人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

doi:10.12307/2023.908

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 50-55.doi: 10.12307/2023.908

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人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

郑明魁，薛晨晖，关晓明，马迅

山西医科大学第三医院(山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院)，山西省太原市 030032

收稿日期:2022-12-26 接受日期:2023-02-04 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 马迅，教授，博士生导师，主任医师，山西医科大学第三医院(山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院)，山西省太原市 030032 关晓明，博士，副主任医师，山西医科大学第三医院(山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院)，山西省太原市 030032
作者简介:郑明魁，男，1985年生，山西省临汾市人，山西医科大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓损伤的研究。薛晨晖，男，1988年生，山西省晋中市人，山西医科大学在读博士，主要从事脊柱脊髓损伤的研究。
基金资助:
山西省自然科学基金(201901D111410)，项目负责人：关晓明；山西白求恩医院优秀青年启动基金(2019YJ07)，项目负责人：关晓明

Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes reduce the permeability of blood-spinal cord barrier after spinal cord injury

Zheng Mingkui, Xue Chenhui, Guan Xiaoming, Ma Xun

Third Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China

Received:2022-12-26 Accepted:2023-02-04 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Ma Xun, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Third Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China Guan Xiaoming, MD, Associate chief physician, Third Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Zheng Mingkui, Master candidate, Third Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China Xue Chenhui, Doctoral candidate, Third Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Tongji Shanxi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Natural Science Foundation, No. 201901D111410 (to GXM); Outstanding Youth Initiation Fund of Shanxi Bethune Hospital, No. 2019YJ07 (to GXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血脊髓屏障：是血液和脊髓之间的物理屏障，由毛细血管内皮细胞、基底膜、周细胞和星形胶质细胞足突组成，通过调节血液与脊髓之间的分子交换，维持脊髓内稳态。

外泌体：是起源于多泡体的纳米级脂质膜囊泡，其内含有蛋白质、脂质、核酸等多种活性生物分子，参与细胞间的分子传递。

背景：研究发现，内皮素参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏，干细胞来源外泌体可降低血脊髓屏障的通透性，修复脊髓损伤。
目的：观察人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过抑制内皮素1表达降低血脊髓屏障的通透性，进而修复脊髓损伤。
方法：用超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中提取外泌体，透射电子显微镜观察其形态，Western blot检测tsg101、CD63的表达。80只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组(n=20)，采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型，内皮素1组用微量注射器直接向损伤部位注射10 μL(1 μg/mL)内皮素1，术后即刻及1，2 d，分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200 μL PBS，外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200 μL外泌体(200 μg/mL)。脊髓损伤后第1，3，7，14，21天进行后肢运功功能评分；损伤后第7天通过伊文思蓝染色观察血脊髓屏障通透性，Western blot检测脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin和内皮素1的表达。

结果与结论：①外泌体组BBB评分在损伤后3-21 d显著高于模型组(P < 0.05)，苏木精-伊红染色显示外泌体组脊髓损伤较模型组明显减轻；内皮素1组BBB评分较外泌体组显著降低(P < 0.05)，内皮素1组脊髓损伤较外泌体组加重；②模型组内皮素1表达量较假手术组显著增加(P < 0.05)，外泌体组内皮素1表达量较模型组显著降低(P < 0.05)；③与模型组比较，外泌体组血脊髓屏障伊文思蓝渗出量显著减少(P < 0.05)，紧密连接蛋白β-Catenin、Occludin、ZO-1的表达增加(P < 0.05)；与外泌体组比较，内皮素1组伊文思蓝渗出量显著增加(P < 0.05)，上述紧密连接蛋白表达量显著减少(P < 0.05)；④结果表明，人脐带间充质细胞来源外泌体通过下调内皮素1表达来保护血脊髓屏障的通透性，起到了修复脊髓损伤的作用。

https://orcid.org/0000-0002-0402-5817 (郑明魁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人脐带间充质干细胞, 外泌体, 脊髓损伤, 血脊髓屏障, 内皮素, 紧密连接蛋白

Abstract: BACKGROUND: Endothelin has been found to be involved in the breakdown of the blood-spinal cord barrier after spinal cord injury, and stem cell-derived exosomes can reduce the permeability of the blood-spinal cord barrier and repair spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate whether exosomes produced by human umbilical cord mesenchymal stem cells can reduce the permeability of the blood-spinal cord barrier by inhibiting endothelin-1 expression, thus repairing spinal cord injury.
METHODS: Exosomes were extracted from the cultured supernatant by the hyperspeed centrifugation method. The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscope. The expression levels of tsg101 and CD63 were detected by western blot assay. Eighty SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, exosome group, and endothelin-1 group (n=20). The modified Allen’s method was used to create the rat model of spinal cord injury. In the endothelin-1 group, 10 μL (1 μg/mL) endothelin-1 was injected directly into the injured area with a microsyringe. Immediately, 1 day, 2 days after operation, sham operation group and model group were injected with 200 μL PBS solution through the tail vein; the exosome group and endothelin-1 group were injected with 200 μL exosome (200 μg/mL) solution through the tail vein, respectively. Hind limb motor function scores were performed on days 1, 3, 7, 14 and 21 after spinal cord injury. The blood-spinal cord barrier permeability was observed by Evans blue staining on day 7 after injury. The expression levels of tight junction proteins β-Catenin, ZO-1, Occludin and endothelin-1 in the spinal cord were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Basso-Beattie-Bresnahan score in the exosome group was significantly higher than that in the model group at 3-21 days after injury (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that spinal cord injury was greatly reduced in the exosome group compared with the model group. Basso-Beattie-Bresnahan score in the endothelin-1 group was significantly decreased compared with the exosome group (P < 0.05). Spinal cord injury was more severe in the endothelin-1 group than that in the exosome group. (2) The expression of endothelin-1 in the model group was significantly increased compared with the sham operation group (P < 0.05), and the expression of endothelin-1 in the exosome group was significantly decreased compared with the model group (P < 0.05). (3) The blood-spinal cord barrier Evans blue exudate in the exosome group was significantly decreased compared with the model group (P < 0.05). The expression levels of the tight junction proteins β-Catenin, Occludin and ZO-1 in the exosome group were increased (P < 0.05); the Evans blue exudate in the endothelin-1 group was significantly increased compared with the exosome group (P < 0.05). The expression level of tight junction protein was significantly decreased compared with the exosome group (P <0.05). (4) The results show that human umbilical cord mesenchymal cell-derived exosomes protect the permeability of the blood-spinal cord barrier by down-regulating the expression of endothelin-1 and play a role in the repair of spinal cord injury.

Key words: stem cell, human umbilical cord mesenchymal stem cell, exosome, spinal cord injury, blood-spinal cord barrier, endothelin, tight junction protein

中图分类号:

郑明魁, 薛晨晖, 关晓明, 马迅. 人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 50-55.

Zheng Mingkui, Xue Chenhui, Guan Xiaoming, Ma Xun. Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes reduce the permeability of blood-spinal cord barrier after spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 50-55.

图/表（结果） 5

2.1 人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定结果透射电子显微镜下观察到人脐带间充质干细胞来源外泌体呈椭圆形或“茶托”形囊泡，具有完整的外形结构，见图1A；Western blot 检测到外泌体颗粒阳性表达CD63、tsg101，见图1B。

2.2 大鼠脊髓组织苏木精-伊红染色结果及运动功能评价脊髓损伤后7 d，病理检测结果显示，假手术组脊髓组织分布均匀、结构致密，细胞核圆形，核仁清晰，无明显坏死；模型组可见细胞溶解并消失，局部形成空泡、坏死、出血；外泌体组脊髓组织损伤情况较模型组明显减轻；内皮素1组损伤情况与模型组比较无明显差别，见图2A，B；采用BBB评分评估大鼠运动功能恢复情况，外泌体组与模型组相比，在损伤后3-21 d运动功能显著增强(P < 0.05)；内皮素1组运动功能与外泌体组有显著差别(P < 0.05)，见图2C。假手术组、模型组、外泌体组比较可以得出外泌体对大鼠脊髓损伤有治疗作用；外泌体组、内皮素1组比较可知内皮素1抵消了外泌体治疗脊髓损伤的作用。

2.3 血脊髓屏障通透性在脊髓损伤后第7天，用伊文思蓝染色检测血脊髓屏障的通透性，见图3。假手术组染料几乎无外渗，模型组和内皮素1组染料外渗显著增加，外泌体组染料外渗量较模型组明显减少(P < 0.05)，外泌体治疗后可以降低血脊髓屏障的通透性，但局部注射内皮素1后，外泌体治疗效果显著减弱(P < 0.05)。

2.4 脊髓紧密连接蛋白及内皮素1表达通过Western blot检测损伤段脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin及内皮素1的表达量，见图4。

与假手术组比较，模型组紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin表达量显著降低，内皮素1表达量显著增加，表明内皮素1及紧密连接蛋白之间可能存在交互。与模型组比较，外泌体组紧密连接蛋白表达明显升高、内皮素1表达明显降低(P < 0.05)，这些结果表明，外泌体可以增加紧密连接蛋白的表达，降低内皮素1的表达。局部组织预先注射内皮素1后再注射外泌体，紧密连接蛋白的表达水平明显低于外泌体组(P < 0.05)，说明外泌体促进紧密连接蛋白的表达作用受到内皮素1的抑制。

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引言

脊髓损伤是中枢神经系统的灾难性损伤，全世界每年脊髓损伤发病率为8例/百万-246例/百万[1]。由于脊髓损伤致残率、致死率高，且随着脊髓损伤发病人数不断增加，给个人、家庭和社会带来了沉重的负担，如何有效治疗脊髓损伤成为亟待解决的问题。脊髓损伤后，继发性损伤为原发损伤后一系列“瀑布式”生物化学反应，“脊髓微环境失衡”被认为是继发性脊髓损伤加重的原因[2]，而血脊髓屏障是维持脊髓微环境稳定的重要因素。因此在脊髓损伤后如何维持血脊髓屏障结构和功能的完整性，是降低继发性脊髓损伤的关键点所在。
间充质干细胞移植疗法是目前公认的一种可以减少血脊髓屏障损伤、改善神经功能、治疗脊髓损伤的有效方法[3-5]，但是具有低存活率、肿瘤形成和靶向性差等局限性[6]。干细胞分泌的外泌体携带多种RNA、蛋白质和其他生物活性物质[7]。研究显示，在创伤性脊髓损伤的治疗中，干细胞来源外泌体可以减少损伤区炎症反应，改善脊髓微环境，促进神经功能恢复[8-9]，然而其改善脊髓微环境的机制仍不清楚。内皮素1(endothelin-1，ET-1)是目前已知的一种强烈的缩血管细胞因子，不仅分布于神经系统的血管内皮细胞，还广泛分布于脑和脊髓组织中的神经细胞、胶质细胞和背根神经节内。研究发现，血管内皮素1对血脊髓屏障的破坏有重要的调控作用，其可以直接作用于脊髓微血管，调节微血管结构，这表明内皮素1参与了以损伤为中心的轴向血脊髓屏障的破坏[10]。脊髓损伤后早期，内皮素1主要表达于神经元细胞内[11]。姜亮等[12]研究发现内皮素1在急性期的作用机制包括：①可能直接作用于脊髓微血管，导致微血痉挛，引起脊髓缺血缺氧；②可能通过改变血管内皮非特异性转运机制的特性，使血脊髓屏障的通透性增高；③破坏血脊髓屏障完整性。脊髓损伤后，神经组织出现缺血缺氧现象，缺氧可促进内皮细胞中内皮素1的基因表达，进而内皮素1合成增加，内皮素1的生物学作用会加重微血管收缩，导致组织进一步缺血缺氧和血脊髓屏障损伤[13]。彭新生等[14]研究证实，内皮素1参与脊髓损伤后血脊髓屏障破坏，并且使用内皮素1受体拮抗剂后，减轻了血脊髓屏障的损伤。
研究表明，干细胞来源外泌体在脊髓损伤后促进内源性血管再生、抑制炎症扩散、降低神经细胞凋亡[15-16]、抑制瘢痕形成等方面均发挥了积极的治疗作用，但是干细胞来源外泌体对脊髓损伤后血脊髓屏障的保护作用机制研究甚少。基于国内外研究现状提出设想：人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosomes，hucBMSCs-exo)可能通过调控内皮素1从而减轻血脊髓屏障的破坏，有效抑制脊髓损伤后脊髓功能继发损伤。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计培养人脐带间充质干细胞并提取外泌体；构建脊髓损伤大鼠模型，移植外泌体及药物；组间数据比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。
1.2 时间及地点实验于2022年2-11月在山西省人民医院肾脏病重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料和动物山西医科大学第三医院妇产科提供健康新生儿脐带(获医院伦理委员会审批通过并且家属知情同意，批准号为2019LL060)。成年健康雄性SD大鼠80只制作脊髓损伤模型，SPF级，体质量220-240 g，购于山西省肿瘤医院动物中心。动物实验方案经山西省人民医院伦理委员会审查批准，批准号为2022第89号。
1.3.2 实验仪器和试剂恒温CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；透射电子显微镜、荧光显微镜(Olympus公司)；超速离心机(美国BeckmanCoulter 公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；内皮素1(Calbiochem 公司)；CD63抗体、tsg101抗体(沈阳万类公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞培养手术室取新生儿脐带约6 cm，
放入装有PBS的玻璃瓶中(已预先高温灭菌)，然后于超净工作台处理，无菌PBS反复冲洗，解剖分离脐带外膜及脐动静脉，再次用无菌PBS反复冲洗，将组织剪切为1 mm×1 mm×1 mm，然后平铺于培养皿，加人脐带间充质干细胞培养基(DMEM培养液、体积分数为10%胎牛血清，1%青-链霉素)，放入37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。7 d左右，组织块边缘出现贴壁细胞生长，换液并移除组织块，此后每2 d换液1次，镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合度达到70%-80%时，用0.25%胰酶消化，按1∶2传代。

1.4.2 外泌体的分离及鉴定选择生长良好的第4-6代人脐带间充质干细胞，细胞汇合度达到60%-70%时,更换外泌体提取培养基(DMEM培养液、体积分数为10%无外泌体胎牛血清[17]，1%青-链霉素)，继续培养24-48 h后，收集细胞上清液，细胞上清于300×g(4 ℃，10 min)离心去除样品中的细胞，取上清，细胞上清于2 000×g(4 ℃，10 min)离心去除样品中细胞碎片，取上清，10 000×g(4 ℃，30 min)离心去除样品中大的囊泡，取上清，100 000×g(4 ℃，2 h)离心，弃上清所得沉淀即为外泌体[18-20]，加入100 μL PBS重悬收集到的外泌体，取出适量使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测外泌体含量，并将外泌体稀释至200 μg/mL。通过透射电子显微镜观察所提取外泌体形态：取10 μL外泌体混悬液滴于碳膜包被的铜网上，25 ℃下静置10 min，然后滤纸吸去多余液体，用3%磷钨酸溶液染色5 min，100 kV下运行透射电镜观察样品[21]。Western blot检测外泌体特异表面标志物CD63和tsg101的表达。

1.4.3 大鼠分组、脊髓损伤模型制备及外泌体和内皮素1给药方式将80只成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组，每组20只。1%戊巴比妥钠(3 mL/kg)对大鼠行腹腔注射麻醉，于脊椎T10节段行背部正中切口，钝性分离椎体周围组织，逐层切开并分离肌肉，显露T10椎板及棘突，咬除棘突及椎板，显露脊髓，应完整保留硬脊膜，假手术组消毒后逐层缝合伤口，其余3组则采用改良Allen’s法建立脊髓损伤模型[22]，使用自制脊髓打击器在T10水平制造脊髓损伤(10 g×5 cm)，观察到损伤部位脊髓出现充血水肿、双后肢抽搐、尾巴痉挛性摆动，则证明造模成功。术后内皮素1组用微量注射器直接向损伤部为注射10 μL(1 μg/mL)内皮素1，生理盐水冲洗并消毒伤口后逐层缝合，给予腹腔注射青霉素(20万U/d)3 d，每天人工按摩膀胱两三次排尿，直至排尿功能恢复。损伤后立即和术后1，2 d，分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200 μL PBS溶液，外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200 μL外泌体(200 μg/mL)溶液。
1.4.4 后肢运动功能评价造模前及造模后1，3，7，14，21 d，由2位熟练掌握BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)评分表的工作人员[23]，将每只大鼠放置于防滑、平坦的平台上，在双盲条件下仔细观察每只大鼠5 min并记录后肢运动情况，BBB得分为2位观察者的平均分，0分为后肢完全瘫痪，无自主运动，21分为后肢运动正常，步态协调。
1.4.5 伊文思蓝染料分析用伊文思蓝渗透实验检测血脊髓屏障通透性[24]。在脊髓损伤后7 d，每组取4只大鼠，2%伊文思蓝盐水溶液(2 mL/kg)注入大鼠尾静脉，2 h后1%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，用生理盐水灌注心脏，直到清澈的液体从右心房流出，取出1 cm受伤脊髓(以损伤部位为中心)，称质量后在50%三氯乙酸溶液中研磨成浆，10 000×g离心10 min，取上清液用分光光度计检测样品吸光度(激发波长为620 nm，发射波长为680 nm)。根据已知的标准曲线，计算出组织中所含染料量(μg/g)。
1.4.6 灌注取材脊髓损伤后7 d，各组取10只大鼠，在大鼠麻醉处死后，生理盐水灌注至右心房流出清亮液体，然后用40 g/L多聚甲醛经左心室继续灌注固定，取以损伤节段为中心的脊髓约1 cm，将其固定在40 g/L多聚甲醛溶液(4 ℃)中24 h，经脱水、透明后嵌入石蜡块中，切成4 μm厚的切片，用于苏木精-伊红染色实验。用于Western blot实验的脊髓节段，放置于-80 ℃冷冻备用。
1.4.7 苏木精-伊红染色取脊髓组织的石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇脱水，用蒸馏水清洗，苏木精染色5 min，自来水漂洗，盐酸乙醇分化，自来水漂洗15 min并吸干水分后，伊红染色2 min，常规脱水，透明，中性树脂封固，光学显微镜拍照记录。使用ImageJ软件分析得出脊髓损伤区面积。
1.4.8 Western blot实验将脊髓组织与RIPA裂解液混合后，在冰上裂解30 min，使用超声破碎后，4 ℃条件下15 000×g离心10 min；取上清，将所得蛋白样品(40 μg)与5×loading buffer混合后煮沸5 min使蛋白变性；然后进行凝胶电泳，转膜至PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入ZO-1、β-Catenin、Occludin、内皮素1一抗(1∶200)，4 ℃孵育约20 h，TBST 洗膜3次，每次5 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光系统检测条带，实验重复3次。使用Image J软件计算条带灰度值，以GAPDH作为内参，蛋白表达水平由灰度比值表示。
1.5 主要观察指标 ①外泌体鉴定结果；②各组大鼠运动功能BBB评分；③各组大鼠脊髓组织形态学变化；④各组大鼠脊髓组织紧密连接蛋白(ZO-1、β-Catenin、Occludin、内皮素1)表达量；⑤各组大鼠伊文思蓝渗出量。
1.6 统计学分析文章统计分析由 SPSS 26.0 软件完成，并经过通讯作者审核。数据用x±s表示。组间数据比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血脊髓屏障由无孔内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、基底膜组成，内皮细胞间存在着紧密连接、黏附连接，严格限制血脊髓屏障的通透性，维持脊髓内环境的平衡[25]。血脊髓屏障的完整性对维持脊髓正常功能起着重要作用，在脊髓损伤的发生过程中发挥着不可或缺的作用[26]。脊髓损伤后，机械外力直接破坏了受伤部位的血管，导致远离受伤部位的血脊髓屏障被永久破坏[27]。研究表明，生长因子如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等可以改善脊髓损伤后的血脊髓屏障完整性[28-31]。然而，关于干细胞来源外泌体在血脊髓屏障恢复中的作用研究较少。干细胞较其他细胞分泌更多的外泌体[32-33]。外泌体囊泡中包括蛋白质、核酸和脂质[34-36]。研究发现，周细胞来源外泌体在治疗脊髓损伤过程中可以减少细胞凋亡，改善脊髓损伤后微循环，防止血脊髓屏障损伤和水肿[36]。间充质干细胞来源外泌体在脊髓损伤恢复中起着重要作用，在轴突生长、血管生成、炎症、凋亡等方面有诸多影响；然而，它们在修复血脊髓屏障中的作用尚无充分的解释。该研究证实人脐带间充质干细胞衍生外泌体对血脊髓屏障的保护作用，从而促进脊髓损伤后的功能恢复。
紧密连接蛋白的表达和分布与脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性密切相关[37]。脊髓损伤后紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)的表达减少[38-39]。PARK等[40]研究证明，原儿茶酸上调紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)可以改善脊髓损伤大鼠的血脊髓屏障完整性。Zhang等[41]证实，番茄红素可以通过诱导紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-5)的表达，从而维持血脊髓屏障的完整性，促进脊髓损伤后的运动恢复。YU等[42]发现，丹酚酸可以提高脊髓损伤后紧密连接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-5)的水平，防止血脊髓屏障的破坏。这些神经保护作用可能是通过抑制脊髓损伤后中性粒细胞和巨噬细胞的浸润来保护血脊髓屏障的完整性。该实验数据也表明，脊髓损伤后紧密连接蛋白(ZO-1、β-Catenin、Occludin)的表达量明显降低，血脊髓屏障的通透性明显增大，同时内皮素1的表达水平上调。鉴于内皮素1的表达与紧密连接蛋白的表达之间存在交互，作者假设，内皮素1参与人脐带间充质干细胞来源外泌体对脊髓损伤后脊髓组织紧密连接蛋白表达的调控作用。当外泌体进入受损区域，进而抑制内源性内皮素1表达，修复细胞连接，防止血脊髓屏障的继发性损伤。
研究显示，脊髓损伤后内皮素1的表达增加，导致白细胞浸润、炎症反应和氧化应激，进而引发继发性脊髓损伤，应用内皮素1受体阻断剂后，抑制了继发性脊髓损伤的进程[43]。
SINESCU等[44]研究证实，内皮素1的表达增加与血脊髓屏障破坏相关，应用内皮素1阻滞剂可以阻断内皮素1介导的血管收缩，进而阻止继发性脊髓损伤。MICHINAGA等[45]的研究显示，在实验性动物模型中，内皮素1参与血脑屏障损伤及脑水肿，内皮素1拮抗剂可以促进血脑屏障恢复并减轻脑水肿。研究证实间充质干细胞衍生外泌体通过携带的miRNA，与组蛋白去乙酰化酶1结合，下调内皮素1表达，以减少糖尿病肾病症状[46]。ZHANG等[47]的研究认为，定位于星形胶质细胞的内皮素1对运动神经元具有毒性作用，并且这些毒性作用可以被内皮素1受体拮抗剂抵消。研究发现，MiR-379-5p通过抑制内皮素1的表达，促进了脊髓损伤后运动功能恢复[48]。基于以上结果，为了进一步探索外泌体的作用机制，在外泌体治疗前给予鞘内注射外源性内皮素1，结果显示脊髓损伤后外泌体降低血脊髓屏障通透性作用受到明显抑制。上述结果表明，人脐带间充质干细胞来源外泌体通过降低内皮素1表达来保护脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性。
综上所述，人脐带间充质干细胞衍生外泌体通过抑制内皮素1的表达，降低了脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性，进而减少了脊髓的继发性损伤。外泌体作为干细胞分泌的囊泡，包含多种生物分子，具体是那些分子参与了抑制内皮素1的内源性表达，还需要进一步的研究。该研究可能会加强对外泌体治疗脊髓损伤作用机制的理解，并为其应用提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes reduce the permeability of blood-spinal cord barrier after spinal cord injury

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