牙龈间充质干细胞体外可向成骨、成脂方向分化，如图1C所示，牙龈间充质干细胞体外进行成骨诱导21 d后可形成矿化结节，提示牙龈间充质干细胞具有成骨分化潜力。如图1D所示，牙龈间充质干细胞体外进行成脂分化28 d后，经油红O染色可见红色脂滴形成,提示牙龈间充质干细胞具有成脂分化潜力。取1×103个状态良好的第2代牙龈间充质干细胞接种于100 mm培养皿中，如图1E所示，培养10 d后染色可见细胞散布于培养皿底部呈克隆样生长，如图1F所示，光镜下可见细胞呈漩涡状生长，克隆形成率约为43%。



2.2   口腔溃疡建模情况   口腔溃疡造模后24 h进行拍照，观察可见创面呈现黄白色假膜，凹陷状，创面周围黏膜红肿，见图2A，大鼠进食较正常减少。苏木精-伊红染色显示相对于正常黏膜，溃疡形成后正常口腔黏膜上皮层连续性中断，溃疡深达肌层，溃疡处及周围炎细胞浸润，见图2B，C，显示溃疡造模成功。通过大体照相及苏木精-伊红染色确定该机械联合化学法可成功进行口腔颊黏膜溃疡造模。



2.3   口腔溃疡自然愈合过程    造模后第1天即可验证口腔造模成功，溃疡周围被覆薄层黄色假膜，溃疡组连续观察7 d，可见第3天溃疡炎症反应最重，渗出最重，黄色假膜最厚，溃疡凹陷最明显，溃疡周围黏膜红肿最明显，第7天可见溃疡呈现愈合趋势，周围黏膜红肿情况减轻，溃疡面积明显缩小，但大体观察仍然可见溃疡创面，尚未完全愈合，见图3。



2.4   大体观察牙龈间充质干细胞促进口腔溃疡的愈合   造模后第2天注射牙龈间充质干细胞，造模后第3天，大体观察可见牙龈间充质干细胞组形成的溃疡凹陷较溃疡组小，且周围黏膜红肿情况较轻，提示溃疡组的炎症反应强于牙龈间充质干细胞组，造模后第7天，牙龈间充质干细胞组溃疡创面已基本愈合，与周围正常黏膜差异不明显，见图4A。统计图显示，牙龈间充质干细胞组溃疡面积在第3，7天均小于溃疡组，且差异有显著性意义，见图4B。



2.5   组织学观察牙龈间充质干细胞促进口腔溃疡的愈合   苏木精-伊红染色与Masson染色可见与大体观察结果类似，苏木精-伊红染色可见造模后第3天牙龈间充质干细胞组炎细胞浸润较溃疡组减少，第7天溃疡处可见薄层上皮形成，而溃疡组尚未见上皮组织修复，见图5A；Masson染色可见造模后第3天牙龈间充质干细胞组已开始有胶原纤维修复，而溃疡组尚未见明显胶原纤维修复，造模后第7天牙龈间充质干细胞组较溃疡组胶原形成较粗大，排列更加规则，见图5B。



2.6   组织相容性   术后未发生与植入细胞相关的不良反应。

在口腔表现为溃疡的疾病有很多，可因局部刺激或全身疾病引起。引起口腔溃疡的全身性疾病包括：胃肠疾病、克罗恩病及相关疾病、溃疡性结肠炎、恶性肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、放射等[1-2]。创伤是口腔黏膜溃疡最常见的原因[3]。创伤性溃疡可能是由于物理、化学或机械性局部刺激所致，口腔黏膜屏障功能被破坏，表现为溃疡处剧烈疼痛、感染风险增加、口腔和咽部功能受损，甚至影响了生活质量[2]。

口腔颌面部组织存在丰富的牙源性间充质干细胞，比如牙周膜干细胞、牙髓干细胞、牙龈间充质干细胞、脱落乳牙干细胞、牙囊干细胞、根间乳头干细胞等[4]。牙龈间充质干细胞是从牙龈组织中分离得到的干细胞或祖细胞，显示良好的组织再生修复能力[5-7]。与其他间充质干细胞相比，牙龈间充质干细胞数量丰富且易于获得[8]。此外，牙龈间充质干细胞相较于骨髓间充质干细胞具有较强的增殖能力，并且形态上更为稳定。更为重要的是，牙龈间充质干细胞显示出良好的组织再生潜力和免疫调节特性[8-9]。KANDALAM等[10]将成骨诱导后的牙龈间充质干细胞与自组装水凝胶支架PuraMatrix (PM)和/或骨形态发生蛋白2植入上颌牙槽骨缺损，术后4，8周时骨再生显著增强。牙龈间充质干细胞可通过促进巨噬细胞向M2型极化，加速伤口愈合[11]。

大量研究表明间充质干细胞具有促进皮肤创伤愈合的作用[12-15]。EL-MENOUFY等[16]已将骨髓间充质干细胞运用于口腔溃疡治疗中，并取得了良好的治疗效果。而口腔内牙龈间充质干细胞对口腔溃疡是否具有潜在的治疗作用尚未见明确报道。

该实验应用机械联合化学法建立创伤性口腔溃疡大鼠模型，通过局部注射人来源牙龈间充质干细胞，探讨人来源牙龈间充质干细胞对创伤性口腔溃疡的治疗作用，观察溃疡愈合情况，为后续机制研究提供前期实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   细胞培养，随机对照动物实验，两组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年1-12月在河北医科大学口腔医学院河北省口腔医学重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验试剂和仪器   α-MEM(BI，中国)；胎牛血清(Gibco，美国)；胰酶(Gibco，美国)；青链霉素混合液(Gibco，美国)；谷氨酰胺(Gibco，美国)；PBS(Hyclone，中国)；茜素红染色试剂盒(GenMed Scientifics，美国)；6孔板(Costar，美国)；培养皿(Corning，美国)；二甲苯、透明剂、苏木素染液、伊红染液(Baso，中国)；甲苯胺蓝染液(索莱宝，中国)；Masson染色试剂盒(索莱宝，中国)；15，50 mL离心管(Corning，美国)；大型低温冷冻离心机(Eppendorf，德国)；生物安全柜(NUAIRE，美国)；烘片机(Leica，美国)；二氧化碳细胞培养箱(Thermos，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；皮肤活检打孔器(直径5 mm，工旺，中国)。
1.3.2   实验动物   8-10周龄雄性SD大鼠21只，清洁级，体质量250-300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0011。将21只SD大鼠随机分成溃疡组(n=11)和牙龈间充质干细胞组(n=10)。所有动物操作程序均根据国家相关实验动物使用准则施行，并获得河北医科大学口腔医院医学伦理委员会批准，伦理批准号【2020】037。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   牙龈间充质干细胞分离与培养   牙龈组织来源于河北医科大学口腔医院智齿拔除患者(年龄14-20岁)，患者拔除的智齿无龋坏，既往体健，无牙周炎、糖尿病、高血压、传染病。取得牙龈组织前均先获得患者知情同意并签署知情同意书，未满18岁患者同时获得其监护人同意，其监护人同样签署知情同意书。

取牙龈组织后立即放入含2%青链霉素混合液的α-MEM培养基中，半小时内转运至超净工作台进行后续操作。将牙龈组织置于超净工作台中，用含2%青链霉素混合液的PBS反复冲洗，至少10次。去除上皮组织，将组织块剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，加入3 g/LⅠ型胶原酶5 mL，37 ℃水浴消化15 min，1 000 r/min离心3 min，弃上清，PBS冲洗2次，弃上清。将消化后的组织块转移至6孔板中，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素混合液、1%谷氨酰胺、α-MEM的完全培养基2.5 mL，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中进行培养，待细胞融合至80%左右即开始传代培养。第2-5代细胞用于后续实验。

1.4.2   牙龈间充质干细胞体外成骨诱导   取5×104个第3代牙龈间充质干细胞，接种于6孔板中，培养基为成骨诱导培养基(α-MEM完全培养基+100 mg/L抗坏血酸+2 mmol/L β甘油磷酸钠+10-8 mol/L地塞米松)，成骨诱导21 d后，弃上清，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定15 min，采用茜素红染色试剂盒进行茜素红染色，倒置显微镜下观察。
1.4.3   牙龈间充质干细胞体外成脂诱导   取1×105个第3代牙龈间充质干细胞，接种于6孔板中，培养基为成脂诱导培养基(α-MEM完全培养基+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+100 μmol/L吲哚美辛+1 mg/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松)，成脂诱导28 d后，弃上清，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定15 min，采用油红O染色试剂盒进行油红O染色，倒置显微镜下观察。
1.4.4   克隆形成实验   取1×103个细胞状态良好的第2代牙龈间充质干细胞，制成单细胞悬液，接种于100 mm培养皿中，培养基为含体积分数为15%胎牛血清、1%青链霉素混合液、1%谷氨酰胺的α-MEM完全培养基10 mL，每3 d换液1次，培养10 d后，弃培养基，PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛室温下固定15 min，采用甲苯胺蓝染液染色20 min，于观片灯下拍摄大体照，并于光镜下观察并拍照。细胞克隆大于50个细胞则记为1个克隆，计算克隆形成率。
1.4.5   口腔溃疡动物造模   选用21只8-10周龄SD雄性大鼠，于实验室适应性饲养3 d。采用2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，使用5 mm直径的皮肤活检打孔器于SD大鼠颊黏膜进行口腔溃疡造模，创面使用含饱和甲醛甲酚滤纸覆盖1 min，造模后1 d拍照，观察口腔溃疡是否形成，麻醉后处死1只大鼠，取溃疡侧颊黏膜(包括至少1 mm正常黏膜组织)，依次对取样组织进行固定、包埋、切片，进行苏木精-伊红染色观察溃疡形成情况。

将已进行溃疡造模后的大鼠随机分为2组，每组10只，分别为溃疡组、牙龈间充质干细胞组。溃疡造模当天记为第0天，于造模第2天进行牙龈间充质干细胞注射，采用5点注射法进行细胞注射(5点注射法即注射点为溃疡中心及溃疡四周共5点，以达到分散注射的目的)，每只大鼠细胞注射总量为1×106，细胞离散于200 μL PBS中，注射深度为2 mm。溃疡组注射等量PBS，注射条件及注射方法与牙龈间充质干细胞组一致。牙龈间充质干细胞注射方法及注射细胞量详见参考文献[16-19]。造模第3，7天处死大鼠，每个时间点每组各处死5只大鼠。取溃疡侧及健康侧颊黏膜(溃疡侧颊黏膜包括至少1 mm正常黏膜组织)，依次对取样组织进行固定、包埋、切片厚度为4 μm，进行苏木精-伊红染色观察溃疡愈合情况。
1.4.6   苏木精-伊红染色   ①脱蜡复水：石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ 12 min、二甲苯Ⅱ 2 min、无水乙醇2 min、体积分数为95%乙醇溶液2 min、体积分数为80%乙醇溶液2 min、体积分数为70%乙醇溶液2 min、双蒸水2 min；②染色：切片依次进行以下步骤：苏木精染液6 min、双蒸水冲洗、1%盐酸-乙醇分化液分化30 s、双蒸水浸泡10 min、伊红染液复染15 s、双蒸水浸泡5 min；③脱水：切片依次放入以下溶液中：体积分数为70%乙醇溶液1 min、体积分数为80%乙醇溶液1 min、体积分数为95%乙醇溶液1 min、无水乙醇1 min、透明剂2 min；④封固：去除切片多余水分，在切片干燥前，滴加中性树胶，盖玻片封固。封固后光镜下观察溃疡整体愈合及上皮形成情况。
1.4.7   Masson染色   ①脱蜡：石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ12 min、二甲苯Ⅱ 2 min、无水乙醇 2 min、体积分数为95%乙醇溶液 2 min、体积分数为80%乙醇溶液 2 min、体积分数为70%乙醇溶液 2 min、蒸馏水2 min；②weigert铁苏木素染色5-10 min，酸性乙醇分化液分化30 s、水洗；③Masson蓝化液返蓝30 s、水洗，蒸馏水洗1 min；④丽春红品红染色液5-10 min，弱酸工作液(蒸馏水∶弱酸=2∶1)1 min；⑤磷钼酸1 min，弱酸工作液(蒸馏水∶弱酸=2∶1)1 min；⑥苯胺蓝1 min，弱酸工作液(蒸馏水：弱酸=2∶1)1 min；⑦体积分数为95%乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5-10 s；⑧二甲苯透明3次，每次一两分钟，中性树胶凝固。封固后光镜下观察溃疡黏膜下胶原形成情况。
1.5   主要观察指标   ①两组大鼠溃疡大体形态学观察，计算溃疡面积；②两组大鼠颊黏膜苏木精-伊红染色观察溃疡整体愈合及上皮形成情况；③两组大鼠颊黏膜Masson染色观察溃疡黏膜下胶原形成情况。
1.6   统计学分析   应用Adobe Photoshop CS6软件进行溃疡面积测量，溃疡测量具体方法：①窗口——测量记录；②设置测量比例——“自定义”——设置；③套索工具——选择溃疡面积；④窗口——直方图——像素；⑤记录测量——面积。应用GraphPad Prism 7.0软件进行数据统计分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过河北医科大学生物统计学专家审核。

目前口腔溃疡常用的造模方法有化学灼烧法、机械剪切法、自身组织抗原免疫注射法、放射照射法、氧自由基诱导法、细菌诱导法等[20]。虽然造模方法有很多，但是因为口腔溃疡的发病机制尚不完全明确，所以造模方法是否能真正模拟口腔溃疡的致病机制尚存在争议。不同的造模方法有不同的优缺点，采用化学药物对口腔黏膜进行灼烧的方法造模后溃疡面积较为弥散且创伤较浅表[3，21]，而机械剪切法溃疡面清晰，边界清楚，但是溃疡自然愈合较快。甲醛甲酚是口腔临床工作中常用的牙髓治疗材料。研究表明，甲醛甲酚可能在结缔组织中产生毒性作用[22]，可能与促进炎症反应相关的凝血坏死有关，因此它可促进损伤并延缓愈合过程。该实验采用机械剪切法联合化学烧灼法进行造模，旨在使造模后的溃疡界限清晰便于观察，双重造模方法会使溃疡创伤更严重，更有利于评价牙龈间充质干细胞对溃疡是否具有治疗作用。

牙龈间充质干细胞属于口腔组织来源的间充质干细胞，从牙龈组织中分离获得，显示出克隆形成能力、自我更新、多向分化潜能和免疫调节能力，是牙周组织工程非常有应用前景的种子细胞[5-7，23]。牙龈间充质干细胞具有同质性、非致瘤性、易于分离且表型稳定等优势[24]，可来源于牙龈成形术、种植治疗、拔牙等口腔治疗[25]，不会对患者造成额外的痛苦。该研究成功地从人牙龈组织中分离出了具有成骨、成脂分化能力及克隆形成能力的牙龈间充质干细胞，该结果与之前的研究结果一致[7，26]。

实验结果显示，造模后第3天，溃疡炎症反应最明显，周围黏膜红肿最重，溃疡凹陷最深，溃疡表面黄色假膜最厚；造模后第7天可见牙龈间充质干细胞组溃疡创面已基本愈合，与周围正常黏膜差异不明显。苏木精-伊红染色可见，造模后第3天牙龈间充质干细胞组炎细胞浸润较溃疡组减少；造模后第7天牙龈间充质干细胞组溃疡处可见薄层上皮形成，而溃疡组尚未见上皮组织修复。在该研究中，牙龈间充质干细胞组相较于单纯溃疡组早期的炎症反应更轻，其机制可能与牙龈间充质干细胞可降低炎症反应有关。张华梅[27]通过在牙周炎大鼠牙周组织中局部注射人来源牙龈间充质干细胞，其体内血清炎症因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α水平降低，从而发挥一定的抗炎作用。研究表明，人牙龈间充质干细胞来源外泌体通过促进炎症环境下巨噬细胞向M2型极化，从而减轻炎症反应[28]。

先前的研究发现，牙龈间充质干细胞可通过诱导上皮细胞增殖并激活成纤维细胞分泌胶原蛋白来促进皮肤伤口的重新上皮化进程[11-12，29-30]。该研究Masson染色可见，造模后第3天牙龈间充质干细胞组已开始有胶原纤维修复，而溃疡组尚未见明显胶原纤维修复，造模后第7天牙龈间充质干细胞组较溃疡组胶原形成较粗大，排列更加规则。与SHI等[12]的研究结果相类似。SHI等[12]将牙龈间充质干细胞来源外泌体加载到壳聚糖/蚕丝水凝胶海绵中，可有效促进糖尿病皮肤缺损的愈合，胶原纤维大量沉积，胶原纤维含量显著高于对照组及水凝胶组，其潜在的机制可能与促进成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白分泌有关[29-31]。

研究结果表明，牙龈间充质干细胞对再上皮化以及细胞外基质沉积和重塑具有积极影响。其潜在的机制可能是：移植牙龈间充质干细胞后降低炎症反应[27-28]，促进成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白分泌，促进内皮细胞的增殖、迁移从而促进血管生成[29-30]。

综上所述，人牙龈组织来源的间充质干细胞在大鼠创伤性口腔溃疡愈合早期具有降低炎症反应的作用，对于口腔溃疡愈合具有促进作用，其口腔上皮的形成时间更早，且胶原形成较粗大，排列更加规则，但其潜在机制有待进一步探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
创伤性口腔溃疡：是一种采用机械创伤进行口腔溃疡造模的方法，多用于创伤性口腔溃疡的研究。
牙龈间充质干细胞：来源于牙龈组织的一种口腔间充质干细胞，具有自我增殖及多向分化潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

口腔溃疡可严重影响患者的生活质量，可能由于创伤、感染、免疫失衡、过敏反应、烧伤、化学药物的使用、化疗和放疗等原因所导致。目前骨髓间充质干细胞已广泛应用于慢性伤口的愈合，但由于其来源相对不易，应用也相对受限。牙龈间充质干细胞因其取材较容易，具有一定的再生修复潜力，已在临床和基础科研中的到很大的应用，但尚未见牙龈间充质干细胞应用于口腔溃疡的相关报道。该研究探讨人来源牙龈间充质干细胞对创伤性口腔溃疡的治疗作用，观察溃疡愈合情况，以为后续机制研究提供前期实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程