1.1 设计 体外细胞观察对比性实验，两样本均数间的比较采用t检验；多个样本间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
1.2 时间及地点 实验于2020年9月至2021年12月在广西中医药大学科学实验中心分子生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株 HepG2细胞株购自上海赛百慷生物技术股份有限公司，货号为iCell-h092。
1.3.2 实验试剂 DMEM/F12培养基(上海源培生物，货号L310KJ)；胎牛血清(美国Gemini公司，货号9001-108)；流式抗体：CD133(美国BD公司，货号566593)；干细胞消化液(美国Invitrogen公司，货号E129610)；B27、N2、乳铁传递蛋白(美国Gibco公司，货号分别为17504-044、17502-048、
PHC9484)；成纤维细胞生长因子、表皮生长因子(美国PEPROTECH公司，货号分别为AF-100-18B、AF-100-15B)；反转录试剂盒(加拿大Fermentas公司，货号K1622)；四甲基乙二胺、ECL发光液(上海赛默飞公司，货号分别为17919、OH188466A)；GAPDH、NANOG、SOX2、OCT4一抗、鼠二抗、兔二抗(美国CST公司，货号分别为AF7021、4903s、3579s、2750s、8480s、4249)；Polybrene(英国Abcam公司，货号40804ES76)。
1.3.3 实验仪器 HF-90型二氧化碳培养箱(中国香港Heal Force公司)；超微量核酸测定仪、PCR仪、酶标仪(美国Thermo公司)；3120000.216型微量移液器(德国Eppendrof公司)；NU-C200R-E型离心机(中国香港天美公司)；BD C6型流式仪器(美国BD FASAria Cell Sorter公司)；DMi8型荧光显微镜(德国Leica公司)；人CD133微磁珠试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司)；Trizol Reagent(美国Ambion公司)；实时定量PCR仪(美国伯乐公司)；4200型全自动化学发光图像分析系统、凝胶成像系统(上海Tanon科技)。
1.4 实验方法
1.4.1 HepG2细胞的培养 将HepG2细胞接种于高糖DMEM培养液，置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中培养，隔日换液，观察细胞状态，待细胞贴壁比例大于80%，用0.25%胰蛋白酶消化细胞2 min，滴加DMEM培养液终止消化，于4 ℃、1 000 r/min低温离心机中离心5 min，弃上清，加入适量10%DMEM培养液，1∶3传代后继续培养。
1.4.2 磁珠分选 取培养至第3代对数生长期的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化2 min，4 ℃、1 000 r/min低温离心5 min后收集细胞沉淀，用300 μL缓冲液制成细胞浓度为1×1011 L-1的细胞悬液，加入100 μL CD133磁珠，混匀后于2-8 ℃孵育30 min，4 ℃、1 000 r/min低温离心10 min，去除上清液，然后过柱分离得到CD133+HepG2细胞；最后用缓冲液进行洗脱，并分离柱上吸附的CD133+HepG2细胞，每日观察细胞状态并记录，培养3代后进行诱导。
1.4.3 CD133+HepG2细胞诱导 预配干细胞培养液：DMEM/F12+表皮生长因子(20 μg/L)+成纤维细胞生长因子(20 μg/L)+乳铁传递蛋白(10 μg/L)+ B27(1X)+ N2(1X)；取足量对数生长期、分选后的CD133+HepG2细胞，换液，4 ℃、1 000 r/min低温离心5 min，用DMEM/F12培养液重悬，取10 μL细胞悬液滴于细胞计数板进行细胞总数测定，将细胞悬液浓度稀释至3×107 L-1，取100 μL接种于6孔培养板中(3 000个细胞/孔)，每孔加入2 mL干细胞培养液，置于培养箱中继续培养，培养至细胞数达到108个进行流式鉴定。
1.4.4 流式鉴定 将筛选、诱导后的CD133+HepG2细胞用干细胞消化液(1 mL 0.25%胰酶+0.02%EDTA)消化2 min，1 000 r/min、4 ℃低温条件离心5 min后收集细胞，计数，制成细胞浓度为1×109 L-1细胞悬液；用预冷的PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min、4 ℃低温条件离心5 min后弃上清，收集细胞沉淀，将500 μL 40 g/L多聚甲醛固定液加入Ep管中，吹打混匀并固定20 min，1 000 r/min、4 ℃低温条件离心5 min后收集细胞；继续PBS洗涤细胞1次，重复离心后弃上清，收集细胞沉淀，将500 μL 0.5% Triton X-100加入Ep管中破膜15 min，离心后收集细胞；再次PBS洗涤细胞1次，用100 μL含1%牛血清白蛋白的PBS重悬细胞，随后加入3 μL预冷的CD133流式抗体，混匀，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2遍，上机鉴定。
1.4.5 慢病毒包装、转染 借鉴杨丽兰[12]的实验方法，按照 RNA 干扰序列设计原则，由上海研集生物科技有限公司合成3条含干扰序列的双链DNA(β-catenin-RNAi-a：5’-GGT TAA TAA GGC TGC AGT TAT TTC AAG AGA ATA ACT GCA GCC TTA TTA ACC TTT TTT-3’；β-catenin-RNAi-b：5’-GCA TAA CCT TTC CCA TCA TTT CAA GAG AAT GAT GGG AAA GGT TAT GCT TTT TT-3’；β-catenin-RNAi-c：5’-GCT GAT CTT GGA CTT GAT ATT CAA GAG ATA TCA AGT CCA AGA TCA GCT TTT TT-3’)，并连接在酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物进行转化，对长出的克隆进行PCR鉴定，正确的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。严格按照慢病毒感染步骤，用DMEM完全培养基培养CD133+HepG2细胞至对数生长期，重悬于DMEM/F12培养基，细胞浓度为1×109 L-1，放入培养箱培养24 h，加入 60 μL聚凝胺，再加入50 μL慢病毒或者慢病毒空载体，继续培养72 h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，以评估感染效率，并选取干扰能力最佳病毒备用。
1.4.6 细胞分组、干预 实验设置设空白对照组，病毒空载组，病毒干扰组。将CD133+HepG2细胞接种于6孔板中，每孔细胞数为1×106个，培养72 h后，空白对照组不做处理，病毒空载组稳定感染入shRNA慢病毒空载质粒，病毒干扰组稳定感染入β-catenin-shRNA慢病毒质粒。培养72 h显微镜下观察，感染效率评估达80%后，收集细胞沉淀，进行后续检测。
1.4.7 β-catenin沉默后CD133+HepG2细胞的增殖、细胞周期 将各组CD133+HepG2细胞接种于直径6 cm的培养皿中，每皿接种200个细胞，并加入5 mL DMEM/F12培养基充分混匀，置37 ℃，体积分数为5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养14 d，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，吸弃培养液，用PBS小心浸洗2次，加40 g/L多聚甲醛固定15 min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，拍照记录。取各组处于对数生长期CD133+HepG2细胞，计数，制成细胞浓度为1×109 L-1的细胞悬液，收集于离心管中，400×g离心5 min，弃去培养液，加入1 mL PBS洗涤1次，400×g离心5 min，用DMEM/F12培养基重悬细胞，加入约1 mL无水乙醇固定细胞；加入100 μL的RNase A充分悬浮细胞，37 ℃水浴30 min，加入400 μL PI溶液充分混匀，4 ℃避光孵育30 min，上机检测。
1.4.8 Western blot检测SOX2，NANOG，OCT4的蛋白表达 在各组细胞沉淀中加入RIPA裂解液(RIPA∶PMPF=100∶1)，静置5 min，反复吹打，于4 ℃摇床上温和摇振15 min，收集蛋白，BCA法测蛋白浓度，酶标仪测定波长为562 nm的吸光度值，根据相应的标准曲线，计算待测样品的浓度及所需稀释的对应量；加入相应量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，缓冲液∶蛋白体积=1∶4，混匀后于100 ℃变性8 min，取出后分装备用，制胶后以恒压80 V，30 min之后恒压120 V，60 min进行蛋白电泳，电泳结束后将PAGE胶从玻板上卸下，装配转膜三明治，恒流，350 mA转60 min，将蛋白转移到PVDF膜上；用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液)室温封闭膜1 h；加入OCT4、NANOG、SOX2、GAPDH一抗(1∶1 000)室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min；加入对应鼠二抗(1∶5 000)、兔二抗(1∶5 000)孵育，按1∶1比例混合显影液A液和B液，将混合液均匀滴加于PVDF膜上，反应60 s，放入化学发光成像仪中，曝光，并拍照记录。以GAPDH为参照，用Quantity One软件测量各蛋白条带平均吸光度值，计算SOX2，NANOG，OCT4的蛋白表达。
1.4.9 qRT-PCR检测SOX2，NANOG，OCT4的mRNA表达 Triol法提取各组细胞总RNA，使用miRcute Puls miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将提取的RNA反转录为cDNA，应用qRT-PCR检测SOX2，NANOG，OCT4的mRNA表达。PCR扩增条件(反应体系为20 µL)为95 ℃反应5 min预变性，95 ℃反应10 s，60 ℃反应30 s，重复40次循环，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。引物序列具体信息见表1。
1.5 主要观察指标 ①CD133+HepG2细胞阳性率；②β-catenin-shRNA 慢病毒的封闭效果和感染效率；③β-catenin沉默后CD133+HepG2细胞的增殖情况、细胞周期以及SOX2，NANOG，OCT4的蛋白和mRNA表达水平。
1.6 统计学分析 利用SPSS 20.0软件进行统计学分析，利用Excel软件进行绘图。计量资料以x±s表示，两样本均数间的比较采用t检验；多个样本间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。检验水准设定为α=0.05，当P < 0.05 时，差异有显著性意义。
