增加低氧诱导因子1α的蛋白表达，低氧复合运动，表达更多。②低氧组和低氧运动组大鼠心肌组织Bax表达变化不是很明显，但Bcl-2表达就远远低于常氧不运动组。③低氧组、运动组与低氧运动组心肌组织细胞凋亡较明显，但三者相互之间比较差别较小，说明低氧结合运动不会使细胞凋亡更加严重。结果表明各实验组Bcl-2表达显著低于对照组，Bax表达变化不明显。但低氧可增加低氧诱导因子1α的蛋白表达，低氧复合运动，表达更多。说明低氧诱导因子1α有可能调节Bcl-2、Bax的表达，从而控制细胞凋亡的发生与否。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 低氧训练, 低氧诱导因子1, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: There are many comparative studies addressing the effect of exercise on apoptosis of cardiomyocytes, but few of them are reported on myocardial apoptosis after hypoxic training. It is unclear whether hypoxia-inducible factor 1α has some effects on cell apoptosis through controlling the expression of Bcl-2 family.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between the hypoxia-inducible factor 1α and apoptosis-related protein in the cardiomyocytes during hypoxic training.
METHODS: Sixty male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups: feeding at room temperature under normoxia and no training (control group); feeding at room temperature under hypoxia and no training (hypoxia group); normoxic training at room temperature (training group); feeding under normoxia+hypoxic training alternating with normoxic training; feeding under hypoxia and normoxic training; feeding under hypoxia+hypoxic training alternating with normoxic training. Rats in the exercise group were subjected to
treadmill training under loading for 8 weeks, 6 days a week. The moving speed and time were increased from 10 m/min and 15 minutes to 25 m/min and 50 minutes at the 8th week, respectively. Hypoxia degree was increased from 1 500 meters above sea level to 3 600 meters above sea leave at the 8th week. After training, hematoxylin-eosin staining, TUNEL method and western blot assay were used to detect the expressions of hypoxia-inducible factor 1α, Bcl-2 and Bax in the myocardial tissues of rats.
RESULTS AND CONCLUSION: Under normoxia, hypoxia-inducible factor 1α rarely expressed; while the expression of hypoxia-inducible factor 1α increased under hypoxia, especially under hypoxic training. Compared with the control group, Bax expression in the myocardial tissues had no changes in the hypoxia group and hypoxic training group, but Bcl-2 expression in these two groups was significantly lowered. Apoptosis in the myocardial tissues was obvious in the hypoxia, training and hypoxic training groups, but no significant difference was found among the three groups. These findings indicate that hypoxic training is unable to increase cell apoptosis and hypoxia-inducible factor 1α can control the cell apoptosis by regulating Bcl-2 and Bax expression.

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中图分类号:

R318

邹志兵. 低氧训练时心肌组织细胞低氧诱导因子1α与凋亡相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.019.

Zou Zhi-bing. Association between hypoxia inducible factor-1alpha and apoptosis-related proteins in the myocardial tissues under hypoxic training [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.019.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠心肌组织细胞的苏木精-伊红染色结果常氧组大鼠心肌细胞结构完整，细胞核比较大、比较圆，心肌纤维结构没有异常改变(如图1A)。低氧组和常氧运动组大鼠心肌细胞结构逐渐变化，大鼠核染色质固缩，集聚于核膜周边，细胞体变小(如图1B，C)。低氧运动组心肌细胞有较明显的肿胀现象，细胞之间开始出现间隙，逐渐与邻近细胞脱离的趋势，具有显著的凋亡特征(如图1D-F)。

2.2 大鼠心肌组织细胞的TUNEL结果低氧对照组、运动组和低氧运动组大鼠心肌组织细胞凋亡检测结果显示差别很小。但与对照组相比，各实验组的凋亡检测结果呈现显著性差异(P < 0.05)。见图2，表1。

2.3 大鼠心肌组织低氧诱导因子1α和Bax、Bcl-2免疫组织化学染色结果
2.3.1 低氧诱导因子1α 免疫组织化学研究结果表明，低氧诱导因子1α主要在细胞核内表达。对照组心肌组织中低氧诱导因子1α免疫阳性物质表达数量较小(图3A)；但伴随有低氧和训练因素介入时，低氧诱导因子1α免疫阳性物质表达的程度也开始升高(表2)。低氧组中低氧诱导因子1α较对照组在表达的面积和数量上都有明显的增多(图3B)；常氧运动组除了心肌细胞核中有表达外，胞浆中也有较弱的染色(图3C)；低住高练组、高住低练组出现有大量的阳性反应颗粒呈现在心肌细胞核中，细胞质中也有程度不是很明显的染色(图3D、E)；高住高练低练组有大量的心肌细胞核染成紫色，细胞浆中也有很强的阳性表达(图3F)。

2.3.2 Bax 各实验组大鼠心肌组织检测结果相互比较，无论是纵向、还是横向差异都较小。见表3，图4。

2.3.3 Bcl-2 低氧组、运动组和低氧运动组大鼠心肌组织与对照组比较，Bcl-2阳性指数PI值差异性比较显著，各组之间相互比较无明显差异性。见表3，图5。

参考文献

[1] Kerr JF,Rosen MD.Apoptosis:A basic biological phenomennon with widespread mplication in tissue kinetics. Br J Cancer.1972;26:239-257.

[2] 袁箭锋,常芸.运动训练与心血管系统细胞凋亡的现象[J].中国运动医学杂志,2001,20(3):301-303.
[3] 常芸,袁箭峰,祁永梅,等.运动心脏重塑与微损伤发生中的细胞凋亡现象[J].中国运动医学杂志,2003,22(4):344-349.
[4] 郭勇力,刘霞,张文峰,等.不同强度运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中国临床康复,2004,8(9):1732-1733.
[5] 袁海平,刘学.大鼠不同强度运动对心肌细胞凋亡及其抗氧化能力的影响[J].体育科学,2002,22(1):107-109.
[6] Tanaka M, Ito H, Adachi S,et al.Hypoxia induces apoptosis with enhanced expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardiomyoeytes.Cire Res 2004;75: 426-433.
[7] 洪欣,董宏彬,杜宏伟,等.低氧及低氧预处理时心肌细胞HIF-1α与凋亡相关蛋白表达的变化[J].中国应用生理学杂志,2005,21(4): 423-426.
[8] 王雪冰,路瑛丽,冯连世,等.不同低氧训练对大鼠腓肠肌糖酵解酶活性的影响[J]中国运动医学杂志, 2014,12(5):76-79.
[9] 邢维新.运动训练与心肌细胞凋亡研究的新进展[J].绵阳师范学院学报,2011,30(2):127-130.
[10] 张萍,邱健,李志樑.等,压力超负荷时左室心肌凋亡和fas蛋白的表达[J].中国临床康复,2003,7(15):2150-2151.
[11] 黄黎月,庄国洪,丘劲华,等.DcR3重组蛋白对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关分子的表达及细胞凋亡的作用[J].中国免疫学杂志, 2015,4(8):43-47.
[12] 李强,郭壮波,伍光颖,等.阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠内皮微颗粒及心肌细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2015,2(6): 56-59.
[13] 孙宇泽,李艳丽,赵勇,等.人生长素对雌性大鼠心力衰竭心脏重塑及心肌细胞凋亡的影响[J].医学研究杂志,2015,6(8):73-77.
[14] Leri A.Insulin-like growth factor-1induces Mdnd and down-regulates P53,atenuating the myocyte renin- angiotensin system and stretch-mediated apoptosis.Am J Pathol.2009;152(2):567-580.
[15] 杨海平.低氧、运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及bcl-2、bax表达的影响[J].中国运动医学杂志,2006,11(6):706-709.
[16] 林喜秀,瞿树林,周桔,等.低氧训练对大鼠心、肝、肾、海马组织细胞凋亡的影响及其机制研究[J].中国运动医学杂志,2012,2(2): 146-156.
[17] Wang GL, Jiang BH, Rue EA, et al. hypoxia inducible factor-1 is abasic helixloop -helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natn Acadsci USA.2005;92:5510-5514.
[18] 王宁琦,胡扬,赵华,等.低氧训练中血氧饱和度作为运动强度评价指标的可行性研究[J].中国运动医学杂志, 2014,10(6):44-48.
[19] 李靖,张漓,冯连世,等.高原或低氧训练对肥胖青少年减体重效果及血糖代谢相关指标的影响[J].中国运动医学杂,2014,05(8): 32-36.
[20] 徐建方,冯连世,张漓,等.常压低氧耐力训练对肥胖大鼠Visfatin水平的影响[J].体育科学,2014,2(6):45-48.
[21] 张奕奕, 薛一涛,李焱,等.心力衰竭与细胞凋亡及中医药研究进展[J].中国中医急症,2015,7(8):73-77.
[22] 田振军,张可,陈婷,等.运动锻炼上调M3R对MI大鼠心脏产生保护效应及其机制探讨[J].体育科学,2015,5(6):43-47.
[23] Cheng W, Li B, Kajstura J, et al. Stretch-induced programmed myocyte cell death.Clin Invest.2005; 96:2247-2259.
[24] Carmeliet P, Dor Y, Herbert JM, et at. Role of HIF-1αin hypoxia-mediated aopptosis,cellproliferation and tumor angiogenesis.nature.1998,394(6692):485-490.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2015年3至8月在广西民族大学完成。
1.3 材料健康雄性2.0月龄SD大鼠60只，体质量大约为200 g。喂养的饲料是按照啮齿类动物标准执行，室内温度控制在20-23 ℃之间，室内湿度控制在45%-55%之间，每天照光时间为12 h。
在实验室喂养1星期后，采用随机编号分为6个组别：对照组、低氧组、运动组、低住高练组、高住低练组和高住高练低练组，每组均为10只。

1.4 实验方法
1.4.1 运动训练安排采用动物实验跑台，进行递增负荷训练，每星期训练6 d，持续8周。运动速度和运动时间连续递增，运动速度从开始的10 m/min、持续时间为15 min递增至第8周的25 m/min、持续时间为50 min，递增的具体情况为速度每3 d增加1 m/min，持续时间每个星期增加 5 min。低练组每周逢双在海拔1 500 m的环境中训练，逢单在常氧下训练。
1.4.2 低氧情况低氧舱中氧含量的变化采用氧气监测仪实时监测，在低氧舱中居住有低氧训练组和低氧组大鼠，低氧程度从开始的1 500 m，每星期增加300 m，直至第8周，低氧程度达到3 600 m的高度。
1.4.3 标本制做实验结束后，分别从实验组中随机抽取4只大鼠作为取材对象，用戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠在试验操作台上固定，采用仰卧位，整个胸腔暴露；插入软管的地方靠近心脏的主动脉，固定扎紧，慢慢注入1%肝素 2 mL；再滴生理盐水0.5 L，浓度为0.85%，然后剪断下腔静脉；等滴完生理盐水后，换滴0.05 L多聚甲醛缓冲盐溶液，质量浓度为40 g/L，迅速滴完，整个过程大约为30 min；把整个心脏放在同样的固定液中固定1 d后，将心脏依照房间隔、室间隔所在的位置切开，按照常规方法脱水、透明、进蜡、包埋石蜡，用于制做实验标本。
1.4.4 苏木精-伊红染色将大鼠心脏标本放在40 g/L多聚甲醛缓冲盐溶液中固定大约24 h，然后按照常规方法进行石蜡包埋、切片。再按常用的脱蜡方法脱蜡、染色、封固。
1.4.5 免疫组织化学检测低氧诱导因子1α和Bax、Bcl-2 低氧诱导因子1α及Bax、Bcl-2蛋白表达情况采用试剂盒检测。石蜡切片按常规脱蜡至水，按照试剂盒说明书进行严格操作。每个实验组从6张切片中随机挑选3个视野点进行图像分析(采用Simple PCI图像分析系统进行分析)，测定阳性产物的表达。阳性指数(positive index，PI)结果为一定面积中吸光度值与阳性面积值的乘积。
1.4.6 细胞凋亡检测采用原位TUNEL细胞凋亡试剂盒进行细胞凋亡检测。标本切片常规脱腊至水，操作步骤由专业人员严格按照试剂盒说明书进行。由普通光学显微镜观察得知，细胞核呈棕黄色染色或呈棕褐色色染为阳性凋亡细胞，溢出细胞核里面的DNA碎片，也可以使部分细胞胞浆呈褐色；染成蓝色的是没有凋亡的正常细胞的细胞核，核形状较大，大小比较均匀。每张切片中随机观察6个点，使用400倍光学显微镜进行观察，数量为500个细胞左右。每100个细胞中的平均凋亡细胞数为凋亡指数，测试使用的软件为Simple PCI显微图像分析软件。
1.5 主要观察指标 ①大鼠心肌组织细胞的苏木精-伊红染色结果。②大鼠心肌组织细胞的TUNEL结果。③大鼠心肌组织低氧诱导因子1α和Bax、Bcl-2免疫组织化学染色结果。
1.6 统计学分析用SPSS 17.0统计软件处理实验数据。所有实验数据采用平x(_)±s表示，各组间的显著性差异水平采用方差分析。显著性水平标准为α=0.05，α ≤ 0.05具有显著性差异，α ≤0.01具有非常显著性差异。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

细胞凋亡是一个严格受基因调控的死亡过程。近年来，随着分子生物学技术研究的不断深入及心血管病分子学研究的不断发展，细胞凋亡现象已经证实存在于心血管系统的许多生理和病理变化过程中，也被同仁界认为是心脏开始由代偿性变化向生理性、病理性变化发展的细胞学基础。心肌细胞凋亡影响的因素有很多，例如自由基产生、钙超载出现、缺血缺氧、DNA出现损伤引发心肌细胞凋亡^[9-12]。氧化应激等激活物激活细胞色素C释放，激活胱天蛋白酶(caspases)，引起的细胞凋亡^[9]。细胞抗氧化能力下降，诱导细胞凋亡^[5]。机械力使心肌细胞氧耗增加，促发心肌细胞凋亡^[10]。心肌细胞牵张激活P53，引起Bcl-2/Bax的比率下降，诱导心肌细胞凋亡^[11，13]。在这些引起细胞凋亡的因素和发生过程中，凋亡调节蛋白Bcl-2及其家族成员在其中起着决定性的作用，但也有不依赖Bcl-2蛋白家族的细胞凋亡途径^[12]。
现已证实，低氧、运动和低氧训练都可以引起细胞凋亡。Bcl-2家族是否在这些细胞凋亡的机制中有作用呢？本研究表明，低氧、运动和低氧训练均可促发心肌细胞凋亡，在凋亡过程中心肌细胞当中的Bcl-2表达下降，而Bax变化不是很明显，从而使Bcl-2/Bax的比值降低，促发细胞凋亡。这与洪欣、杨海平等的观点相同^[7，14-15]，与林喜秀的的观点不一样^[16]，这是因为不同的实验，有不同的训练持续时间、不同的训练方式、不同的低氧环境而造成的。说明Bcl-2家族确实在低氧、运动和低氧训练引起心肌细胞凋亡的机制过程中发挥着关键的作用^[17]。
近年来，低氧诱导因子1在低氧细胞基因表达调节过程的研究是一个很多专家关注的热点。低氧诱导因子1主要通过低氧诱导因子1α和β形成异源二聚体，从而作用于所要调控的目的基因的转录区进行调控，控制其表达^[7]。低氧诱导因子在调节血管生成、增殖细胞、凋亡细胞、调节转录等方面发挥着重要的作用^[18-20]。现已证实，低氧诱导因子1在低氧介导的神经细胞、肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用，其作用机制就是通过抑制Bcl-2表达的信号途径来促进神经细胞核肿瘤细胞凋亡的^[21-23]。但是否低氧诱导因子1直接参与缺血、低氧时心肌细胞的凋亡过程呢？Carmeliet等^[24]研究表明低氧诱导因子1α与Bcl-2、P53因子的表达关系很密切。洪欣等^[7]的研究表明，低氧可诱导心肌低氧诱导因子1α的表达增强，而Bcl-2表达结果呈下降，Bax的表达结果呈上升，综上所述，低氧诱导因子1与细胞凋亡因子之间关系很紧密。本文的实验结果表明各实验组Bcl-2表达显著低于对照组，Bax表达变化不明显。但低氧可增加低氧诱导因子1α的蛋白表达，低氧复合运动，表达更多。说明低氧诱导因子1α有可能调节Bcl-2、Bax的表达，从而控制细胞凋亡的发生与否。
纵观上述研究，尽管低氧组、运动组和各低氧训练组与对照组比较，细胞凋亡具有显著的差异性，但各组之间相互比较，细胞凋亡却没有明显的变化，低氧因素结合运动因素并没有使细胞凋亡更加严重，而低氧复合运动，导致了低氧诱导因子1α蛋白的大量表达。这与林喜秀等^[22]的研究结果不相一致。低氧诱导因子1α在低氧导致的细胞凋亡中到底是诱导了细胞凋亡还是抑制了细胞凋亡，其作用还有待进一步研究。

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