碱性成纤维细胞生长因子通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进根尖牙乳头干细胞的增殖

doi:10.12307/2022.332

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2050-2055.doi: 10.12307/2022.332

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

碱性成纤维细胞生长因子通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进根尖牙乳头干细胞的增殖

付乙1，张羽1，何梅2，车彦霖3，梁静2，吴家媛2

1遵义医科大学，贵州省遵义市 563000；2遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000；3威海口腔医院，山东省威海市 264200

收稿日期:2020-12-04 修回日期:2020-12-11 接受日期:2021-05-21 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 吴家媛，博士，主任医师，研究生导师，遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000
作者简介:付乙，女，1995年生，贵州省铜仁市人，苗族，遵义医科大学在读硕士，主要从事口腔内科方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81460102)，项目负责人：吴家媛；遵义市优秀青年科技创新人才培养项目(遵优青科[2018]8号)，项目负责人：吴家媛；贵州省省长基金(黔省专合字[2012]16)，项目负责人：吴家媛；贵州省科技厅项目(黔科合J字LKZ[2013]11号)，项目负责人：吴家媛

Basic fibroblast growth factor promotes the proliferation of stem cells from the apical papilla through activation of Wnt/beta-Catenin signaling pathway

Fu Yi1, Zhang Yu1, He Mei2, Che Yanlin3, Liang Jing2, Wu Jiayuan2

1Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 3Weihai Stomatological Hospital, Weihai 264200, Shandong Province, China

Received:2020-12-04 Revised:2020-12-11 Accepted:2021-05-21 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: Wu Jiayuan, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Fu Yi, Master candidate, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81460102 (to WJY); the Foundation for Distinguished Young Talents in Technology Innovation of Zunyi, No. [2018]8 (to WJY); Guizhou Provincial Governor Foundation, No. [2012]16 (to WJY); Guizhou Science and Technology Fund, No. J LKZ[2013]11 (to WJY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
根尖牙乳头干细胞：一种牙源性干细胞，相比其他的牙源性干细胞，具有更强的再生、增殖能力。根尖牙乳头干细胞的生物学性能受诸多外源性因素影响，如碱性成纤维细胞生长因子等。
Wnt通路：是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组下游通道信号转导途径。通过使细胞表面受体活化，将细胞外信号传递到细胞内。Wnt/β-Catenin信号通路在细胞增殖、细胞命运决定和分化中发挥着作用。

背景：碱性成纤维细胞因子作用于成纤维细胞时，可以通过激活Wnt信号诱导其增殖，但在其作用于根尖牙乳头干细胞的研究中，是否也可以激活Wnt/β-Catenin信号通路，以及激活该通路后对根尖牙乳头干细胞的生物学活动有何影响尚不清楚。
目的：探讨碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞增殖的调控作用。
方法：通过酶消化法和有限稀释法克隆化培养人根尖牙乳头干细胞；以15 μg/L碱性成纤维细胞因子作用根尖牙乳头干细胞2 d，采用
RT-PCR、Western blot检测β-Catenin、TCF1、TCF3、LEF1 mRNA与蛋白的表达。然后进一步研究在Wnt/β-Catenin信号通路抑制的情况下碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞增殖的影响，设置碱性成纤维细胞因子(15 μg/L)+Dkk-1组、碱性成纤维细胞因子(15 μg/L)组和阴性对照组，采用MTT比色法和EdU法对比各组根尖牙乳头干细胞增殖情况。
结果与结论：①15 μg/L碱性成纤维细胞因子作用后上调了根尖牙乳头干细胞中β-Catenin、TCF1、TCF3、LEF1 mRNA和蛋白的表达(P < 0.05)；②碱性成纤维细胞因子(15 μg/L)组根尖牙乳头干细胞增殖能力强于碱性成纤维细胞因子(15 μg/L)+Dkk-1组和阴性对照组(P < 0.05)；③结果表明，碱性成纤维细胞因子作用根尖牙乳头干细胞后能促进Wnt/β-Catenin信号通路关键分子β-Catenin及下游分子TCF1、TCF3、LEF1的表达，Wnt/β-Catenin信号通路参与碱性成纤维细胞因子调控根尖牙乳头干细胞增殖的过程。
缩略语：碱性成纤维细胞因子：basic fibroblast growth factor，bFGF

https://orcid.org/0000-0001-5300-1267(吴家媛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 根尖牙乳头干细胞, 碱性成纤维细胞因子, Wnt/β-Catenin, 信号通路, 增殖

Abstract: BACKGROUND: When basic fibroblast factors act on fibroblasts, they can induce their proliferation by activating Wnt signaling. However, in the study of its effect on apical dental papilla stem cells, whether it can activate the Wnt/β-Catenin signaling pathway and the effect of activating this pathway on the biological activities of apical dental papilla stem cells remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory role of basic fibroblast growth factor on the proliferation of stem cells from apical papilla.
METHODS: Human stem cells from apical papilla were cloned and cultured through enzymatic digestion and limiting dilution assay, and then treated with 15 μg/L basic fibroblast growth factor for 2 days. RT-PCR and western blot assay were used to detect the expression of β-Catenin, TCF1, TCF3, and LEF1 mRNAs and proteins. The effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation of stem cells from apical papilla was further studied in the case of Wnt/β-Catenin signaling pathway inhibition. The basic fibroblast growth factor (15 μg/L) + Dkk-1 group, basic fibroblast growth factor (15 μg/L) group, and negative control group were set. The proliferation of stem cells from apical papilla in each group was compared by MTT assay and EdU assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression levels of β-Catenin, TCF1, TCF3, and LEF1 mRNAs and proteins were upregulated by 15 μg/L basic fibroblast growth factor on stem cells from apical papilla (P < 0.05). (2) The stem cells from apical papilla of the basic fibroblast growth factor (15 μg/L) group showed stronger proliferation activity than that in the negative control group and basic fibroblast growth factor (15 μg/L) + Dkk-1 group (P < 0.05). (3) Results suggest that basic fibroblast growth factor can promote the expression of key molecules β-Catenin in Wnt/β-Catenin signaling pathway and downstream molecules TCF1, TCF3, and LEF1. Wnt/β-Catenin signaling pathway participates in the regulation of basic fibroblast growth factor on the proliferation of stem cells from apical papilla.

Key words: stem cells, stem cells from apical papilla, basic fibroblast growth factor, Wnt/β-Catenin, signaling pathway, proliferation

中图分类号:

付乙, 张羽, 何梅, 车彦霖, 梁静, 吴家媛. 碱性成纤维细胞生长因子通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进根尖牙乳头干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2050-2055.

Fu Yi, Zhang Yu, He Mei, Che Yanlin, Liang Jing, Wu Jiayuan. Basic fibroblast growth factor promotes the proliferation of stem cells from the apical papilla through activation of Wnt/beta-Catenin signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2050-2055.

图/表（结果） 8

2.1 人根尖牙乳头干细胞的形态酶消化法得到原代人根尖牙乳头干细胞，培养3 d后发现细胞为旋涡状贴壁生长，见图1B，C。以有限稀释法对根尖牙乳头干细胞进行克隆化筛选纯化培养，3 d达到80%汇合，见图1D。

2.2 免疫荧光染色鉴定结果小鼠抗人波形丝单克隆抗体、小鼠抗人STRO-1多克隆抗体、小鼠抗人CD24多克隆抗体染色均呈阳性；兔抗人角蛋白多克隆抗体阴性，见图2。

2.3 成脂、成骨能力鉴定结果倒置显微镜下观察到细胞胞浆中空泡状的圆形脂滴显示为深红色，即油红O染色显示阳性，见图3A；细胞呈复层紧密分布，其周围及表面见大量矿化颗粒，茜素红染色显示为红褐色，见图3B。

2.4 CTNNB1、TCF1、TCF3和LEF1基因的表达 bFGF(15 μg/L)可上调根尖牙乳头干细胞中CTNNB1、TCF1、TCF3和LEF1基因的表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 CATENIN-BETA、TCF1、TCF3、LEF1蛋白表达水平 bFGF (15 μg/L)可上调根尖牙乳头干细胞中CATENIN-BETA、TCF1、TCF3和LEF1蛋白的表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 阻断Wnt信号通路后bFGF对根尖牙乳头干细胞增殖的影响
2.6.1 MTT法检测细胞增殖 3组细胞的生长随时间变化的情况大致相同，均呈上升趋势。加入阻断剂后，bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的增殖曲线斜率小于bFGF(15 μg/L)组。第1，3，5，7天，bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的细胞增殖能力均低于bFGF(15 μg/L)组(P < 0.05)。bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组与bFGF(-)组的细胞生长趋势在第5天后趋近一致。经统计得出，第1，3天，bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的细胞增殖能力高于bFGF(-)组 (P < 0.05)；第5，7天，阻断通路后bFGF促进细胞增殖的作用减弱(P < 0.05)，见图6。

2.6.2 EdU法检测细胞增殖能力 3组荧光染色图像见图7。荧光显微镜下可见3组细胞的细胞核呈红色，取相同放大倍数下的红色细胞核计数，选用3个视野下的细胞核数量计算平均值。如图8所示，bFGF(15 μg/L)组的阳性细胞数量高于bFGF(-)组(P < 0.05)；bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的阳性细胞数量低于bFGF(15 μg/L)组(P < 0.05)。

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引言

牙源性干细胞拥有优越的干细胞生物学特性，主要表现为较强的增殖和多向分化能力[1-3]。不同来源的牙源性干细胞增殖能力不同，根据细胞来源可将其分为：牙髓干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙周膜干细胞等[4]。与牙髓干细胞及牙周膜干细胞比较，根尖牙乳头干细胞拥有更强的再生、增殖分化能力[5-9]。根尖牙乳头干细胞的生物学性能受诸多外源性因素影响：无机三氧化聚合物、肿瘤坏死因子α都可在体外有效促进根尖牙乳头干细胞的增殖，诱导根尖牙乳头干细胞多向分化 [10-11]。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能与转化生长因子协同作用，结合相关受体，启动下游信号通路，促进细胞增殖、分化[12]。前期研究结果也显示，15 μg/L bFGF有显著促进根尖牙乳头干细胞增殖的能力，同时可使长时间培养的根尖牙乳头干细胞维持间充质干细胞的干性 [13-15]，但具体的机制不明确。
近年来大量研究发现，Wnt/β-Catenin信号通路在牙齿发育过程中发挥着重要作用，该通路通过影响成牙本质细胞、牙源性间充质细胞增殖、分化和极化，调控牙齿形态，包括数量、大小、位置、形状和组织形成[16-20]。CTNNB1基因编码的β-连环蛋白(Catenin beta-1，CATENIN-BETA)是Wnt信号通路中的一个重要分子，CATENIN-BETA被激活后进入细胞核内并与LEF/TCF作用，以激活经典Wnt/β-Catenin信号通路的方式调控细胞增殖等多项生物学活动，参与细胞信号转导[21-22]。研究显示，bFGF作用于成纤维细胞时，可以通过激活Wnt信号诱导其增殖[23]，但在bFGF作用于根尖牙乳头干细胞的研究中，其是否可以激活Wnt/β-Catenin信号通路，激活该通路后对根尖牙乳头干细胞的生物学活动有何种影响，尚不知晓。
此次研究通过检测bFGF作用于根尖牙乳头干细胞后Wnt/β-Catenin信号通路相关因子表达水平的变化，以及阻断Wnt/β-Catenin信号通路后bFGF对根尖牙乳头干细胞的增殖作用是否发生变化，以此为探讨bFGF对根尖牙乳头干细胞的作用机制提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计通过对比bFGF作用下，阻断Wnt/β-Catenin信号通路前后的根尖牙乳头干细胞增殖能力，探究bFGF的作用机制。
1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年3月在贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室及陕西省空军军医大学牙体牙髓病学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料该实验取得遵义医科大学附属口腔医院伦理委员会许可。材料取自该院颌面外科门诊16-22岁因正畸治疗拔除的根尖未成熟的健康第三磨牙(患者及监护人知情同意)。
1.3.2 实验试剂与仪器胎牛血清、α-MEM (HyClone，U.S)；小鼠抗人STRO-1单克隆抗体、小鼠抗人CD24多克隆抗体(R & D，U.S)；茜素红S、油红O、Wnt信号通路抑制剂Dkk-1 (Sigma，U.S)；荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa，JPN)；bFGF(Peprotech，U.S)；MTT(Alexis，U.S)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，JPN)；倒置相差显微镜(Leica，GER)；EdU细胞增殖成像检测试剂盒(Ribobio，CHA)；ECL化学发光底物、PVDF膜( Millipore，U.S)；小鼠抗人CATENIN-BETA单克隆抗体、兔抗人TCF3单克隆抗体、兔抗人LEF1多克隆抗体(Beyotime，CHA)；兔抗人TCF1/TCF7 (C63D9)单克隆抗体 (CST，U.S)。
1.4 实验方法

1.4.1 人根尖牙乳头干细胞的分离及克隆纯化培养以PBS(含100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)清洗根尖发育未成熟的健康第三磨牙，分离根尖牙乳头，见图1A，并剪碎置于α-MEM培养基中，加入Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化1 h后终止，接种于培养皿(35 mm)内，并加入α-MEM培养基(含体积分数为15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱，每两三天换液1次，细胞融合达80%时，加入0.25%胰蛋白酶消化处理后收集细胞并统计数量，以有限稀释法完成相关克隆纯化处理。

1.4.2 细胞免疫荧光技术鉴定根尖牙乳头干细胞表面分子选取第2代根尖牙乳头干细胞，制备细胞爬片；细胞融合达80%后以PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定，0.5% TrionX-100破膜，山羊血清封闭，加入一抗(小鼠抗人STRO-1；小鼠抗人CD24；兔抗人角蛋白)，二抗(PE标记的山羊抗鼠IgM；FITC标记的山羊抗鼠IgG；FITC标记的山羊抗兔IgG)，DAPI避光染色5 min，添加抗荧光淬灭剂并封固，激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.3 成骨成脂分化能力鉴定取第2代根尖牙乳头干细胞，以每孔2.5×105细胞数接种于6孔板，分别以成骨、成脂诱导液连续处理3周后进行茜素红染色、油红O染色，采集细胞染色图像。
1.4.4 RT-PCR检测CTNNB1、TCF1、TCF3和LEF1基因的表达取第2代根尖牙乳头干细胞，以每孔2.5×105细胞数接种于6孔板，设实验组(15 μg/L bFGF)与对照组(0 μg/L bFGF)，干预2 d后，依据细胞总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，-80 ℃低温保存。借助PCR扩增仪，以反转录反应液进行反转录反应，检测基因的表达。目的基因引物序列见表1。RT-PCR的反应体系为0.02 mL，见表2。

1.4.5 Western blot检测CATENIN-BETA、TCF1、TCF3 、LEF1蛋白的表达取第2代根尖牙乳头干细胞，以每孔2.5×105细胞数接种于6孔板，设实验组(15 μg/L bFGF)与对照组(0 μg/L bFGF)，干预2 d后，以预冷PBS清洗3遍，加入100 μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书的方法检测各样品蛋白质浓度，加入超纯水、5×Loading buffer将样品浓度调整至1 g/L，95 ℃处理5 min，行SDS-PAGE电泳后将蛋白转印至 PVDF 膜上，TBST清洗5 min，快速封闭液封闭20 min，TBST清洗3遍，每次10 min，以1∶1 000配制CATENIN-BETA、TCF1、TCF3 、LEF1一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗3遍，每次10 min，以1∶2 000配制对应种属的荧光二抗，常温孵育1 h，TBST清洗3遍，每次10 min，以ECL化学底物反应液浸泡约10 s，V3蛋白电泳成像系统对比CATENIN-BETA、TCF1、TCF3、LEF1蛋白的表达水平。
1.4.6 阻断Wnt信号通路对bFGF调控根尖牙乳头干细胞增殖的影响取第2代根尖牙乳头干细胞，以每孔2.5×105细胞数接种于6孔板，将其分为3组：①bFGF(15 μg/L)+Dkk-1组(10 μg/L)；②bFGF(-)组；③bFGF(15 μg/L)组。以α-MEM完全培养基培养24 h后更换无血清培养基继续培养24 h，按分组更换培养基，继续培养。在接种后第1，3，5，7天终止培养，加入0.02 mL的MTT溶液(5 g/L)，培养4 h，将原液倒掉，再加入0.15 mL二甲基亚砜，避光振荡10 min，使用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值。
在细胞培养第4天，根据文献[14]的方法对根尖牙乳头干细胞进行EdU染色，待反应结束，荧光显微镜观察。
1.5 主要观察指标 ①根尖牙乳头干细胞的形态；②根尖牙乳头干细胞的成脂、成骨分化能力；③根尖牙乳头干细胞在bFGF作用下Wnt/β-Catenin信号通路相关因子的表达水平；④阻断Wnt信号通路后bFGF对根尖牙乳头干细胞增殖的影响。
1.6 统计学分析以GraphPad Prism 8.0.2 软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用LSD-t 检验，检验水准α=0.05(双侧)。

讨论

根尖牙乳头干细胞作为间充质来源的牙源性干细胞，具有间充质干细胞的生物学特征，例如增殖能力强、成骨成脂分化能力等。间充质干细胞最常用的鉴定方法是细胞表面的免疫学表型。STRO-1为大家熟知的间充质干细胞表面特异标记物，其免疫荧光染色鉴定在根尖牙乳头干细胞中的阳性率高于牙髓干细胞[24]。虽然牙源性干细胞普遍缺乏特异性标记物，但根尖牙乳头干细胞的特征性表面分子CD24不在其他类别的牙源性干细胞中表达[25]。
β-Catenin是Wnt/β-Catenin信号通路的诸多信号转导因子中最为关键的一类[26-27]。研究发现，细胞的增殖活性在Wnt/β-Catenin信号通路被激活后得以增强[28]。脊椎动物基因组内通常分布着4个TCF/LEF家族转录基因，分别为TCF1、LEF1、TCF3与TCF4，其中TCF1和LEF1是Wnt信号通路的靶器官，参与Wnt信号通路的正反馈调控[29-33]，而TCF3主要作为一种转录抑制因子独立作用于CATENIN-BETA结构域。作为核心转导因子的CATENIN-BETA是检测Wnt/β-Catenin信号通路是否被激活的指标之一。实验以bFGF(15 μg/L)培养根尖牙乳头干细胞2 d后，采用RT-PCR及Western blot检测根尖牙乳头干细胞中CATENIN-BETA、TCF1、TCF3、LEF1 基因及蛋白的表达，与对照组相比，bFGF能够提高上述基因及蛋白的表达，说明bFGF作用于根尖牙乳头干细胞后通过表面受体及某种细胞内信号转导途径上调了经典分子β-Catenin及通路下游分子的表达，从而激活了Wnt/β-Catenin信号通路，促进根尖牙乳头干细胞增殖。
为了验证这一结果，通过Dkk-1阻断Wnt信号激活明确bFGF对根尖牙乳头干细胞的增殖效能。Dkk-1是Wnt/β-Catenin信号通路的一类经典阻滞剂。通过介导蛋白酶体CATENIN-BETA降解与细胞凋亡，抑制细胞增殖从而阻断通路 [34-37]。徐仑等[38]研究发现，在常规培养基条件下，Dkk-1对牙周膜干细胞的增殖没有明显的促进或抑制作用，但加入bFGF后牙周膜干细胞的增殖活性大幅减弱，这种现象可能是因添加bFGF前Wnt信号通路未激活所引起。该实验也观察到类似现象，抑制信号通路后，bFGF对根尖牙乳头干细胞促细胞增殖活性下降。由此可见，bFGF通过Wnt/β-Catenin信号通路调控根尖牙乳头干细胞增殖。
现今可通过多种方法来检测细胞生长增殖情况，如MTT法、BrdU法、EdU法等。相较于BrdU法，MTT法更能客观体现细胞的增殖情况[39]，而EdU检测形成的三唑环，可降低环境干扰，提高检测灵敏度[40]。
该实验以MTT及EdU法检测bFGF在Dkk-1作用下对根尖牙乳头干细胞增殖调控的影响，发现bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的细胞增殖能力低于bFGF(15 μg/L)组(P < 0.05)，说明bFGF诱导的Wnt信号被Dkk-1阻断。EdU检测显示：bFGF(15 μg/L)组的阳性细胞数量高于bFGF(-)组(P < 0.05)；bFGF(15 μg/L)+Dkk-1(10 μg/L)组的阳性细胞数低于bFGF(15 μg/L)组(P < 0.05)。该结果与MTT检测一致。如此可充分证实：阻断通路后，bFGF促进根尖牙乳头干细胞增殖的作用下降，表明bFGF是以激活Wnt/β- Catenin信号通路的方式对根尖牙乳头干细胞增殖进行调控。
该实验明确了bFGF通过提高CATENIN-BETA、TCF1、TCF3和LEF1 表达的方式激活Wnt/β-Catenin信号通路，调控根尖牙乳头干细胞的增殖。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

碱性成纤维细胞生长因子通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进根尖牙乳头干细胞的增殖

Basic fibroblast growth factor promotes the proliferation of stem cells from the apical papilla through activation of Wnt/beta-Catenin signaling pathway

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