力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

doi:10.12307/2023.162

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (21): 3293-3299.doi: 10.12307/2023.162

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力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

孙可欣，曾今实，李佳，蒋海越，刘霞

中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京市 100144

出版日期:2023-07-28 发布日期:2022-11-23
通讯作者: 刘霞，博士，研究员，中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京市 100144
作者简介:孙可欣，女，1996年生，河南省安阳县人，汉族，2022年北京协和医学院毕业，硕士，主要从事3D生物打印相关的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目 (81871575)，项目负责人：刘霞；中国医学科学院医学与健康科技创新工程 (2021-I2M-1-052)，任务三项目负责人：蒋海越

Mechanical stimulation enhances matrix formation of three-dimensional bioprinted cartilage constructs

Sun Kexin, Zeng Jinshi, Li Jia, Jiang Haiyue, Liu Xia

Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China

Online:2023-07-28 Published:2022-11-23
Contact: Liu Xia, MD, Researcher, Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China
About author:Sun Kexin, Master, Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China
Supported by:
General Program of the National Natural Science Foundation of China, No. 81871575 (to LX); The Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences, No. 2021-I2M-1-052 (to JHY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

力学刺激：属于生物物理刺激的一种，表现形式可以是压力(压缩)、表面的摩擦力、剪切力和拉力，以及压力中特殊的力——细胞内外的静水压力，对细胞的生长发育极为重要。在此次实验中力学刺激主要指压力。
生物3D打印软骨构建物：利用3D生物打印技术，将软骨细胞与生物材料相混合，打印出的组织工程构建物，此处称为生物3D打印软骨构建物。

背景：基质分泌不均匀、力学强度不足是影响组织工程构建物在体内形成效果的重要因素，力学刺激是促进细胞外基质分泌的有效手段。
目的：探索3D生物打印复合支架在力学加压环境下的生物学表现。
方法：采用3D生物打印技术制备软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架，活死染色观察细胞存活情况。将复合支架置于力学加压生物反应器中进行加压培养，以6孔板中不加压培养的复合支架为对照，活死染色观察细胞存活情况，组织学染色观察复合支架体外软骨形成情况，qRT-PCR检测成软骨相关基因mRNA的相对表达量。将加压与不加压复合支架分别植入裸鼠皮下，5周后取材，组织学观察软骨形成情况。
结果与结论：①复合支架外观呈现清晰的网格状结构，体外培养1，4，7 d时，支架形态稳定、结构清晰，细胞存活率均在90%以上；②培养2周后，加压组复合支架中的细胞存活率低于不加压组(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示两组复合支架均有明显的软骨陷窝结构，细胞在材料中分布较均匀，加压组复合支架的材料间空隙内有更多新生软骨组织形成；番红O染色显示两组均可见红色软骨基质形成，加压组细胞周基质染色更深；Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示，加压组着色更为明显；加压组弹性蛋白、Ⅱ型胶原的mRNA表达高于不加压组(P < 0.05)；③植入裸鼠皮下5周后，苏木精-伊红染色显示加压组软骨组织形成更为均一，软骨细胞大小均匀，陷窝结构明显；④结果表明，虽然体外加压刺激会引发3D生物打印软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架中的细胞死亡，但同时会促进存活细胞向支架空隙间长入，提高其软骨基质相关基因的表达，促进成软骨能力。
https://orcid.org/0000-0002-0301-7815(孙可欣)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 3D生物打印, 力学刺激, 软骨细胞, 甲基丙烯酰胺基明胶, 组织工程软骨, 复合支架

Abstract: BACKGROUND: Uneven secretion of matrix and insufficient mechanical strength are important factors affecting the formation effect of tissue engineering constructs in vivo. Mechanical stimulation is an effective means to promote the secretion of extracellular matrix.
OBJECTIVE: To explore the biological performance of 3D bioprinted composite scaffolds under mechanical stimulation.
METHODS: The chondrocyte-gelatin methacryloyl composite scaffold was prepared and printed by 3D bioprinting technology. Cell survival was observed by live/dead cell staining. The composite scaffolds were placed in a mechanical pressurized bioreactor for pressurized culture. The composite scaffolds cultured in a 6-well plate without pressurization were used as the control. Live/dead cell staining was used to observe the cell survival. Histological staining was used to observe the in vitro cartilage of the composite scaffolds. The relative expression levels of cartilage-related genes were detected by real-time quantitative PCR. The composite scaffolds were implanted into nude mice for 5 weeks in vitro with or without mechanical stimulation, and the cartilage formation was observed by histological staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The appearance of the composite scaffolds showed a clear grid-like structure. When cultured for 1, 4, and 7 days in vitro, the scaffolds had stable morphology and clear structure, and the cell viability was above 90%. (2) After 2 weeks of culture, the cell survival rate in the composite scaffold in the pressurized group was lower than that in the unpressurized group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining exhibited that composite scaffolds of the two groups had obvious cartilage lacuna structure, and the cells were distributed evenly in the materials. In the pressurized group, more new cartilage tissue was formed in the gap of the composite scaffold. Safranin O staining showed that red cartilage matrix was formed in both groups; the stained pericellular matrix was deeper in the pressurized group. Type I collagen immunohistochemical staining showed that the coloration in the pressurized group was more obvious; the mRNA expression levels of elastin and type II collagen in the pressurized group were higher than those in the unpressurized group (P < 0.05). (3) After 5 weeks of subcutaneous implantation in nude mice, hematoxylin-eosin staining showed that the formation of cartilage tissue in the pressurized group was more uniform; the size of chondrocytes was uniform; the lacuna structure was obvious. (4) The results show that although in vitro stimulation can trigger cell death in the 3D bioprinted chondrocyte-gelatin methacryloyl composite scaffold, it also promotes the ingrowth of surviving cells into the space of the scaffold and increases the expression of their cartilage matrix-related genes, to promote cartilage formation.

Key words: three-dimensional bioprinting, mechanical stimulation, chondrocyte, gelatin methacryloyl, tissue engineered cartilage, composite scaffold

中图分类号:

孙可欣, 曾今实, 李佳, 蒋海越, 刘霞. 力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3293-3299.

Sun Kexin, Zeng Jinshi, Li Jia, Jiang Haiyue, Liu Xia. Mechanical stimulation enhances matrix formation of three-dimensional bioprinted cartilage constructs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(21): 3293-3299.

图/表（结果） 7

2.1 复合支架的大体观及细胞活/死检测
2.1.1 实时成像 3D生物打印软骨细胞-GelMA复合支架第1，2，4和8层的打印实时成像，图中清晰可见直线线条形状，支架材料表面光滑，呈半透明状，随着层数的增多，其形态越来越清晰，呈网格状，见图1A。
2.1.2 大体观察 3D生物打印完成后的支架大小约为10 mm×5 mm×2 mm，结构清晰，呈网格状，质地较软；置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，加入完全培养基培养1，4，7 d，可见支架形态稳定，随着培养时间的增长，至第7天网格状结构仍清晰可见，但网格空隙缩小，支架厚度略有增加，见图1B、C。

2.1.3 复合支架中细胞密度、分布及细胞存活率对复合支架进行活死细胞染色观察拍照得到二维与三维成像图，如图2A、B所示，复合支架内细胞分布均匀，以绿色活细胞为主，中间分布有坏死的红色细胞，第1天时，红色细胞数量相对较多。统计学分析显示，培养1，4，7天支架内细胞存活率分别为(90.57%±1.84)%，(93.41±1.84)%，(94.53±1.62)%，第1天与第4，7天的细胞存活率比较差异有显著性意义
(P < 0.05)，第4，7天的细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2C，这可能与第1天时，细胞经历打印过程后坏死较多有关。

2.1.4 加压组和不加压组复合支架细胞存活率检测培养2周后，对两组复合支架活死细胞染色观察与拍照得到三维成像图，并进行细胞计数，见图3。加压组与不加压组复合支架中的细胞存活率分别为(76.61±3.78)%，(86.42±2.51)%，加压组细胞存活率低于不加压组(P < 0.05)，说明加压培养过程中会导致细胞死亡增加。

2.2 复合支架体外成软骨检测
2.2.1 大体观察加压组与不加压组复合支架在大体外观上无明显区别，网格状结构仍清晰可见，见图4A。
2.2.2 组织学染色结果苏木精-伊红染色结果显示两组均有明显的软骨陷窝结构，细胞在材料中分布较均匀，加压组复合支架的材料间空隙区域有更多新生软骨组织形成，见图4B；番红O染色显示两组组织均可见红色软骨基质形成，加压组细胞周基质染色更深，见图4C，提示经加压培养后，细胞分泌糖胺多糖基质成分的能力增加；Ⅰ型胶原免疫组织化学染色也显示加压组着色更为明显，见图4D，提示加压刺激能够促进软骨细胞的胶原分泌。

2.2.3 qRT-PCR 检测成软骨相关基因表达见图5。

加压组复合支架中成软骨相关基因Ⅱ型胶原和弹性蛋白的mRNA表达水平明显高于不加压组(P < 0.05)，进一步说明加压培养能够促进软骨细胞的胶原蛋白合成能力；Ⅰ型胶原蛋白和赖氨酸氧化酶mRNA表达量也有升高趋势，但组间差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 复合支架裸鼠皮下植入后的体内成软骨检测植入裸鼠体内5周后取材，大体观察显示两组外观无明显差异，动图显示两组复合支架弹性和硬度手感无明显差异，见图6A、B；苏木精-伊红染色结果显示加压组复合支架组织形成更为均一，软骨细胞大小均匀，陷窝结构明显，见图6C。

2.4 复合支架的生物相容性由活死染色裸鼠皮下植入实验可知，3D生物打印软骨细胞-GelMA复合支架具有良好的生物相容性。

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引言

耳软骨组织工程发展至今已取得了长足的进展，目前已有临床应用[1]，但长期随访中发现，组织工程植入物出现一定程度的塌陷、变形等问题，无法维持其结构，从而影响术后效果[2]，主要原因在于组织基质形成不均、力学强度不足等瓶颈问题的存在[3]。
3D生物打印是组织工程领域逐渐发展起来的一种快速成型技术，它的出现为解决这些问题提供了新思路。传统组织工程是将细胞附着在3D打印的支架上植入体内[4]，无法精确控制支架材料内部细胞的数量和分布位置，而3D生物打印技术将细胞与生物材料相混合，通过计算机辅助设计和制造，采用层层打印的方式构建生物复合支架，可对细胞的数量和分布位置进行精准控制[5]。用于 3D 生物打印的生物材料被称为“生物墨水”，这些材料可以模拟细胞外基质环境，支持细胞黏附、分化和增殖。生物墨水不同于 3D 打印中使用的其他墨水，因为它们必须同时具有生物和机械功能[6]。同时，生物墨水除了要具备传统组织工程支架材料应具备的特性外，还要具有良好的可打印性能。理想情况下，生物墨水应在打印期间在低剪切力下容易挤出，同时支持细胞生长并在打印后保持形状保真度。因此，它们一般在更低的温度下打印，并且具有温和的交联条件，以保护细胞并防止生物分子的不必要降解[7]。目前主要采用天然凝胶类材料作为3D生物打印材料，例如甲基丙烯酰胺基明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)，GelMA是明胶经甲基丙烯酰胺基修饰过后的合成水凝胶，保留了明胶优异的生物相容性和生物活性，同时能够通过改变甲基丙烯酰胺的取代度、预聚物的浓度等，调节水凝胶的机械性能、孔径、降解速率等材料特征。此外，光交联甲基丙烯酰取代基团的引入，使得GelMA水凝胶可以在光引发剂存在的情况下于紫外灯照射下快速交联固化，具有生物相容性、降解性、低抗原性和快速交联固化、性能可调节等优点[8-9]，被广泛应用于3D生物打印领
域[7，10-11]，但这类生物材料力学强度不足，是影响其构建的生物复合支架体内效果的主要原因。
力学刺激对软骨细胞的影响一直以来是研究的热点，软骨正常发育形成过程中受到机械载荷和缺氧这些正常的应激源，是分子水平上调控软骨形成的重要因素。研究表明力学刺激是促进软骨基质分泌的有效手段，合适的力学刺激可以影响软骨细胞表型，改变细胞外基质成分的表达，从而增强组织构建软骨的力学性能[12]。耳软骨所处位置没有较大的生物力学作用，但其是机械敏感的，目前关于细胞生物力学的研究主要集中在关节软骨，耳软骨作为弹性软骨的细胞外基质成分与关节软骨不同，这种异质性会导致不均匀的应力应变，从而影响细胞对于机械刺激的反应[13]。因此，对于耳软骨细胞力学作用的研究是重要的。另外对于载体的选择，研究表明，不同生物活性的材料其包裹的细胞所受到机械刺激的反应也不同，支架的组成可以显著影响机械刺激对软骨细胞的反应[14]。GelMA具有生物相容性好、性能可调节等优点，非常适合用作组织工程细胞生物力学研究的载体。
此次实验以GelMA为载体，混合兔耳软骨细胞，制成生物墨水，通过3D生物打印构建复合支架，将复合支架置于力学生物反应器中对其进行体外力学刺激，探究其在机械应力环境下的生物学表现，为联合应用力学生物反应器和3D生物打印技术构建软骨组织提供技术参数。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体内、外比较性观察实验，组内比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年10月至2021年6月在中国医学科学院整形外科医院研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 5月龄健康新西兰白兔2只，体质量2.5-3.0 kg，用于提取兔耳软骨细胞；5周龄健康裸鼠10只，体质量16-18 g，用于复合支架皮下植入实验，均由中国医学科学院整形外科医院实验动物中心提供。动物实验方案通过中国医学科学院整形外科医院实验动物伦理委员会批准(批准号EAEC 2020-09)。
1.3.2 实验试剂 DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素-新霉素(PSN)抗生素混合物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS(GIBCO公司，美国)；DMSO、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，美国)；GelMA冻干粉(上普博源北京生物科技有限公司)；番红O染液(北京索莱宝科技有限公司，中国)；Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒(Calcein-AM/PI Double Staining Kit)(东仁化学科技有限公司，中国)；抗Ⅰ型胶原抗体(Thermo公司，美国)；山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(Abcam公司，英国)。
1.3.3 实验仪器 Bioplotter 3D 生物打印机(Envition tec公司，德国)；TC-3F bioreactor、TEB1005 bioreactor(EBERS公司，西班牙)；CO2 培养箱(Thermo公司，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus 公司，日本)；共聚焦荧光显微镜(Leica公司，德国)；NanoDrop2000c微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；PCR 仪(Eppendorf公司，德国)；LightCycler R
96Ⅱ实时荧光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRTPCR)系统(Roche 公司，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 兔耳软骨细胞的分离、培养、冻存和扩增 1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉新西兰白兔，以耳缘静脉空气栓塞法处死，固定于操作台上，以无菌方式取下兔双耳，放入含有1%青霉素-链霉素的PBS中，于低温环境下暂存。将样本送至实验室，于超净工作台中剥离兔耳软骨表面结缔组织，在无菌培养皿中，用眼科剪将软骨剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm的小块，移至50 mL离心管内，加5倍体积0.25%胰蛋白，37 ℃下置于摇床摇30 min(80 r/min)；1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加 5 倍软骨体积的 0.2%Ⅱ型胶原酶，37 ℃下置于摇床摇8-10 h[15](80 r/min)；70 µm细胞滤网过滤，离心，弃上清，洗涤后，调整细胞密度，将细胞接种到含体积分数10%胎牛血清和1%抗生素混合物的DMEM高糖完全培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每二三天更换一次培养基。
软骨细胞为贴壁细胞，一般过夜即可贴壁，于倒置显微镜下观察细胞形态，呈短梭形、多角形，细胞形态不均一。细胞生长达到80%时用0.25%胰蛋白酶消化，一部分细胞置于含有1 mL冻存液(900 μL胎牛血清+100 μL DMSO)的冻存管中，-80 ℃冰箱过夜后，在液氮中长期保存，用于后续实验，另一部分细胞按照1∶3的比例进行传代，待第2代细胞贴壁后，于倒置显微镜下观察，软骨细胞呈短梭状，形态较均一。待细胞生长达到80%汇合时，收集第2代软骨细胞进行后续实验。
1.4.2 3D生物打印软骨细胞-GelMA复合支架打印前，乙醇擦拭3D打印机，实验所需器械均经乙醇浸泡灭菌，开启与3D打印机配套的超净工作台，紫外线照射灭菌，通过可移动式紫外灯对工作台周围环境进行紫外灯照射灭菌。用DMEM高糖培养基将GelMA冻干粉配制为12.5%的墨水溶液，置于70 ℃水浴中使其充分溶解，用0.22 µm过滤器进行过滤除菌。将过滤后的GelMA溶液与第2代兔耳软骨细胞和蓝光引发剂充分混合，配制成细胞终浓度为1×1010 L-1、蓝光引发剂终浓度为0.25%的生物墨水。置入3D打印机中，待墨水状态稳定后，进行逐层打印，选用内径为250 μm的针头，温度设置为20 ℃，支架大小设置为10 mm×5 mm，层高0.32 mm，层数为8层，打印线间距为1.2 mm。每层打印后用405 nm蓝光光照交联3-5 s，使其充分固化，得到含有兔耳软骨细胞的水凝胶复合支架，加入DMEM高糖完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
1.4.3 对复合支架进行加压培养取6孔板中培养5 d的复合支架于TC-3F力学加压生物反应器中，将TC-3F生物反应器置于TEB1005灌流培养箱中，可实现在对生物样本施加的力不变的情况下，培养基循环流动，支持反应器中样本的长期培养，减少污染概率。力学加压设置：频率0.5 Hz，位移0.50 mm，首次运动方向为下，往返，4 h/d，2周。灌流培养设置：手动模式，LF-318泵头，顺时针灌流，橡胶管内径1.65 mm，转速8 r/min，实际流速1.20 mL/min。对照组的复合支架仍置于6孔板中培养，每二三天更换一次新鲜DMEM高糖完全培养基。
1.4.4 不加压复合支架中细胞存活率检测培养第1，4，7天，取兔耳软骨复合支架样本，用活死细胞染色试剂盒进行细胞染色，利用共聚焦荧光显微镜进行观察和拍照，在对应波长的光激发下，活细胞呈绿色，死细胞呈红色，对样本进行全景扫描后输出图像，利用共聚焦显微镜分析模块将色彩分类后进行细胞计数，按细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%的公式进行计算。另外，选取5个任意区域在Z轴上对复合支架进行层层扫描，图像拟合后输出，观察样品细胞分布及密度变化。
1.4.5 加压组与不加压组复合支架细胞存活率检测培养2周后，取加压组和不加压组复合支架，活死染色后在Z轴上进行图像采集，检测细胞存活情况，具体方法同上。
1.4.6 加压组与不加压组复合支架组织切片观察培养2周后，取加压组和不加压组复合支架，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，切片厚度3 μm，常规进行苏木精-伊红、番红O、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。
番红O染色：石蜡切片常规脱蜡至水后，番红O染色液滴染5 min后流水冲洗，常规脱水，二甲苯透明，风干后中性树脂封固。
Ⅰ型胶原免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水后，PBS充分清洗，内源性过氧化物酶阻断10 min，PBS充分漂洗，复合酶消化(37 ℃，30 min)；PBS漂洗，羊血清封闭(37 ℃，30 min)，吸除多余血清，一抗孵育(1∶1 000)(4 ℃过夜)；PBS充分漂洗，二抗孵育(37 ℃，30 min)；PBS充分漂洗，DAB显色，水洗、分化，常规脱水，二甲苯透明，风干后中性树脂封固。
1.4.7 加压组与不加压组复合支架qRT-PCR检测培养2周后，取加压组和不加压组复合支架，采用Trizol法提取水凝胶支架中的总RNA后，利用NanoDrop 2000c 微量分光光度计检测所提取总RNA的浓度及纯度，达到实验条件后，进行反转录反应(1 000 ng RNA)，得到的cDNA保存在-20 ℃。SYBR GREEN 的qRT-PCR法检测成软骨相关基因弹性蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、赖氨酸氧化酶的mRNA 相对表达量，以β-actin作为内参对照物，每个样品设3个复孔，反应条件为95 ℃300 s，95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，95 ℃60 s，60 ℃60 s，95 ℃1 s，40 ℃30 s，循环45次，用 2-ΔΔCt 法计算各基因mRNA的相对表达量。引物在Pubmed上设计并验证，由擎科公司代为合成(中国，北京)，基因引物序列见表1。

1.4.8 复合支架裸鼠皮下植入腹膜内注射1%戊巴比妥溶液麻醉裸鼠，沿背部中线剪开一长约1.2 cm纵切口，将培养2周后的加压组和不加压组复合支架分别植入腹部两侧，缝合切口。5周后，麻醉后脊椎脱臼法处死裸鼠后取材，大体观察两组复合支架的形态、大小和力学特性；40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，切片厚度3 μm，苏木精-伊红染色初步观察裸鼠体内软骨形成情况。
1.5 主要观察指标加压组与不加压组复合支架的大体形态结构和细胞存活率，以及在体内、体外的软骨形成情况。
1.6 统计学分析应用 Graphpad Prism 7软件进行统计分析，用x±s来表示各组数据，单因素方差对组内不同时间点间进行比较分析，t检验则用来对两组间数据进行比较，P < 0.05 代表差异有显著性意义。统计学方法已经中国医学科学院整形外科医院生物统计学专家审核。

讨论

组织工程软骨植入后的形变和组织转归，一直是制约其临床应用的瓶颈之一。基于生物3D打印构建软骨支架为软骨组织工程的发展注入了新的活力。天然生物材料具有极高的生物相容性，是良好的3D生物打印的细胞载体，而且其引起的炎症反应低，因此是目前生物材料应用的热点，但如何提高其力学强度是软骨组织构建中应用的关键所在。以GelMA为例，有研究者通过调节交联网络[16]，或与其他力学强度比较高的生物材料例如聚乳酸和聚己内酯一起进行打印[17]，但这会极大减缓支架材料降解速度；或者添加如纳米羟基磷灰石、聚乙烯甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、磷酸三钙等方式调节其力学强度[18-20]，复合材料的研发虽然在一定程度上提高了构建物的力学强度，但多种成分的添加同时也会引起更多的不良作用和炎症反应。
机械应力、缺氧和生物分子等这些外部因素对组织、细胞的生长发育极为关键。应力表现形式可以是压力(压缩)、表面的摩擦力、剪切力和拉力，以及压力中特殊的力——细胞内外的静水压力。在软骨正常生长发育过程中，软骨组织会受到正常的机械刺激，软骨细胞作为软骨组织中的唯一细胞类型，可以感知和响应各种细胞外机械信号[21]。对机械信号的敏感性和对刺激的适应性反应是软骨细胞的基本特征。软骨细胞含有一组完整的机械传感器，包括初级纤毛、机械敏感离子通道、整合素和细胞骨架，可以感知这些机械信号[22-23]。多项研究表明，在培养过程中，在较小幅度和持续时间范围内的机械刺激可以产生各向异性、机械性能优异的软骨结构，具有较高的细胞活力[24]。与静态软骨组织培养相比，机械刺激是细胞外基质合成和伴随机械性能增强的有效促进剂[25]。此外，机械刺激的加入也产生了一些特有的变化，比如基质组织结构重塑，这些特征是仅用生物活性因子无法实现的[26]。物理方法相对更安全，不良作用更小，是一种良好的细胞功能调节方式。因此，作者尝试通过施加力学刺激促进软骨基质形成，提高构建物的力学强度。
此次实验中采用目前研究应用最多的GelMA作为生物材料，结果显示，第1，4，7天耳软骨细胞在GelMA的细胞存活率均达到了90%以上。在3D生物打印过程中，采用微挤出式3D生物打印机，细胞在打印过程中会遭受喷嘴处的壁剪切力等刺激，降低细胞存活率，因此可见第1天细胞存活率略低于第4，7天，到后期细胞状态稳定，细胞存活率不再发生明显变化。
机械应力对细胞影响的相关研究主要集中在骨细胞、软骨细胞和干细胞。QIN 等[27]研究发现，骨细胞在力的作用下，利用各种分子力学传感器，如细胞骨架成分、骨细胞树突、离子通道等实现对力学刺激的适应，从而促进骨组织的形成。吕小杰等[28]将猪耳郭软骨细胞接种于聚乳酸支架，以频率0.5 Hz，作用时间4 h/d，于灌流-液压式反应器中对工程化耳软骨组织进行加压培养3周后，结果显示细胞外基质成分蛋白聚糖等含量增加，表明加压有利于软骨细胞外基质的分泌。在软骨构建的研究中，发现对间充质干细胞形成的pellet或支架施加0.5-10 MPa、1 Hz等不同频率，2-4 h/d，为期3-14 d等不同时长的循环静水压力压缩，所构建软骨的蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原基因表达会上调[29]。在对软骨细胞的机械应力研究中发现，对2D层面的软骨细胞施加循环压缩应力时，聚集蛋白聚糖和Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原基因表达上调，可以促进细胞外基质的合成，增加糖胺聚糖的生成[30]。对存在于水凝胶共价网络中的软骨细胞应用动态压缩的力学刺激，能够改善基质的生物合成[31]。另外，对于3D培养的软骨细胞来说，力学刺激对细胞的影响与所处生物材料的黏弹性强度、生物活性和刚度、细胞来源部位、类型、年龄等都有很大关系。研究显示，生物材料刚度越高，软骨细胞在刺激过程中暴露的应力水平也较高，其力学性能变化越明显，这也说明了支架固有的力学特性可能影响生物材料中细胞外基质与细胞间的机械转导作用。另外，与供体年龄较大的软骨细胞相比，供体年龄较小的软骨细胞在同样的力学环境下糖胺聚糖含量增加的更多[32]。
此次实验选择机械压力作为刺激方式，放于生物加压反应器(TC-3F)中，加压参数设置为0.5 Hz、位移0.5 mm、4 h/d，加压2周。结果显示，加压后细胞存活率降低，但Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、弹性蛋白、赖氨酸氧化酶的表达上调，其中弹性蛋白、Ⅱ型胶原显著上调(P < 0.05)。分析原因为：加压培养后显著影响了细胞的存活，在加压过程中，经历了打印过程的软骨细胞更脆弱，在压力刺激下细胞死亡增加；但存活下来的细胞活力增加，其合成细胞外基质的能力增加，成软骨能力增强，因此，组织学染色结果显示加压组细胞进入支架间空隙区的细胞数量增加，而且细胞周基质染色加深。特别是植入裸鼠体内5周后的结果显示，加压组在存活细胞数量减少的情况下仍然形成了形态外观良好、具有一定力学强度的软骨组织，进一步说明加压刺激能促进软骨细胞活力和功能。
弹性纤维是细胞外基质中最大的结构，与胶原纤维共同存在，赋予组织弹性、抗张能力和力学性能[33]，弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，需由原弹性蛋白单体在赖氨酸氧化酶等的诱导下进行交联反应，与微纤维组装后形成成熟的弹性纤维[34]。成熟的弹性纤维是维持弹性软骨力学性能的一个主要因素。研究表明，在因力学强度不足而出现变形、塌陷等问题的组织工程构建耳郭植入物中，其组织学检测发现并未形成成熟的弹性纤维，弹性纤维相关组分的表达量未达到正常组织水平[3]。此次实验结果显示，力学刺激可使弹性纤维相关基因弹性蛋白和赖氨酸氧化酶的表达上调，形成成熟弹性纤维的能力增强，能在一定程度上提高复合支架的力学强度。
此次实验通过3D生物打印技术制备了结构稳定、细胞存活率高、可在体外形成软骨组织的软骨细胞-GelMA复合支架，并利用TC-3F生物加压反应器对支架进行了加压处理，结果初步显示了力学刺激对生物3D打印软骨组织基质形成的促进作用，为力学生物反应器和3D生物打印技术联和应用构建组织工程软骨组织提供了技术参数，也为水凝胶支架中耳软骨机械应力的研究奠定了实验基础。需要注意的是，此次压力刺激参数仍然引起了细胞死亡，所以，在此基础上将进一步改变加压频率、时长和形变量，以及打印材料的配比，通过评估细胞层面的变化更好地解释机械刺激与基质分泌的关系，探求更适合的培养条件，从而改善组织工程构建物的力学强度。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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延伸阅读

耳软骨组织工程发展至今已取得了长足的进展，目前已有临床应用，但长期随访中发现，组织工程植入物出现一定程度的塌陷、变形等问题，无法维持其结构，从而影响术后效果，主要原因在于组织基质形成不均、力学强度不足等瓶颈问题的存在。#br# 力学刺激对软骨细胞的影响一直以来是研究的热点，软骨正常发育形成过程中受到机械载荷和缺氧这些正常的应急源，是分子水平上调控软骨形成的重要因素。研究表明，力学刺激是促进软骨基质分泌的有效手段，合适的力学刺激，可以影响软骨细胞表型，改变细胞外基质成分的表达，从而增强组织构建软骨的力学性能。耳软骨所处位置没有较大的生物力学作用，但其是机械敏感的，但目前关于细胞生物力学的研究主要集中在关节软骨，耳软骨作为弹性软骨，细胞外基质成分与跟关节软骨不同，这种异质性会导致不均匀的应力应变，从而影响细胞对于机械刺激的反应。因此，对于耳软骨细胞力学作用的研究是重要的。另外对于载体的选择，研究表明，不同生物活性的材料其包裹的细胞所受到机械刺激的反应也不同，支架的组成可以显著影响机械刺激对软骨细胞的反应，甲基丙烯酰胺基明胶具有生物相容性好、性能可调节等优点，非常适合用作组织工程细胞生物力学研究的载体。#br# 此次实验采用甲基丙烯酰胺基明胶这一光敏化水凝胶与耳软骨细胞相混合，利用3D生物打印技术制备生物3D打印软骨构建物，与生物反应器相结合，研究生物3D打印软骨构建物在力学刺激下的生物学表现，为3D生物打印技术与生物反应器的联合应用提供技术参数。#br#

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

Mechanical stimulation enhances matrix formation of three-dimensional bioprinted cartilage constructs

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