聚己内酯和β-磷酸三钙复合支架经血小板衍生生长因子BB修饰后的促血管生成作用

doi:10.12307/2023.415

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血小板衍生生长因子：是来源于血小板的一种双链二聚体可溶性糖蛋白，包含5种同分异构体，广泛存在于骨组织中，在骨损伤修复与创伤愈合中具有重要作用，其既是结缔组织细胞和其他类型细胞的主要有丝分裂原，又是一种高效促细胞趋化因子，可刺激成骨细胞等的增殖与迁移，促进血管再生。
聚己内酯/β-磷酸三钙支架：聚己内酯具有良好的生物可降解性与生物相容性，是骨组织工程支架的主体材料之一，但其单独应用还存在很多问题，例如缺乏生物活性、机械性能差、降解速度较慢等，所以，改性与优化聚己内酯是目前的热点研究内容。β-磷酸三钙具有与天然骨矿物质相似的化学成分与晶体结构，拥有良好的机械强度、骨传导与骨诱导作用，将其与聚己内酯复合可提升支架的成骨诱导性与机械性能。

背景：组织工程技术的发展为骨缺损的修复重建提供了新的思路，但是血管化问题使组织工程骨应用于临床受到了制约。血小板衍生生长因子在促进骨细胞形成的同时也可促进骨组织中血管的形成。
目的：观察聚己内酯/β-磷酸三钙/血小板衍生生长因子BB支架对骨髓间充质干细胞成骨分化及人脐静脉内皮细胞增殖、黏附的影响，以及修复骨缺损的效果。
方法：①利用3D快速成形机制备聚己内酯/β-磷酸三钙支架(记为PCL/β-TCP支架)，将支架浸渍于血小板衍生生长因子BB溶液中制备聚己内酯/β-磷酸三钙/血小板衍生生长因子BB支架(记为PCL/β-TCP/PDGF BB支架)。②体外实验：将骨髓间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞分别接种于两种支架上，检测骨髓间充质干细胞的成骨分化情况，检测人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附与成血管基因表达。③体内实验：取21只成年大鼠，建立双侧胫骨缺损模型，实验组植入PCL/β-TCP/PDGF BB支架，对照组植入PCL/β-TCP支架，空白组不植入支架，每组7只。术后12周，进行Micro-CT扫描、骨组织形态学观察及成骨与成血管基因检测。
结果与结论：①体外实验：与PCL/β-TCP支架相比，PCL/β-TCP/PDGF BB支架可促进骨髓间充干细胞的成骨分化，促进人脐静脉内皮细胞的增殖与黏附，促进人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子、CD31 mRNA的表达。②体内实验：Micro-CT扫描显示，空白组可见明显的骨缺损，对照组、实验组均可见大量新生的骨组织，实验组修复效果更明显。苏木精-伊红染色、Masson和番红固绿染色显示，空白组没有明显骨组织形成；对照组可见大量成熟度较高的骨基质及相对较少的不成熟软骨组织；实验组可见大量的骨样组织及成熟度较高的软骨组织，大部分髓腔再通。RT-PCR检测显示，实验组骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素、血管内皮生长因子、CD31的mRNA表达量均高于对照组(P < 0.05)。③结果表明：相比于PCL/β-TCP支架，PCL/β-TCP/PDGF BB支架可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化、人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附并表达成血管相关基因，促进骨缺损的修复。
https://orcid.org/0000-0002-1062-9684(赵金龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨缺损, 聚己内酯, β-磷酸三钙, 血小板衍生生长因子(PDGF)BB, 血管形成, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: The development of tissue engineering technology provides new ideas for the repair and reconstruction of bone defects, but the problem of vascularization restricts the clinical application of tissue engineered bone. Platelet-derived growth factor can promote the formation of blood vessels in bone tissue while promoting the formation of bone cells.
OBJECTIVE: To observe the effects of polycaprolactone /β-tricalcium phosphate/platelet-derived growth factor BB (PCL/β-TCP/PDGF BB) scaffold on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and proliferation and adhesion of human umbilical vein endothelial cells in vitro, as well as the effect of its application in animal bone defects.
METHODS: (1) Polycaprolactone/β-tricalcium phosphate scaffolds were prepared by 3D rapid prototyping machine, and the scaffolds were immersed in platelet-derived growth factor BB solution to prepare PCL/β-TCP/PDGF BB scaffold. (2) In vitro experiment: Bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells were inoculated on two kinds of scaffolds, respectively, to detect the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and to detect the proliferation, adhesion and angiogenic gene expression of human umbilical vein endothelial cells. (3) In vivo experiment: 21 adult rats were taken to establish a bilateral tibial defect model. The experimental group (n=7) was implanted with PCL/β-TCP/PDGF BB scaffolds; the control group (n=7) was implanted with PCL/β-TCP scaffolds; the blank group (n=7) was not implanted with scaffolds. At 12 weeks after operation, micro-CT scanning, bone histomorphological observation, and gene detection of osteogenesis and angiogenesis were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: Compared with PCL/β-TCP scaffold, PCL/β-TCP/PDGF BB scaffold could promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, promote the proliferation and adhesion of human umbilical vein endothelial cells, and promote vascular endothelial growth factor and CD31 mRNA expression in human umbilical vein endothelial cells. (2) In vivo experiments: Micro-CT scans exhibited that bone defects were obvious in the blank group. A large amount of new bone tissue was visible in both control and experimental groups. The repair effect of the experimental group was more clear. Hematoxylin-eosin staining, Masson and safranin fast green staining displayed that there was no obvious bone tissue formation in the blank group. In the control group, a large amount of mature bone matrix and relatively less immature cartilage tissue were detectable. In the experimental group, a large amount of osteoid tissue and mature cartilage tissue were seen, and most of the medullary cavity was recanalized. RT-PCR detection showed that the mRNA expression levels of bone morphogenetic protein 2, basic fibroblast growth factor, alkaline phosphatase, osteocalcin, vascular endothelial growth factor and CD31 in the experimental group were higher than those in the control group (P < 0.05). (3) It is concluded that compared with PCL/β-TCP scaffold, PCL/β-TCP/PDGF BB scaffold promoted the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, the proliferation, adhesion and expression of angiogenic genes of human umbilical vein endothelial cells, and promoted the repair of bone defects.

Key words: bone defect, polycaprolactone, β-tricalcium phosphate, platelet derived growth factor BB, angiogenesis, tissue engineering

中图分类号:

赵金龙, 刘继超, 于洋. 聚己内酯和β-磷酸三钙复合支架经血小板衍生生长因子BB修饰后的促血管生成作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3300-3306.

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图/表（结果） 11

2.1 体外实验结果
2.1.1 骨髓间充质干细胞的接种结果诱导第7天进行碱性磷酸酶染色，镜下观察到PCL/β-TCP/PDGF BB支架上骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达量高于PCL/β-TCP支架；诱导第14天进行茜素红染色，镜下观察到PCL/β-TCP/PDGF BB支架上骨髓间充质干细胞的钙沉积多于PCL/β-TCP支架。两种支架上骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果，见图1。

诱导第21天进行RT-PCR检测，结果显示：PCL/β-TCP支架上骨髓间充质干细胞的骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的相对表达量分别为1.13±0.15，1.46±0.24，0.59±0.09，1.28±0.42，PCL/β-TCP/PDGF BB支架上骨髓间充质干细胞的骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的相对表达量分别为2.65±0.29，3.13±0.44，1.01±0.37，2.79±0.53，两组间4种基因表达量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.1.2 人脐静脉内皮细胞的接种 CCK-8实验结果显示，PCL/β-TCP/PDGF BB支架上人脐静脉内皮细胞的活性大于PCL/β-TCP支架，两组间48，72 h的细胞活性比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，图3。

倒置荧光显微镜与扫描电子显微镜下可观察到，PCL/β-TCP/PDGF BB支架上人脐静脉内皮细胞的黏附数量明显多于PCL/β-TCP支架，两组间细胞黏附数量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，5。

RT-PCR检测结果显示，PCL/β-TCP/PDGF BB支架上人脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子、CD31的mRNA表达量均高PCL/β-TCP支架(P < 0.05)，见图6。

2.2 体内实验结果
2.2.1 实验动物数量分析 21只大鼠全部进入结果分析。
2.2.2 Micro-CT扫描见图7。

通过Micro-CT扫描胫骨标本观察到，3组大鼠胫骨缺损部位有明显的差异，空白组仍可见明显的缺损，修复效果不明显；对照组、实验组均可见新生的骨组织，其中以实验组修复效果更明显，新生骨组织更多。骨组织形态计量学参数分析结果显示，对照组大鼠胫骨缺损处的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量多于空白组(P < 0.05)；实验组大鼠胫骨缺损处的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量多于对照组(P < 0.05)。
2.2.3 骨缺损部位组织形态学观察见图8。

苏木精-伊红染色、Masson和番红固绿染色显示，空白组没有明显骨组织形成，缺损部位主要由少量的血管与大量结缔组织填充；对照组缺损部位可见大量成熟度较高的骨基质及相对较少的不成熟软骨组织；实验组骨缺损部位可见大量的骨样组织及成熟度较高的软骨组织，大部分髓腔再通。
Huddleston组织学评分结果显示，空白组评分低于对照组(P < 0.05)，对照组评分低于实验组(P < 0.05)。
2.2.4 RT-PCR检测结果对照组缺损部位的成骨相关基因骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素的mRNA表达量均高于空白组(P < 0.05)，实验组缺损部位骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素的mRNA表达量均高于对照组(P < 0.05)，见表3。对照组缺损部位成血管相关基因血管内皮生长因子、CD31的mRNA表达量均高于空白组(P < 0.05)，实验组缺损部位血管内皮生长因子、CD31的mRNA表达量均高于对照组(P < 0.05)，见表3。

2.3 支架的生物相容性由体外细胞实验与动物体内实验可知，PCL/β-TCP/PDGF BB支架具有良好的生物相容性。

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引言

近年来，组织工程与再生医学发展迅速，为骨缺损的修复重建指引了新的方向。骨组织工程将支架、种子细胞与活性生长因子结合在一起作为骨移植替代物，为骨缺损部位的新骨形成提供支架，并为细胞的黏附、增殖与分化提供有利的微环境[1-3]。其中，支架的支撑与诱导成骨发挥着举足轻重的作用，而支架材料的选择是骨组织工程支架制作过程中的重点内容。
在人工合成的高分子有机化合物中，聚己内酯具有良好的生物可降解性与生物相容性，是骨组织工程支架的主体材料之一[4-7]，但其单独应用还存在很多问题，例如缺乏生物活性、机械性能差、降解速度较慢等，所以，改性与优化聚己内酯是目前的热点研究内容。β-磷酸三钙具有与天然骨矿物质相似的化学成分与晶体结构，拥有良好的机械强度、骨传导与骨诱导作用[8-11]，将其与聚己内酯复合可提升支架的成骨诱导性与机械性能。大量的文献报道已证实，聚己内酯/β-磷酸三钙(polycaprolactone/β-tricalcium phosphate，
PCL/β-TCP)支架具有良好的机械性能与生物相容性，可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化[12-15]，适合作为骨组织工程支架。
虽然组织工程技术的发展为骨缺损的修复重建提供了新的思路，但是血管化问题使组织工程骨应用于临床受到了制约。血管化作为组织工程骨移植的基础，近年来与其相关的研究取得了突出进展，其中生长因子在血管化过程中扮演了重要的角色。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)是来源于血小板的一种双链二聚体可溶性糖蛋白，包含5种同分异构体，其中PDGF BB为该家族中活性最强的细胞因子。XIE等[16]通过小鼠实验证实，由前破骨细胞分泌的PDGF BB，在促进骨细胞形成的同时也可促进骨组织中血管的形成。那么，将PDGF BB负载至PCL/β-TCP支架上是否可促进骨形成与骨组织中的血管形成？针对该问题，此次实验进行了初步探索，观察PCL/β-TCP/PDGF BB支架体外对骨髓间充质干细胞成骨分化与人脐静脉内皮细胞增殖、黏附、成血管基因表达的作用，以及将其应用于动物骨缺损的效果，以期为组织工程血管化提供一定的实验室数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2020年3月至2021年6月在西安交通大学医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂大鼠骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；聚己内酯购自上海创赛科技有限公司；纳米β-磷酸三钙购自南京埃普瑞纳米材料有限公司；PDGF BB购自购自武汉纯度生物科技有限公司；成骨诱导分化培养基购自无锡菩禾生物医药技术有限公司；RNA提取试剂盒购自吉玛制药有限公司；细胞外基质培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子购自北京索莱宝科技有限公司；碱性磷酸酶染色试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司；苏木精-伊红、Masson和番红固绿染色试剂盒购自武汉博尔夫生物科技有限公司。
1.3.2 主要仪器 3D打印快速成形机购自上海富奇凡机电科技有限公司；Micro-CT扫描仪购自北京博益伟业仪器有限公司；倒置荧光显微镜(BDS400FL)购自重庆奥特光学仪器有限责任公司；扫描电子显微镜(JCM-7000)购自惠州市华高仪器设备有限公司；CO2细胞培养箱购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
1.3.3 实验动物成年雄性SD大鼠，健康级，共21只，体质量约220 g，购自西安交通大学医学院。实验动物饲养于西安交通大学医学院，饲养环境温度约24 ℃，相对湿度55%，12 h光照/12 h暗夜循环，自由进食、饮水。实验获得西安交通大学医学院伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 制备支架首先，利用3D打印机配套CAD软件设计支架纤维直径为0.5 mm、层高0.3 mm、叠加角度为0°/90°。将聚己内酯与纳米β-磷酸三钙按照8∶2的质量比混合均匀，置于切粒机中制备为颗粒原材料。随后将混合颗粒置于3D打印机料筒内，设置熔融池进料温度为120 ℃、出料温度为110 ℃，将混合材料在熔融池中保温120 min，保证其充分熔融。融化后，将材料通过注射式精细喷头挤出，层层叠加形成支架，设定喷头移动速度为5 mm/s。将冷却后的PCL/β-TCP支架置入体积分数70%乙醇中24 h，风干后密封保存备用。
将PCL/β-TCP支架置入10 mg/L的PDGF BB溶液中，在4 ℃温度下孵育24 h，制备PCL/β-TCP/PDGF BB支架。
1.4.2 体外实验
(1)骨髓间充质干细胞的接种：将第3代骨髓间充质干细胞分别接种于PCL/β-TCP支架与PCL/β-TCP/PDGF BB支架上，细胞密度为3×104/孔，加入成骨诱导分化培养基培养。
成骨诱导分化检测：①诱导第7天，取两组样本各3个，以PBS清洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定，按照试剂盒说明书操作进行碱性磷酸酶染色，采用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度值。②诱导第21天，取两组样本各3个，以PBS清洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定，按照试剂盒说明书操作进行茜素红染色，置于显微镜下观察；随后，在405 nm波长处检测吸光度值。③诱导第14天，收集两组支架上的细胞，使用RNA提取试剂盒提取两组细胞总RNA，使用cDNA第一链合成试剂盒将其反转录为cDNA；进行荧光定量PCR引物设计和合成，见表1；PCR反应条件为初始活化95 ℃2 min，两步循环变性95 ℃5 s，退火/延伸60 ℃10 s，共循环40次。采用RT-PCR检测成骨相关基因骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶及骨钙素的表达，以β-actin作为内参基因。每组设置3复孔，每个基因表达量以2-ΔΔCt进行定量分析。

(2)人脐静脉内皮细胞的接种：将两种支架分别置入含体积分数10%胎牛血清、1%内皮细胞生长因子与1%青-链霉素的细胞外基质培养基中，支架与培养基的比例为50 mg/
1 mL，在37 ℃环境下浸提24 h，即制得两组支架浸提液。
细胞增殖：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，1 000 r/min离心5 min后，重悬稀释于细胞计数板下计数，随后铺于96孔板内，细胞密度为5×103/孔。静置24 h后分3组处理，对照组加入含体积分数10%胎牛血清、1%内皮细胞生长因子与1%青-链霉素的ECM培养基，实验组分别加入两种支架浸提液，100 µL/孔，每组设置3复孔。设定不同的时间点，弃原有的培养基，每孔加入CCK-8溶液100 µL，37 ℃避光孵育1 h，在450 nm波长处检测各孔吸光度值，计算细胞活力。
细胞黏附：将两种支架分别置于24孔板内。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，1 000 r/min离心5 min后，重悬稀释于细胞计数板下计数，随后铺于24孔板内，细胞密度为5×104/孔。24 h后取出支架，PBS清洗3遍，加入40 g/L
多聚甲醛固定，以PBS再次清洗3遍，加入DAPI染液孵育10 min，以PBS再次清洗3遍，置于倒置荧光显微镜下观察细胞黏附情况。另外，取两组支架样本，固定、脱水、干燥，置于扫描电子显微镜下观察细胞黏附情况。
成血管基因表达：将Matrigel滴加在96孔板上，15 µL/孔，轻柔晃动孔板使Matrigel均匀铺在孔板内。将人脐静脉内皮细胞消化后离心，弃上清，接种于上述96孔板内，接种密度为109 L-1；随后将两种支架分别置入孔板内，培养24 h。采用RT-PCR检测成血管相关基因血管内皮生长因子、CD31的表达，检测方法同上。引物设计见表1。
1.4.3 体内实验
实验造模与分组干预：取21只SD大鼠，1%戊巴比妥钠
(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，在双侧后肢备皮后固定、消毒、铺无菌巾，自胫骨平台纵下切开皮下组织、肌肉等，暴露胫骨平台；以胫骨平台为中心，使用电钻钻孔并击穿胫骨，生理盐水清洗损伤部位后，按照随机数字表法分3组，空白组不植入任何材料，对照组植入PCL/β-TCP支架，实验组植入PCL/β-TCP/PDGF BB支架，每组7只。植入材料后，分层缝合伤口，对合皮肤。术后连续3 d肌注青霉素5×104 U预防感染。
检测指标：①术后12周，麻醉实验大鼠，采用Micro-CT
扫描胫骨缺损部位，并对骨组织形态计量学参数进行分析，包括骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量。②Micro-CT扫描完成后处死大鼠，取胫骨标本，经固定、脱钙及去酸等处理后制作石蜡切片，片厚6 µm，分别进行苏木精-伊红、Masson和番红固绿染色，光镜下观察。对骨缺损部位骨生成情况进行Huddleston组织学评分[17]，组织学评分越高说明修复效果越好。③采用RT-PCR检测胫骨标本成骨相关基因骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、碱性磷酸酶、骨钙素的表达，成血管相关基因血管内皮生长因子、CD31的表达。
1.5 主要观察指标 PCL/β-TCP/PDGF BB支架对骨髓间充质干细胞成骨分化及人脐静脉内皮细胞增殖、黏附的影响，以及修复骨缺损的效果。
1.6 统计学分析将所有数据输入SPSS 25.0统计学软件中，计量资料以x±s格式表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行3组之间比较，采用LSD检验进行两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经西安交通大学医学院附属三二〇一医院生物统计学专家审核。

讨论

骨缺损修复是涉及大量成骨前体细胞、炎性细胞、内皮细胞与造血细胞参与的一个复杂协调的再生过程[18-20]，而骨缺损后的低氧环境与不足的新生血管数量可导致细胞的大量坏死，影响骨修复质量。大量文献已报道，骨缺损修复过程与骨相关细胞及血管内皮细胞存在密切的关系，该两种细胞在功能上相互依赖、相互促进，二者的相互作用在骨修复过程中发挥着重要的作用[21-22]。在组织工程中，支架材料应当可促进与支持骨细胞、血管内皮细胞或者是其他相关生长因子浸润的作用，通过加速细胞增殖与黏附过程来实现促成骨与血管化，进而促进骨缺损修复。因此，此次实验主要观察了PCL/β-TCP/PDGF BB支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，对人脐静脉内皮细胞增殖、黏附及成血管基因表达的影响，以及该支架在大鼠骨缺损中的应用效果，以寻找一种加速骨缺损修复的方法。
PDGF广泛存在于骨组织中，在骨损伤修复与创伤愈合中具有重要作用，其既是结缔组织细胞和其他类型细胞的主要有丝分裂原，又是一种高效促细胞趋化因子，可刺激成骨细胞等的增殖与迁移，促进血管再生。并且，PDGF可刺激成骨细胞合成护骨素来抑制破骨细胞的形成，抑制骨吸收，促进骨改建，刺激骨再生[23-25]。碱性磷酸酶染色主要反映细胞中碱性磷酸酶阳性水平，是骨髓间充质干细胞成骨分化的早期标志；茜素红染色主要反映钙结节的数量，是骨髓间充质干细胞成骨分化的晚期标志。此次实验通过溶液浸渍法将PDGF BB负载至PCL/β-TCP支架上，体外实验结果显示，PCL/β-TCP/PDGF BB支架组早期与晚期的成骨分化显著优于PCL/β-TCP支架组，并且，RT-PCR检测显示PCL/β-TCP/PDGF BB支架可促进骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达，说明PDGF BB增强了骨髓间充干细胞的成骨分化能力。魏琴等[26]
采用25 μg/L的PDGF BB干预骨髓间充质干细胞，通过碱性磷酸酶、茜素红染色与成骨相关基因检测证实，PDGF BB可诱导骨髓间充质干细胞分化为具有功能的成骨细胞，与此次实验结果一致。吴硕等[27]将PDGF BB基因转染的骨髓间充质干细胞与未转染基因的骨髓间充质干细胞分别注射至大鼠股骨牵张成骨间隙内，通过影像学与组织学观察证实，PDGF-BB基因转染的骨髓间充质干细胞可能促进大鼠牵张区新骨的形成，缩短新生骨痂的矿化时间，促进牵张成骨区域新生骨的成熟。以上实验结果证实，PDGF BB可促进骨髓间充干细胞的成骨分化。此次实验结果显示，相较于PCL/β-TCP支架，PCL/β-TCP/PDGF BB支架可促进人脐静脉内皮细胞的增殖与黏附，上调成血管相关基因的表达，说明PDGF BB促进了人脐静脉内皮细胞内皮细胞的增殖与黏附，刺激新生血管生成。
大鼠胫骨缺损实验结果显示，术后12周，实验组骨缺损部位成果效果明显优于对照组，并且显著上调了成骨相关基因与成血管相关基因的表达，证实PCL/β-TCP/PDGF BB支架可促进新骨生成，促进骨缺损修复。作为最重要的促血管生成因子，血管内皮生长因子在血管生成系统发育过程中发挥了重要的作用，其不但可促进内皮细胞的生长增殖与迁移、管腔结构的形成，还可以作为旁分泌因子参与骨形成与骨代谢过程[28-31]。CD31也是血管形成的标志性因子。PCL/β-TCP支架植入骨缺损部位后，也可刺激骨形成与一定的血管新生，而在该支架上负载PDGF BB后，骨缺损部位的新骨生成与血管形成更加明显，作者认为通过支架的缓释作用，PDGF BB持续不断地诱导内源性骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化的同时，也诱导血管内皮细胞的增殖、黏附、分泌成血管相关因子，为骨髓间充质干细胞的增殖与分化提供良好的微环境，两种细胞在体内相互协调作用，促进了骨缺损修复。接下来可设计骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞联合PCL/β-TCP/PDGF BB支架修复骨缺损，进一步验证PCL/β-TCP/PDGF BB支架的修复效果。
结论：相比于PCL/β-TCP支架，PCL/β-TCP/PDGF BB支架促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用更显著，更能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附、成血管相关基因的表达，促进动物体内骨缺损的修复。但是实验存在很多不足：预实验中选择了不同质量浓度(1，5，10 mg/L)的PDGF BB浸渍PCL/β-TCP支架，通过体外细胞实验得出，随着PDGF BB溶液质量浓度的增加，PCL/β-TCP/PDGF BB支架上骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性提高、茜素红染色钙结节沉积增加，成骨分化能力增强；人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附作用逐渐增强，成血管相关基因表达提高，所以，此次实验中选择采用10 mg/L的PDGF BB溶液浸渍PCL/β-TCP支架用于动物实验。尽管如此，目前无法断定实验应用的质量浓度为最佳浸渍浓度，后续实验还需要增加质量浓度设置，筛选最优的PDGF BB质量浓度。另外，动物实验周期较短，未来将继续增加实验观察点，进一步证实PCL/β-TCP/PDGF BB支架的促骨修复作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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延伸阅读

在人工合成的高分子有机化合物中，聚己内酯具有良好的生物可降解性与生物相容性，是骨组织工程支架的主体材料之一，但其单独应用还存在很多问题、例如缺乏生物活性、机械性能差、降解速度较慢等，所以，改性与优化聚己内酯是目前的热点研究内容。β-磷酸三钙具有与天然骨矿物质相似的化学成分与晶体结构，拥有良好的机械强度、骨传导与骨诱导作用，将其与聚己内酯复合可提升支架的成骨诱导性与机型性能。大量的文献报道已证实，聚己内酯/β-磷酸三钙支架具有良好的机械性能与生物相容性，可促进骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化，适合作为骨组织工程支架。#br# 虽然组织工程技术的发展为骨缺损的修复重建提供了新的思路，但是血管化问题使组织工程骨应用于临床受到了制约。血管化作为组织工程骨移植的基础，近年来与其相关的研究取得了突出进展，其中生长因子在血管化过程中扮演了重要的角色。血小板衍生生长因子是来源于血小板的一种双链二聚体可溶性糖蛋白，包含5种同分异构体，其中血小板衍生生长因子BB为该家族中活性最强的细胞因子。XIE等通过小鼠实验证实，由前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB在促进骨细胞形成的同时也可促进骨组织中血管的形成。那么，将血小板衍生生长因子BB负载至聚己内酯/β-磷酸三钙支架上是否可促进骨形成与骨组织中的血管形成？针对该问题，此次实验进行了初步探索，观察聚己内酯/β-磷酸三钙/血小板衍生生长因子BB支架体外对骨髓间充质干细胞成骨分化与人脐静脉内皮细胞增殖、黏附、血管基因表达的作用，以及将其应用于动物骨缺损的效果，以期为组织工程血管化提供一定的实验室数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程