2.1   香芹酚对2种细菌的MIC、MBC   A值变化小于0.05的即为MIC，细菌存活率降低大于99.9%的最小浓度即为MBC，从而得到香芹酚对2种细菌的MIC、MBC值，见表3。



2.2   抑菌圈实验结果   
2.2.1   香芹酚对金黄色葡萄球菌的抑菌性   金黄色葡萄球菌结果显示MIC、MBC组的抑菌圈直径大于0MIC组，MBC组抑菌圈直径大于MIC组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；提示香芹酚对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用，高浓度下抑菌效果更强，见表4及图1。








2.2.2   香芹酚对变形链球菌的抑菌性   变形链球菌结果显示：MIC、MBC组的抑菌圈直径大于0MIC组，且MBC组大于MIC组，差异有显著性意义(P < 0.05)；提示香芹酚对变形链球菌的生长有抑制作用，高浓度下抑菌效果更强，见表4及图2。



2.3   不同浓度香芹酚对细胞增殖情况的影响    CCK-8检测结果显示，1 d时测得A值与初始值无明显差异(P > 0.05)；4 d时与阴性对照组相比，香芹酚实验组1MIC、2MIC、3MIC组A值上升，细胞增殖能力明显增强；阳性对照0.12%氯己定组A值下降，细胞增殖能力减弱，差异有显著性有意义(P < 0.05)；7 d与4 d时相比，A值持续增长但相对较为缓慢；香芹酚浓度为1MIC时对细胞增殖的促进作用最为明显，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。



2.4   碱性磷酸酶活性测定   培养细胞1，7，14 d后碱性磷酸酶活性检测结果见图4所示。1 d时各实验组A值均无明显变化，差异无显著性意义(P > 0.05)。7 d时，与阴性对照组相比，1MIC、2MIC、3MIC组A值增大，碱性磷酸酶活性上升(P < 0.05)；阳性对照组A值减小，碱性磷酸酶活性下降。14 d时，1MIC、2MIC、3MIC组A值均明显增大，且1MIC组大于2MIC组，2MIC组大于3MIC组；阳性对照组A值相对减小，细胞碱性磷酸酶活性有所下降，以上结果均有显著性意义(P < 0.05)。



2.5   Runx2和骨保护素 mRNA 的表达水平   诱导培养7，14 d，各组 Runx2和骨保护素 mRNA 的表达水平相比差异有显著性意义，相关基因表达情况趋于一致。与阴性对照组相比，香芹酚各实验组Runx2、骨保护素 mRNA的表达明显上升，阳性对照组基因表达下降；其中1MIC组基因高表达现象最明显，且随着香芹酚浓度增高其对Runx2、骨保护素 mRNA表达的促进作用有一定程度的降低，以上差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5，6。

[1] 薛元泰,吴世芳,李义恒,等.8种精油对乳酸菌及致病菌的选择抑制性筛选及其应用研究[J].食品与发酵工业:1-11[2022-04-25]. [2] FACHINI-QUEIROZ FC, KUMMER R, ESTEVÃO-SILVA CF, et al. Effects of Thymol and Carvacrol, Constituents of Thymus vulgaris L. Essential Oil, on the Inflammatory Response. Evid Based Complement Alternat Med. 2012;2012:657026. [3] 许璐,喻毅,曹宇,等.牛至油及其主要成分的体外抑菌实验[J].世界中医药,2020,15(14):2072-2075. [4] BNYAN IA, ABID AT, OBIED HN. Antibacterial Activity of Carvacrol against Different Types of Bacteria. J Nat Sci Res. 2014;4(9):12-16. [5] ČABARKAPA IS, ŠKRINJAR MM, LEVIĆ JD, et al. Influence of thymol and carvacrol on initial cell attachment and biofilm of Candida albicans. Food Feed Res. 2015;42(1):23-30. [6] MILADI H, ZMANTAR T, KOUIDHI B, et al. Synergistic effect of eugenol, carvacrol, thymol, p-cymene and γ-terpinene on inhibition of drug resistance and biofilm formation of oral bacteria. Microb Pathog. 2017; 112:156-163. [7] KOUIDHI B, ZMANTAR T, HENTATI H, et al. Cell surface hydrophobicity, biofilm formation, adhesives properties and molecular detection of adhesins genes in Staphylococcus aureus associated to dental caries. Microb Pathog. 2010;49(1-2):14-22. [8] KOUKOS G, SAKELLARI D, ARSENAKIS M, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the oral cavity. Arch Oral Biol. 2015;60(9):1410-1415. [9] MERGHNI A, BEN NEJMA M, DALLEL I, et al. High potential of adhesion to biotic and abiotic surfaces by opportunistic Staphylococcus aureus strains isolated from orthodontic appliances. Microb Pathog. 2016; 91: 61-67. [10] CIANDRINI E, CAMPANA R, FEDERICI S, et al. In vitro activity of Carvacrol against titanium-adherent oral biofilms and planktonic cultures. Clin Oral Investig. 2014;18(8):2001-2013. [11] VERARDI G, CENCI MS, MASKE TT, et al. Antiseptics and microcosm biofilm formation on titanium surfaces. Braz Oral Res. 2016;30:S1806-83242016000100220. [12] VU AA, BOSE S. Natural Antibiotic Oregano in Hydroxyapatite-Coated Titanium Reduces Osteoclastic Bone Resorption for Orthopedic and Dental Applications. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52383-52392. [13] DEEPAK V, KASONGA A, KRUGER MC, et al. Carvacrol Inhibits Osteoclastogenesis and Negatively Regulates the Survival of Mature Osteoclasts. Biol Pharm Bull. 2016;39(7):1150-1158. [14] KUO PJ, HUNG TF, LIN CY, et al. Carvacrol Ameliorates Ligation-Induced Periodontitis in Rats. J Periodontol. 2017;88(7):e120-e128. [15] 邢承宇,王璐,陈星光,等.香芹酚-壳聚糖纳米颗粒的制备及抑菌活性研究[J].食品与发酵工业:1-10[2022-04-25].  [16] DE L GUIMARÃES LG, DA SILVA ML, REIS PC, et al. General Characteristics, Phytochemistry and Pharmacognosy of Lippia sidoides. Nat Prod Commun. 2015;10(11):1861-1867. [17] TUFEKCI E, CASAGRANDE ZA, LLNDAUER SJ, et al. Effectiveness of an essential oil mouthrinse in improving oral health in orthodontic patients. Angle Orthod. 2008;78:294-298. [18] LANA-RUIZ-CABELLO M, MAISANABA S, PUERTO M, et al. Evaluation of the mutagenicity and genotoxic potential of carvacrol and thymol using the Ames Salmonella test and alkaline, Endo III- and FPG-modified comet assays with the human cell line Caco-2. Food Chem Toxicol. 2014;72:122-128. [19] AMINI P, ARAUJO MW, WU MM, et al. Comparative antiplaque and antigingivitis efficacy of three antiseptic mouthrinses: a two week ran-domized clinical trial. Braz Oral Res. 2019;23:319-325. [20] GIANNELLI M, CHELLINI F, MARGHERI M, et al. Effect of chlorhexidine digluconate on different cell types: a molecular and ultrastructural investigation. Toxicol In Vitro. 2008;22(2):308-317. [21] RODRIGUEZ HERRERO E, BOON N, PAUWELS M, et al. Necrotrophic growth of periodontopathogens is a novel virulence factor in oral biofilms. Sci Rep. 2017;7(1):1107. [22] AHMAD A, KHAN A, AKHTAR F, et al. Fungicidal activity of thymol and carvacrol by disrupting ergosterol biosynthesis and membrane integrity against Candida. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011;30(1):41-50. [23] 甘盈盈,袁中伟,张天翼,等.香芹酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(USA300)抑菌机制的研究[J].四川农业大学学报,2019,37(2): 276-282. [24] BEN ARFA A, COMBES S, PREZIOSI-BELLOY L, et al. Antimicrobial activity of carvacrol related to its chemical structure. Lett Appl Microbiol. 2006;43(2):149-154. [25] MILADI H, ZMANTAR T, KOUIDHI B, et al. Use of carvacrol, thymol, and eugenol for biofilm eradication and resistance modifying susceptibility of Salmonella enterica serovar Typhimurium strains to nalidixic acid. Microb Pathoge. 2017;104:56-63. [26] 戴雨芸,李超,袁中伟,等.香芹酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成[J].微生物学通报,2020,47(3):813-820. [27] GARVEY MI, RAHMAN MM, GIBBONS S, et al. Medicinal plant extracts with efflux inhibitory activity against Gram-negative bacteria. Int J Antimicrob Agents. 2011;37(2):145-151. [28] CHOUHAN S, SHARMA K, GULERIA S. Antimicrobial Activity of Some Essential Oils-Present Status and Future Perspectives. Medicines (Basel, Switzerland). 2017;4(3):E58.

[1]	党 祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹 金, 熊 山, 张顶梅, 王 信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[3]	唐 亮, 李熙恒, 牛瑞娟, 李欣悦, 邹馨颖, 毛天骄, 李 江. 柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1205-1210.
[4]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[5]	徐星星, 文超举, 孟茂花, 王勤英, 陈镜桥, 董 强. 口腔种植中的碳纳米材料[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1062-1070.
[6]	唐昊天, 廖荣东, 田 京. 压电材料修复骨缺损的应用及设计思路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1117-1125.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨 毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐 亮, 李 江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[10]	袁 维, 刘静东, 徐广辉, 康 健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[11]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[12]	秦宇星, 任前贵, 李子龙, 全嘉星, 沈佩锋, 孙 韬, 王浩宇. 骨微血管内皮细胞在股骨头坏死中的作用机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 955-961.
[13]	张 敏, 张晓明, 刘童斌. 柚皮苷在骨组织再生领域的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 787-792.
[14]	张力宸, 陈 亮, 顾 勇. 无机离子仿生骨膜调控免疫微环境促进骨修复[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 346-353.
[15]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.

口腔病原菌对抗生素耐药性的上升和新疾病的出现迫切需要开发新型、有效的药物。天然药用植物可以为抗细菌、抗真菌和抗寄生虫化合物提供独特的可再生资源，是当前的研究热点之一[1]。香芹酚(2-甲基-5-异丙基苯酚)是一种单萜类化合物，常见于牛至、百里香和其他植物中的精油成分[2]，该化合物具有广泛的生物活性，包括抗菌、 抗真菌、抗病毒、抗氧化及抗癌特性，可以对抗多种细菌、真菌和病毒，包括许多革兰阳性菌和革兰阴性菌等，如金黄色葡萄球菌[3]、大肠杆菌、表皮葡萄球菌[4]、变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌等；还有白色念珠菌[5]、铜绿假单胞菌等真菌。此外，香芹酚的低细胞毒性使其很早就作为防腐剂、抗菌剂添加到食品、保健品中，并应用于口腔疾病的防治过程中，添加其成分的漱口水、牙科封闭剂、水门汀、凝胶、甘油等药物可以用来治疗牙本质敏感、牙周炎、牙髓炎等口腔常见疾病[6]。

变形链球菌和金黄色葡萄球菌是许多口腔常见疾病(如龋病、牙周病、颌骨骨髓炎等)的主要致病菌[7-8]。金黄色葡萄球菌是医用植入物相关的最常见的人类病原体之一，研究表明香芹酚在低浓度下即对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用[9]。CIANDRINI等[10]证实了香芹酚对种植体周围炎相关致病菌变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌的优越的抑菌性，测得其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)值分别为0.25%及0.5%；在钛片上预成生物膜进行体外实验，与氯己定相比，香芹酚对钛附着的生物膜表现出更强的形成预防作用，证明香芹酚可减少钛种植体表面的细菌生长，有利于牙周疾病的预防和治疗。VERARDI等[11]表明香芹酚对口腔角质细胞无明显毒性作用，香芹酚对单种细菌生物膜(血链球菌、变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等)的形成均表现出抑制作用；还说明香芹酚在低浓度下可以抑制羟基磷灰石和钛表面上单种和多种生物膜中的种植体周围炎的病原体。VU等[12]经实验证明在特定条件下，香芹酚在聚己内酯/聚乙二醇、羟基磷灰石涂层中均可以完全释放，且可使破骨细胞活性显著降低，说明香芹酚不仅可以防感染，还能够支持骨愈合，增加翻瓣或种植手术的成功率。DEEPAK等[13]发现香芹酚能以剂量依赖的方式下调核因子κB受体活化因子配体，抑制核因子κB信号通路的活化；抑制脂多糖的产生，从而阻止核因子κB受体活化因子配体和脂多糖诱导的破骨细胞形成；同时香芹酚还可通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3诱导成熟破骨细胞凋亡，说明香芹酚对破骨细胞有明显抑制作用，有利于加速骨组织修复。KUO等[14]也进行了相关的动物实验，给牙周病小鼠灌胃给予香芹酚，经检测发现，香芹酚可减少牙周炎引起的组织损伤和骨丢失，提示香芹酚可通过下调促炎递质和基质金属蛋白酶9的表达来减轻组织的破坏。有研究指出香芹酚质量浓度在3-15 mg/L时处理MC3T3-E1细胞不影响其在增殖条件下的活力[14]。

此次实验依据香芹酚广泛的抗菌活性、低耐药性、低毒性以及其有利于成骨的特点进行实验，测定了香芹酚对变形链球菌、金黄色葡萄球菌2种口腔常见病原菌的MIC和MBC，并进一步研究MIC下的香芹酚对MC3T3-E1细胞增殖及分化的影响，以期将香芹酚作为一种抗菌、消炎、促进成骨的有效成分投入口腔常见疾病的防治当中，为临床诊疗提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   药物干预细胞培养实验，数据比较采用t检验和方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年10月至2021年12月在滨州医学院附属医院生物实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细菌与细胞  变异链球菌UA159、金黄色葡萄球菌ATCC25923，于中国农业微生物菌种保藏管理中心订购；MC3T3-E1细胞(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)于上海拜力生物科技有限公司订购。实验方案经滨州医学院附属医院伦理委员会批准，实验过程遵循了本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂   香芹酚、氯己定、α-MEM培养基(美国Sigma-Aldrich 公司)；脑心浸出液肉汤、营养肉汤、琼脂粉(青岛海博)；PBS、DMSO、双抗(索莱宝)；CCK-8试剂盒、碱性磷酸酶试剂盒(碧云天)；EvoM-MLV反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(中国艾科瑞)。
1.3.3   主要设备仪器   CO2恒温培养箱、-80 ℃超低温冰箱(Thermo公司)；酶标仪、荧光实时定量PCR仪、酶联免疫检测仪(美国MolecuLar Devices)；厌氧产气袋、培养袋(日本三菱)；细菌浊度仪(上海雷磁)；高速离心机、移液枪(Eppendorf公司)；电子天平、光学显微镜(德国莱卡)；超净工作台(安泰空气技术有限公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   细菌悬液及实验试剂的制备   将冻存的变异链球菌UA159、金黄色葡萄球菌ATCC25923标准株取出恢复至室温，采用三区画线法分别接种于脑心浸出液肉汤、营养肉汤培养皿。置于37 ℃恒温培养箱内进行厌氧/有氧培养48 h。用灭菌接种环取适量金黄色葡萄球菌、变形链球菌菌落分别置于脑心浸出液肉汤、营养肉汤液体培养基中，制得麦氏浊度为0.5 mcf的2种细菌悬液备用。用2%的DMSO稀释香芹酚，制成浓度为6.4%的香芹酚溶液。
1.4.2   吸光度(A值)法测定MIC、MBC值   将金黄色葡萄球菌、变形链球菌细菌悬液分别置于不同的96孔板中，每孔100 μL。采用2倍稀释法将浓度为6.4%的香芹酚稀释到96孔板中，使孔板内香芹酚的浓度呈2倍递减，即每孔中香芹酚浓度为6.4%，3.2%，1.6%，0.8%，0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.025%及0.012%；设置阴性对照组0浓度的香芹酚溶液，设置阳性对照组0.12%氯己定溶液。制备完成使用酶标仪
(450 nm)检测初始A值。将96孔板放入37 ℃恒温培养箱中分别进行厌氧/有氧培养24 h后复测并记录A值，A值变动在0.05以内的最小浓度值即为MIC；计数大于MIC浓度的细菌，存活数降低大于99.9%的最低浓度为MBC值。
1.4.3   抑菌圈实验   共设置3个实验组：MIC组、MBC组和0MIC组(阴性对照组)。采用K-B法即滤纸片法选用质地均匀的滤纸，用直径为0.6 mm的打孔器打成直径相同的小圆片，高温灭菌后烘干，浸泡于金黄色葡萄球菌细菌悬液中，用灭菌镊子将其分别放置于脑心浸出液肉汤固体培养皿上；再吸取20 μL相应浓度的香芹酚，滴至滤纸片上，放入2.5 L厌氧培养袋内，37 ℃恒温培养箱培养48 h，观察抑菌圈的直径大小。变形链球菌组同理。
1.4.4   MC3T3-E1细胞的培养及试剂配制   无菌条件下复苏细胞，α-MEM完全培养基中加入体积分数10%胎牛血清和1%双抗，在含有体积分数5%CO2和95%空气的恒温培养箱中培养，每2 d换1次液，待细胞培养至80%-90%时传代。共设置5个分组：1MIC、2MIC、3MIC组为含0.2%，0.4%，0.6%香芹酚的完全培养基；阳性对照组为含0.12%氯己定的完全培养基；阴性对照组为完全培养基。
1.4.5   细胞增殖能力检测   将MC3T3-E1细胞培养1，4，7 d后，在避光条件下进行CCK-8检测，吸出原培养液，PBS冲洗2遍，配制CCK-8混合液(试剂与完全培养基比例为1∶9)，快速于每孔中加入100 μL CCK-8混合液，培养箱孵育1 h。各孔细胞浓度为3×1010 L-1，每孔细胞悬液100 μL，最后将96孔板放入酶标仪中测定450 nm波长下的A值。

1.4.6   碱性磷酸酶活性测定   先配制成骨诱导液(在α-MEM培养基中加入体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C和1×10-8 mol/L地塞米松)，混匀避光4℃保存。将生长密度达90%的细胞消化后依照5组，每组4个复孔铺板(各孔细胞浓度为3×1010 L-1)，标记培养24 h细胞贴壁后按照以下分组更换含不同药物成分的成骨诱导液：1MIC、2MIC、3MIC组加入含0.2%，0.4%，0.6%香芹酚的成骨诱导液；阳性对照组加入含0.12%氯己定的成骨诱导液；阴性对照组单纯加入成骨诱导液。细胞培养1，7，14 d后，用PBS冲洗，胰酶消化后，每孔加入200 μL细胞裂解液，轻柔吹匀后转移至4 ℃冰箱里备用。高速离心机预冷至4 ℃，把细胞转移至EP管，12 000 r/min，离心5 min，吸出EP管上层清亮液体接种于96孔板，恒温箱孵育30 min后按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行相关操作，最后利于酶标仪检测各孔405 nm波长处的A值。
1.4.7   荧光实时定量PCR检测   成骨诱导培养MC3T3-E1细胞1，7，14 d后(具体方法同1.4.6)，采用trizol法提取RNA，静置10 min后离心，4 ℃，12 000 r/min，10 min。离心后，收集EP管底的RNA，反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测Runx2、骨保护素的mRNA表达水平，PCR引物序列见表1。选择20 μL反应体系见表2。反应条件为：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

1.5   主要观察指标   不同浓度的香芹酚对金黄色葡萄球菌、变形链球菌的抑菌活性，各实验组MC3T3-E1细胞的增殖分化及成骨情况。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。采用 SPSS 21.0 软件进行统计学分析，数据采用x±s表示。组间差异比较采用单因素方差分析，各实验组组间两两比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

香芹酚是天然植物的提取物，具有广谱抗菌活性、无细胞毒性、利于成骨等特点，是近年来抗生素类药物替代物的研究热点之一。香芹酚易于与纳米材料结合，这为防治细菌生物膜感染、修复骨组织缺损提供了新的机会和思路[15]。已有大量研究表明香芹酚对金黄色葡萄球菌、变形链球菌有明显的抑制作用，CIANDRINI等[10]测定香芹酚对变形链球菌、具核梭杆菌的MIC和MBC值，分别为0.25%和0.50%，肯定了其对这2种细菌有良好的抑制活性。有学者证明了香芹酚对口腔常见致病菌变形链球菌、血链球菌和白色念珠菌的抗菌活性，其中变形链球菌对其敏感度最高[16]。BNYAN等[4]发现香芹酚对革兰阳性菌有很高的抑制作用，低浓度下也可有效抑制和杀灭金黄色葡萄球菌。MILADI等[6]检测出了香芹酚对变形链球菌的MIC、MBC值为64，128 mg/L；通过体外实验观察到了香芹酚可以有效抑制和清除牙釉质表面的菌斑生物膜，说明其不仅能有效抑制浮游状态下变形链球菌的生长繁殖还能控制变形链球菌生物膜的形成。另一方面，关于香芹酚的毒性与安全性，美国食品和药品管理局(FDA)早将香芹酚归类为GRAS，认证了香芹酚的安全性并作为抗菌剂、防腐剂添加到食品当中[17]。经LANA-RUIZ-CABELLO等[18]证实，它对小鼠成纤维细胞、人肝细胞、人淋巴细胞和口腔上皮细胞无毒性影响[19]。GIANNELLI等[20]提出香芹酚不仅抗菌性能优异，还具有促进成骨的特性。氯己定在成骨细胞、成纤维细胞中具有高度细胞毒性。

氯己定是治疗牙周炎、种植体周围炎的临床常用抗菌药物，可以抑制口内细菌生长，但经常使用此种抗生素会产生很多副反应和细菌耐药性，如牙齿变色、味觉改变等[21]。AHMAD等[22]证实了香芹酚对口腔上皮细胞活力无明显影响，而氯己定则表现出较强的细胞毒性作用。与许多现有抗生素(如氯己定)相比，天然植物来源的香芹酚对细胞的毒性作用要小的多。虽然氯己定已被广泛用于口腔疾病的治疗，但目前的研究显示氯己定会对人口腔角质形成细胞造成损害。

为了确定香芹酚作为治疗口腔常见疾病的抗菌药物成分的潜力及安全性，此次实验首先根据CLSI的抗微生物药物敏感性试验操作方法和标准判断，利用A值法测定其对金黄色葡萄球菌、变形链球菌的MIC和MBC，然后在此基础上进行抑菌圈实验，以评估香芹酚的抗菌能力。再选取2种菌中较高的MIC值即香芹酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度0.2%，设置对照实验；采用CCK-8、碱性磷酸酶和实时荧光定量PCR试剂盒检测不同浓度下的香芹酚对MT3T3-E1细胞增殖的影响，评估其是否能促进MT3T3-E1细胞增殖及是否存在细胞毒性作用。

细胞实验阴性对照组中，由于未加任何药物，细菌生长繁殖未受影响，细菌数量增多，孔板内观察相应孔内呈浑浊状态，A值偏大，差异无显著性意义(P > 0.05)；其余实验组内细菌生长繁殖皆受抑制，孔内呈清亮状态，A值相应减小，差异有显著性意义(P < 0.05)。此次实验选择K-B法测得香芹酚在MIC下对金黄色葡萄球菌、变形链球菌均有明显的抑菌性，并且其抑菌强度与浓度梯度成正比；检测出香芹酚对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC值分别为0.2%及0.6%，对变形链球菌的MIC、MBC值分别为0.04%及0.12%，说明香芹酚在低浓度下即可有效抑制金黄色葡萄球菌、变形链球菌的生长，这是因为香芹酚的抗菌性能并不是单一的机制，而是在细胞水平上的多个作用位点协同或叠加的发挥作用。最常见的抑菌机制是细胞膜破裂学说[23]，香芹酚由于其疏水性质可整合深入细胞膜，在膜的脂肪链中积累，导致膜脂双分子层构象的变化，破坏和干扰细胞膜的正常功能；香芹酚羟基和离域电子系统(双键)的存在使其可充当质子交换剂，降低了细胞膜梯度，导致ATP渗透性增加，进而导致细胞死亡[24]。MILADI等[25]用香芹酚处理鼠伤寒沙门氏菌，扫描电镜显示细菌膜被破坏，膜的完整性完全丧失。决定香芹酚抑菌效果的其他因素包括膜表面的净电荷、膜的脂质成分及脂多糖的浓度。关于香芹酚对金黄色葡萄球菌生物膜的作用机制，戴雨芸等[26]发现香芹酚对金黄色葡萄球菌ATCC 25923生物被膜的抑制和清除作用显著，其作用机制主要是通过降低细菌生物膜icaA、sarA和cidA基因转录水平，抑制细胞间多糖黏附素合成和胞外DNA的释放。有关该实验结果的相关研究表述，香芹酚对革兰阳性菌比革兰阴性菌更有效，原因是革兰阴性菌有一层坚硬的富含脂多糖等物质的复杂外膜，它限制了疏水化合物的膜外扩散[27]；而革兰阳性菌没有外膜，仅被一层肽聚糖壁包裹，其密度不足以抵抗小的抗菌分子，使其易于进入细胞膜[28]。因此可以总结：相同浓度下的香芹酚对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌性较革兰阴性菌变形链球菌强。

此次实验将MC3T3-E1细胞在不同香芹酚浓度下培养1，4，7 d后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的情况，结果表明4 d时与阴性对照组相比，香芹酚1MIC、2MIC、3MIC组细胞增殖能力明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)；在7 d时，细胞增殖能力持续上升，但相比于4 d时增长速度变缓慢；阳性对照氯己定组显示细胞增殖能力有所下降；4，7 d时促进细胞增殖效果最显著的都是1MIC组，差异有显著性意义(P < 0.05)；但随着香芹酚浓度增加，促进作用降低，提示高浓度下的香芹酚溶液可能会对成骨细胞的增殖产生抑制作用，需要后续实验进行验证；CCK-8结果表明，香芹酚在一定浓度范围内能促进细胞增殖。

碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一，它的活性测定可以检测MC3T3-E1细胞分化水平。此次实验通过检测1，7，14 d每个实验组中的碱性磷酸酶活性，反映不同香芹酚浓度下对细胞增殖的影响，结果显示香芹酚可以提升细胞碱性磷酸酶活性，1MIC组效果最显著；且随香芹酚浓度增加，促进作用有所减小，提示随着香芹酚浓度增加可能会对细胞增殖产生抑制作用；14 d时实验组相比于阴性对照组效果更明显。由此可知，一定浓度下的香芹酚能够提升MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性从而促进其增殖，0.12%氯己定会使细胞碱性磷酸酶活性降低，抑制细胞的增殖分化。

此次实验采用定量PCR检测Runx2和骨保护素 mRNA表达水平，可以反映骨形成、骨代谢的能力。Runx2的表达是成骨细胞分化的开始，它可以启动和激活骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，同时还能上调许多其他成骨基因的表达，对于成骨细胞的增殖分化至关重要。骨保护素大量存在于成骨细胞中，又被称为破骨细胞抑制因子，可以反映成骨情况，骨保护素的表达量升高，表示成骨活性增强。Runx2和骨保护素的mRNA 的表达水平在诱导培养7，14 d后各组间具有差异性；MC3T3-E1细胞在不同香芹酚浓度下，Runx2、骨保护素基因表达水平高于阴性对照组，各组表达量呈1MIC > 2MIC > 3MIC > 0MIC(阴性对照组)>阳性对照组，说明一定浓度范围内的香芹酚可以上调成骨相关基因的表达，促进成骨细胞增殖。

通过此次实验结果确定香芹酚对MC3T3-E1细胞无明显毒性影响，还能够促进其增殖，提高成骨活性。关于此结果有研究指出香芹酚浓度在3-15 mg/L时处理MC3T3-E1细胞不影响其在增值条件下的活力，但是修复骨组织缺损不仅与成骨细胞的成骨活性有关，和破骨细胞的骨吸收也密切相关。DEEPAK等[13]发现香芹酚能以剂量依赖的方式下调核因子κB受体活化因子配体，抑制核因子κB信号通路的活化；抑制脂多糖的产生，从而阻止核因子κB受体活化因子配体和脂多糖诱导的破骨细胞形成。同时香芹酚还可通过激活蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3诱导成熟破骨细胞凋亡，说明香芹酚对破骨细胞有明显的抑制作用，有利于加速骨组织修复。经CABELLO等[18]证实，它对小鼠成纤维细胞、人肝细胞、人淋巴细胞和口腔上皮细胞无毒性影响。为了进一步确定香芹酚在骨组织工程方面的利用价值，VU等[12]通过等离子喷涂羟基磷灰石修饰Ti6Al4V涂层表面模拟种植体形态，测试在不同环境下(PBS/醋酸缓冲溶液)对成骨细胞、破骨细胞的影响及其在靶向给药系统中的表现；实验结果证明，香芹酚在羟基磷灰石涂层中可完全释放，在聚己内酯/聚乙二醇膜中可以减少突发释放，达到一定的缓释效果；发现香芹酚在醋酸缓冲液中的释放量比在PBS和碱性缓冲液中的释放量更高，提示酸性环境下可能更利于香芹酚发挥其特性；另外还确定香芹酚对人类成骨细胞无毒，可引起破骨细胞坏死从而抑制骨吸收，有利于骨组织愈合。以上研究成果与此次实验的研究结果趋于一致，都提示或可将香芹酚的抗菌、促成骨特性利用起来，作为有效成分添加到引导骨再生膜、骨粉、种植体表面涂层、抗菌凝胶或抗生素药物中，降低种植手术的感染风险，提高种植手术的成功率，有效抑制口腔相关致病菌，防治种植体周围疾病及修复骨组织缺损。

研究的局限性：此次实验中仅检测了香芹酚对于单一浮游状态的变形链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，而龋病、牙周炎、种植体周围炎等口腔常见疾病的主要致病因素是复杂的多种细菌构成的菌斑生物膜，实验具有一定的局限性。此外，各项细胞实验结果均指示香芹酚在最小抑菌浓度0.2%下对MC3T3-E1细胞无明显毒性影响，且可促进成骨细胞增殖，但随着药物浓度的增加，促进作用减弱，这提示高浓度的香芹酚或许会对细胞产生毒性作用，需要增加药物浓度梯度范围完善实验考证此问题。

实验结果表明，香芹酚能够有效抑制口腔常见致病菌变形链球菌和金黄色葡萄球菌的体外生长繁殖，并且可以促进MC3T3-E1细胞增殖分化，有利于骨组织愈合。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
香芹酚：为单萜类化合物，常见于牛至、百里香和其他植物中，是一种耐药性低、抗菌活性强并且有助于骨愈合的天然抗菌成分。可加入生物膜、漱口水、水门汀等材料中应用于临床口腔常见疾病的治疗。
抗菌活性：指抗菌药抑制或杀灭病原菌微生物的能力，可用体外抑菌实验和体内实验治疗法测定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

香芹酚(2-甲基-5-异丙基苯酚)是一种单萜类化合物，常见于牛至、百里香和其他植物中的精油成分，该化合物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗真菌、病毒、抗氧化及抗癌特性。此外，香芹酚的低细胞毒性使其很早就作为防腐剂、抗菌剂添加到食品、保健品中，并应用于口腔疾病的防治过程中。此次实验依据香芹酚广泛的抗菌活性、低耐药性、低毒性以及其有利于成骨的特点进行实验，测定了香芹酚对变形链球菌、金黄色葡萄球菌2种口腔常见病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，并进一步研究最小抑菌浓度下的香芹酚对MC3T3-E1细胞增殖及分化的影响，以期将香芹酚作为一种抗菌、消炎、促进成骨的有效成分投入口腔常见疾病的防治当中，为临床诊疗提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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