三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定

doi:10.12307/2023.222

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (6): 860-865.doi: 10.12307/2023.222

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定

高婷1，马小红2，李晓荣2

1宁夏医科大学中医学院回医药现代化教育部重点实验室；宁夏医科大学基础医学院生育力保持教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医科大学总医院生殖医学中心，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2021-12-13 接受日期:2022-02-22 出版日期:2023-02-28 发布日期:2022-08-11
通讯作者: 李晓荣，博士，副主任医师，宁夏医科大学总医院生殖医学中心，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:高婷，女，1994年生，四川省南充市人，汉族，在读硕士，主要从事女性生殖系统疾病临床与理论研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660806)，项目负责人：李晓荣

Extraction and identification of exosomes from three different sources of ovarian granulosa cells

Gao Ting1, Ma Xiaohong2, Li Xiaorong2

1School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Key Laboratory of Hui Modernization of Medicine, Ministry of Education; Key Laboratory of Fertility Maintenance, Ministry of Education, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Reproductive Medicine Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2021-12-13 Accepted:2022-02-22 Online:2023-02-28 Published:2022-08-11
Contact: Li Xiaorong, PhD, Associate chief physician, Reproductive Medicine Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Gao Ting, Master candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Key Laboratory of Hui Modernization of Medicine, Ministry of Education; Key Laboratory of Fertility Maintenance, Ministry of Education, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No.81660806 (to LXR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：是绝大多数细胞所分泌的具有复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其内含物真实地反映了细胞来源和疾病状态；同时它可以作为一种“液体活检”方法，实时评估疾病或人体健康状态；通过其携带和转移的重要信号分子深入了解疾病的发生机制；此外，外泌体还积极参与了细胞间的通讯，并携带多种遗传物质，可通过自分泌或旁分泌被细胞吸收，调节细胞增殖，参与疾病生理病理过程。
颗粒细胞：卵巢颗粒细胞作为卵泡内最大的细胞群，是雌孕激素分泌的主要来源，对卵母细胞以及胚胎发育具有重要的作用，同时它的增殖与分化能力对于卵泡生长发育、排卵、黄体形成和类固醇激素分泌等一系列重要的卵巢功能性活动有着直接的影响。

背景：卵巢颗粒细胞作为卵泡内主要的功能细胞，通过复杂的缝隙连接与卵母细胞进行细胞间的信息物质交流，调控着卵母细胞的生长与成熟；随着外泌体研究的深入，发现其积极参与了细胞间的通讯，并携带多种遗传物质，可通过自分泌或旁分泌方式被细胞吸收，调节细胞增殖，参与疾病生理病理过程。由此可见，卵巢颗粒细胞的外泌体分泌能力及提取鉴定对于研究女性生殖具有重要的意义。
目的：探讨人卵巢颗粒细胞分泌外泌体的能力及不同来源人卵巢颗粒细胞外泌体之间的差异。
方法：体外培养SVOG细胞(人卵巢颗粒细胞系)、KGN细胞(人卵巢颗粒细胞瘤细胞)、人原代卵巢颗粒细胞；采用超高速离心法分别从3种不同来源卵巢颗粒细胞上清中分离提取外泌体，通过透射电子显微镜、纳米跟踪技术、蛋白质印迹法分别鉴定其形态结构、粒径大小、阳性相关特异性蛋白CD63、TSG101及阴性标记蛋白Calnexin的表达。
结果与结论：①SVOG细胞、KGN细胞、人原代卵巢颗粒细胞的细胞核均为圆形或椭圆形，核大，核仁部分蓝染，细胞浆呈淡红色；SVOG细胞、KGN细胞呈长梭形或多边形，形态不规则，人原代卵巢颗粒细胞多呈突起或梭形，细胞伪足细长，相互紧密交织；②3种不同来源人卵巢颗粒细胞免疫荧光均阳性表达FSHR，且阳性表达率> 95%；③3种不同细胞上清液分离的外泌体均呈双层膜结构杯托样；④纳米跟踪分析SVOG细胞、KGN细胞、人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的平均粒径分别为(183.5±4.9)，(125.3±1.0)，(171.1±2.0) nm，其中人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的分泌水平最高，KGN细胞来源外泌体的粒径最小，SVOG细胞来源外泌体大小较接近人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体；⑤蛋白质印迹法检测显示3种不同来源卵巢颗粒细胞来源外泌体特异性相关蛋白CD63、TSG101均呈阳性表达，而Calnexin不表达；⑥结果表明，采用超高速离心法能够成功分离提取不同卵巢颗粒细胞来源外泌体，KGN细胞来源外泌体粒径最小，SVOG细胞及人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体粒径较接近，以人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体的分泌水平最高。

https://orcid.org/0000-0002-5746-1727 (高婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 颗粒细胞, 外泌体, 透射电镜, 纳米粒子示踪分析, 蛋白质印迹法

Abstract: BACKGROUND: Ovarian granulosa cells, as the main functional cells in ovarian follicles, communicate with oocytes through complex gap junctions, and regulate the growth and maturation of oocytes. With the deepening of exosome research, it is found that it actively participates in the communication between cells, and carries a variety of genetic materials, which can be absorbed by cells through autocrine or paracrine, regulate cell proliferation, and participate in the physiological and pathological processes of diseases. It can be seen that the exosome secretion capacity and extraction and identification of ovarian granulosa cells are of great significance for the study of female reproduction.
OBJECTIVE: To explore the ability of human ovarian granulosa cells to isolate exosomes and the differences between exosomes from human ovarian granulosa cells of different origins.
METHODS: SVOG (human ovarian granulosa cell line), KGN (human ovarian granulosa cell tumor cells) and human primary ovarian granulosa cells were cultured in vitro. Exosomes were isolated from the supernatants of the three different cells by ultra-high speed centrifugation. The morphological structures, particle sizes, and the expression of CD63, tumor susceptibility gene (TSG101) and calnexin were measured by transmission electron microscopy, nanoparticle tracer technique, and western blot assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The nuclei of SVOG cells, KGN cells and human primary ovarian granulosa cells were round or oval with large nuclei, blue-stained nucleosomes and light red cytoplasm. SVOG cells and KGN cells were long spindle-shaped or polygonal with irregular morphology, and human primary ovarian granulosa cells were mostly protruding or spindle-shaped with elongated pseudopodia and closely intertwined with each other. (2) Immunofluorescence from three different sources of human ovarian granulosa cells was positive for FSHR expression, and the positive expression rate was greater than 95%. (3) The morphology of the exosomes isolated from the supernatants of the three different cells presented a cup-like bilayer structure. (4) Nanoparticle tracer technique showed that the mean particle sizes of exosomes from SVOG cells, KGN cells and human primary ovarian granulosa cells were (183.5±4.9) nm, (125.3±1.0) nm, and (171.1±2.0) nm, respectively. Among them, human primary ovarian granulosa cell-derived exosomes had the highest secretion levels. The exosomes from KGN cells had the smallest particle size, and the exosomes from SVOG cells were relatively similar in size to those from human primary ovarian granulosa cells. (5) Western blot assasy results showed that the exosomes from three different sources of ovarian granulosa cells were positive for the specific protein CD63 and the tumor susceptibility gene (TSG101) but negative for Calnexin. (6) These findings confirm that the ultra-high speed centrifugation method can successfully isolate and extract ovarian granulosa cell exosomes, among which KGN cell-derived exosomes have the smallest particle size; the particle sizes of exosomes derived from SVOG cells and human primary ovarian granulosa cells are similar; human primary ovarian granulosa cells have the strongest ability to secrete exosomes.

Key words: granulosa cell, exosome, transmission electron microscopy, nanoparticle tracer analysis, western blot assay

中图分类号:

高婷, 马小红, 李晓荣. 三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 860-865.

Gao Ting, Ma Xiaohong, Li Xiaorong. Extraction and identification of exosomes from three different sources of ovarian granulosa cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(6): 860-865.

图/表（结果） 5

2.1 SVOG细胞、KGN细胞、原代人卵巢颗粒细胞鉴定结果
2.1.1 苏木精-伊红染色结果 SVOG细胞、KGN细胞形态呈上皮细胞样，形态相似，呈长梭形、多边形等不规则形态，细胞之间以各自延伸的伪足相互交织连接，细胞核呈圆形或椭圆形，核仁蓝染，胞浆呈淡红色，细胞形态结构完整。原代人卵巢颗粒细胞呈成纤维细胞样，细胞贴壁良好，生长旺盛，细胞伪足细长，相互交织紧密连接，细胞核大，呈圆形，胞质颗粒均匀分布。见图1。

2.1.2 FSHR抗体免疫荧光表达人卵巢颗粒细胞的FSHR特异性染色定位在细胞浆，呈绿色，细胞核呈蓝色。在荧光显微镜下观察，3种不同来源细胞的FSHR 阳性率> 95%，颗粒细胞纯度达到95%，可以用于下一步实验研究。见图2。

2.2 外泌体的分离、提取、鉴定结果
2.2.1 外泌体形态 3种不同来源卵巢颗粒细胞的外泌体形态一致，呈双层膜状结构、杯样形态，符合文献报道的外泌体结构特征，镜下可见原代人卵巢颗粒细胞外囊泡聚集性分泌，见图3。

2.2.2 外泌体的粒径大小纳米颗粒跟踪分析结果显示SVOG细胞来源外泌体平均大小为(183.5±4.9) nm，在124，156 nm处呈现2个浓度高峰；KGN细胞来源外泌体平均大小为(125.3±1.0) nm，在95 nm处浓度最高；原代人卵巢颗粒细胞来源外泌体平均大小为(171.1±2.0) nm，在124，200 nm处呈现2个浓度高峰。3种不同来源颗粒细胞的外泌体粒径大小均符合外泌体粒径范围，以KGN细胞来源外泌体平均粒径最小，SVOG细胞来源外泌体与原代人卵巢颗粒细胞来源外泌体平均粒径相近，原代人卵巢颗粒细胞来源外泌体浓度最高。见图4。

2.2.3 外泌体表面相关特异性蛋白表达蛋白印迹法检测外泌体特异性蛋白，结果显示，3种不同来源卵巢颗粒细胞的外泌体中CD63、TSG101均呈阳性表达，Calnexin呈阴性表达，KGN细胞及原代人卵巢颗粒细胞来源外泌体中CD63蛋白出现非唯一性条带，见图5。

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引言

外泌体是包含蛋白质、核酸、脂类的具有双层脂膜的纳米级细胞外囊泡，其大小为30-200 nm[1]。1983年，首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年，JOHNSTONE等正式将其命名为“外泌体”。它作为生物标志物的理想来源[2]，其内含物真实地反映了细胞来源和疾病状态；同时它可以作为一种“液体活检”方法，实时评估疾病或人体健康状态；可通过其携带和转移的重要信号分子深入了解疾病的发生机制[1]。研究发现，大多数细胞、原核生物和真核生物在生理及病理状态下都能释放外泌体[3]，并广泛存在于各种体液中。

卵巢颗粒细胞(granulosa cells，GCs)是女性卵巢的主要功能性细胞，它的增殖与分化能力对于卵泡生长发育、排卵、黄体形成和类固醇激素分泌等一系列重要的卵巢功能性活动有着直接的影响。HUNG等[4]通过评估牛不同大小卵泡的卵泡液中细胞外囊泡对颗粒细胞的影响，证明了来自小卵泡的细胞外囊泡优先被颗粒细胞吸收并促进细胞增殖；DA SILVEIRA等[5]证明了在体外胚胎培育期间补充牛小卵泡来源细胞外囊泡可以提高牛胚胎囊胚率，以及调节与胚胎代谢和发育相关的基因转录水平；RODRIGUES等[6]研究发现卵泡液中的外泌体在卵母细胞成熟过程中能够增强卵母细胞的功能并保护其免受热休克。上述研究发现进一步证实了卵泡液中外泌体的积极作用，而卵泡液中细胞外囊泡的起源主要来自于颗粒细胞和卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexs，COCs)[7]。颗粒细胞作为唯一与卵母细胞接触的体细胞和作为卵巢中主要激素分泌细胞，在卵母细胞生长发育中起着尤为重要的作用。通过查询国内外文章，暂未找到有关颗粒细胞外泌体(granulosa cells extracellular vesicles，GCs-EVs)的分离提取及相关研究，该研究旨在通过体外培养人卵巢颗粒细胞，在细胞上清液中分离提取外泌体，并对分离的外泌体进行相关分子生物学特征分析，为后续颗粒细胞与卵母细胞的相互作用研究奠定基础，同时为卵泡的发育以及卵巢颗粒细胞的增殖分化提供了新的研究思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型，随机对照实验。
1.2 时间及地点实验于2021年6-10月在宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室、宁夏医科大学总医院生殖医学中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂和仪器磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM/F12培养基购买于美国Hyclone公司；RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清、无外泌体胎牛血清购买于美国Gibco公司；胰蛋白酶消化液、人血淋巴细胞分离液、青链霉素、DAPI溶液、抗荧光衰减封片液购买于上海Sloarbio公司；FSHR 抗体、羊抗兔二抗购买于亚科因(武汉)生物技术有限公司；CD63、TSG10、Calnexin抗体、羊抗兔IgG-HRP购买于沈阳万类生物；超速离心管、超速冷冻离心机购买于美国Beckman公司；纳米透射电镜检测仪(Tecnai G2 Spirit Bio Twin)购买于FEI公司；纳米粒度颗粒跟踪分析仪(Nano Sight NS300)购买于马尔文公司。
1.3.2 SVOG、KGN细胞来源 SVOG 细胞(C1051)是一株使用SV40T抗原转染人颗粒细胞得到的细胞系，购自北京北纳创联生物技术研究院；KGN细胞是一株人卵巢颗粒细胞肿瘤细胞株，来自宁夏医科大学生育力教育部重点保持实验室。
1.4 实验方法
1.4.1 培养液的配制完全培养液及无外泌体培养液均采用89%基础培养液+体积分数10%胎牛血清+1%青链霉素比例配置。SVOG细胞、KGN细胞、原代卵巢颗粒细胞(primary granulosa cell，PGC)各自基础培养液分别为RPMI-1640培养液、DMEM高糖培养液、DMEM/F12培养液。
1.4.2 SVOG、KGN细胞复苏将冻存的细胞取出放入提前预热的37 ℃水浴锅中快速融化，全程不超过3 min；将完全融化后的细胞冻存液转移至EP管或离心管中，加入适量的培养液，轻轻吹打混匀后1 000 r/min离心5 min；去上清，加入提前配置好的完全培养液重悬细胞；调整好细胞密度，均匀接种到适宜的细胞培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后换液。
1.4.3 SVOG、KGN细胞传代培养复苏后的细胞生长至80%左右时即可进行传代培养。从细胞培养箱取出细胞，于超净操作台去细胞上清，PBS摇洗3次，充分洗去含血清培养液及细胞碎片，加适量 0.25%不含EDTA的胰蛋白消化酶，十字晃匀放入37 ℃细胞培养箱消化3 min，显微镜下观察细胞形态变化，以细胞伪足消失、细胞变圆、细胞之间间隙增大但未脱壁为宜；加入适量完全培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打使细胞脱壁并混匀细胞；将单细胞悬液转移至离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再次加入适量的完全培养液重悬细胞；按1∶2/1∶3进行传代，铺匀后继续放置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，24 h后换液。
1.4.4 SVOG、KGN细胞上清收集使用复苏后传代3代以上的SVOG、KGN细胞，细胞混悬液调整好密度后均匀接种于T75细胞培养瓶，分别加入20 mL细胞完全培养液，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中进行培养；细胞密度达到70%时去上清，加入5 mL PBS洗3×3 min，充分去除含外泌体完全培养液；给予20 mL完全无外泌体血清培养液，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中继续培养48 h后收集各组细胞上清；4 ℃，300×g离心10 min，4 ℃，2 000×g离心10 min，分别收集上清混匀分装，放入-80 ℃保存至超速离心。
1.4.5 患者纳入及原代人卵巢颗粒细胞的分离、提取、培养

(1)患者纳入：研究方案通过宁夏医科大学总医院伦理委员会审批(KYLL-2021-952)，所有纳入患者均知情同意。患者招募自2021年7月至2021年9月于生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕的女性，于取卵日获取患者卵泡(≥16 mm)液样本。纳入标准：年龄为20-40岁因输卵管因素或男方因素行体外受精-胚胎移植助孕的育龄期女性，其染色体核型分析正常，体质量指数在19.5-23.5 kg/m2之间；排除标准：多囊卵巢综合征、卵巢储备功能不良、卵巢低反应、早发性卵巢功能低下的患者，既往有卵巢手术史、放化疗史、自身免疫性疾病史和内分泌性疾病(糖尿病、甲状腺疾病、高泌乳素血症)的患者。

(2)原代人卵巢颗粒细胞的分离、提取：收集的新鲜卵泡液于4 ℃，2 000 r/min离心5 min；去上清，加入DMEM/F12或PBS适量重悬沉淀；取新的15 mL离心管，先加入与前一步骤中重悬液体积相等的人外周血淋巴细胞分离液，再将重悬液沿管壁加入使其悬浮于淋巴分离液上层；4 ℃，590×g离心22 min；取中间白色絮状颗粒层至新的15 mL离心管，加入至少2倍体积的DMEM/F12或PBS进行重悬，4 ℃，2 000 r/min离心5 min，该步骤重复2次；去上清，留沉淀，加入适量完全培养液，缓慢吹打至细胞分散成单细胞悬液。

(3)原代人卵巢颗粒细胞的培养、上清收集：调整颗粒细胞浓度为1×108 L-1，均匀铺在100 mm培养皿中，加入6 mL细胞完全培养液，放置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养；24 h时细胞充分贴壁后进行换液，PBS轻轻摇洗2次，3 min/次，以充分去掉未贴壁的红细胞等其他悬浮颗粒，加入无外泌体完全培养液继续培养；以后每2 d换1次液，并收集上清，4 ℃，300×g离心10 min；4 ℃，2 000×g离心10 min；弃沉淀，取上清充分混匀分装，放入-80 ℃保存至超速离心，冻存时间不超过1个月。
1.4.6 SVOG细胞、KGN细胞、原代人卵巢颗粒细胞鉴定

(1)苏木精-伊红染色：于24 孔培养板中滴加10 μL PBS，然后放置15 mm的无菌细胞爬片，使细胞爬片紧密贴在培养板底部；调整细胞密度后接种于培养孔中，十字充分摇匀，避免堆积生长，放于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养至细胞铺满爬片70%-80%时收取爬片；PBS摇洗，充分去除死细胞及细胞碎片；40 g/L多聚甲醛于室温固定15-20 min，PBS 摇洗3×5 min；苏木精染色2 min，PBS
2 mL返蓝并用针尖挑洗1 min；体积分数70%盐酸乙醇分化5 s，PBS摇洗3×5 min返蓝；伊红染色2 min；体积分数95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅲ各脱水10 s；甘油明胶封固剂封固，自然晾干后显微镜下观察拍照。

(2)FSHR抗体免疫荧光鉴定：细胞爬片制作方法同苏木精-伊红染色。细胞铺满爬片70%-80%收取爬片，PBS洗3×5 min，40 g/L多聚甲醛固定20 min，室温自然晾干，PBS 摇洗3×5 min；0.1%Triton X-100室温下透膜5 min，PBS摇洗3×5 min；弃PBS，于室温下山羊血清封闭液孵育 30 min封闭无关的抗原；弃封闭液，滴加适量按1∶200稀释的一抗 FSHR兔多克隆抗体，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS充分摇洗3×5 min，滴加适量按1∶200稀释的二抗羊抗兔 IgG 聚合物，于室温下避光孵育30-60 min，PBS充分摇洗3×5 min；滴加适量DAPI染色液于室温下避光染色5 min，PBS充分摇洗3×5 min；滴加10 μL的抗荧光衰减封固剂进行封固，于荧光显微镜下观察采集图片。

1.4.7 外泌体的提取冻存的细胞上清4 ℃过夜融化，0.22 μm滤器过滤，将过滤好的细胞上清转移至超速离心管(体积分数75%乙醇浸泡过夜，无菌蒸馏水清洗三四遍，高压并烘干)；每管18 mL，4 ℃，10 000×g离心60 min，去凋亡小体，取上清；4 ℃，100 000×g离心2 h，留沉淀，去上清；每管加入25 μL预冷PBS重悬沉淀，分装入1.5 mL EP管，-80 ℃保存，避免反复冻融。注意：收上清时，使用巴氏管吸取，底部留弃约1 cm的液体；以上步骤均在4 ℃进行；该实验使用摆桶式水平转子(SW32Ti)，超速离心应严格配平，误差< 0.01。
1.4.8 透射电镜观察取外泌体PBS重悬液10 μL，滴加在铜网上，室温孵育5 min；孵育结束后，用吸水纸从一侧吸干多余液体；滴加 10 μL 2%磷钨酸于铜网上负染，室温孵育1 min；孵育结束用吸水纸在一侧吸干多余液体，白炽灯烤干；在80 kV下观察铜网的每一个网格。
1.4.9 纳米颗粒跟踪分析取外泌体母液10 μL，用专用无粒子水分别按照200倍(KGN细胞来源外泌体、SVOG细胞来源外泌体)、600倍(原代人卵巢颗粒细胞来源外泌体)比例稀释，充分混匀，0.22 μm过滤分散，用1 mL注射器吸取稀释液1 mL，排空空气缓慢推注外泌体稀释液充满整个样品池至出口有液体滴出，调整Nanosight-NS300仪器焦距及参数，测定各组外泌体的粒径大小及浓度，并收集记录检测结果。
1.4.10 蛋白免疫印迹(western blot)实验在外泌体PBS混悬液中加入少量RIPA裂解液，冰上静置5 min；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，吸上清为总蛋白抽提物；用BCA法对提取到的蛋白进行浓度定量检测；5×Loading Buffer和PBS稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上样液备用；12%SDS-PAGE进行蛋白分离，并将蛋白转印至PVDF膜，转印结束后将PVDF膜浸入TBST中，摇床摇动5 min，弃TBST，将PVDF膜浸入脱脂奶粉溶液中，摇床缓慢摇动1 h；封闭结束后分别加入用5%脱脂奶粉稀释的鼠抗人TSG101单克隆抗体(1∶500)、鼠抗人CD63单克隆抗体(1∶400)、鼠抗人Calnexin 单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜5 min×4次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)，37 ℃孵育45 min；TBST洗膜5 min×6次，滴加ECL发光液，静置反应5 min，转入暗盒中，在凝胶成像系统中曝光。
1.5 主要观察指标 ①人卵巢颗粒细胞的形态及FSHR抗体表达；②人卵巢颗粒细胞来源外泌体的形态；③纳米颗粒跟踪分析人卵巢颗粒细胞来源外泌体的粒径；④Western blot鉴定人卵巢颗粒细胞来源外泌体CD63、TSG101、Calnexin蛋白的表达。

讨论

颗粒细胞是卵巢合成和分泌抑制素、雌激素、孕激素的主要功能细胞，与卵母细胞共处于同一个微环境中，颗粒细胞通过复杂的缝隙连接，与卵母细胞进行细胞间小分子物质和营养物质的交换、信息的传递等生理活动，并调控卵母细胞的生长与成熟[8]。颗粒细胞能力减弱或凋亡，将不能分泌足够的激素及生长因子，会导致卵泡闭锁。相关研究表明，卵丘颗粒细胞的存在有利于受精及受精后发育，去除卵丘颗粒细胞的卵母细胞在进行体外受精-胚胎移植时的卵裂率、囊胚率均较低，且异常受精率较高[9-10]。由此可见，卵巢颗粒细胞是研究女性生殖的重要靶细胞。近20年来外泌体作为细胞间通讯的中介被广泛研究，查阅国内外文献，目前暂未发现有关卵巢颗粒细胞外泌体的相关研究报道。为研究卵巢颗粒细胞是否具有外泌体分泌能力，该研究成功从人卵泡液中分离培养了原代卵巢颗粒细胞，并进行了细胞形态及免疫荧光鉴定，由于人原代卵巢颗粒细胞为终末分化细胞，黄素化导致其不能长期体外培养[11]，因此该实验未采用传代培养的人卵巢颗粒细胞。此外，成功传代培养了SVOG细胞系、KGN细胞株。

外泌体是具有双层脂膜结构的细胞外囊泡，细胞质膜向内凹陷形成早期内体，内体中的蛋白质和其他生物分子被进一步加工包装成腔内小泡，多个腔内小泡组成多泡体，多泡体中部分腔内小泡被释放到细胞外基质中，而另一部分则被溶酶体降解，其中被释放到细胞外基质的这一部分腔内小泡被称之为外泌体[2]。外泌体携带着来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分，然后与邻近细胞的胞膜发生融合，进而将来源细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞，从而进行不同细胞间的信息交流传递[12]。绝大多数细胞在生理病理状态下都能够分泌外泌体。体外培养的细胞外泌体需要从上清液中分离提取，而细胞上清中不仅存在外泌体，还存在着细胞碎片、死细胞、凋亡小体、微囊泡等物质，利用这些物质的体积、密度差异选用不同大小离心力及过滤的方法可以去除，分离出外泌体。龚春梅等[13]提出超速离心法相比于其他分离方法，提取的外泌体浓度更高、纯化率高，并且适用于大样本量。该实验选用超速离心法提取人卵巢颗粒细胞分泌的外泌体，研究结果也证实该方法是可取的，进一步对细胞上清中提取的外泌体进行鉴定，分别从形态、大小及蛋白分子生物学角度进行了分析。透射电镜作为外泌体形态鉴定的金标准，是唯一一种可以测定其大小和观察其形态的方法[14]，但由于观察视野局限，常需要结合纳米跟踪分析整体颗粒的直径分布进一步鉴定。该实验通过透射电子显微镜对3种细胞上清提取的颗粒物进行了形态观察，均呈双层膜结构杯托样形态，纳米跟踪分析其直径范围均在30-200 nm内，可以初步认为超速离心提取的颗粒物为外泌体。此外，对比3种不同来源人卵巢颗粒细胞的外泌体粒径，发现KGN细胞(人卵巢颗粒细胞瘤细胞)来源外泌体平均粒径最小，SVOG细胞(人卵巢颗粒细胞系)来源外泌体与人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体平均粒径较接近，人原代卵巢颗粒细胞分泌的外泌体浓度最高。CAPONNETTO等[15]研究发现肿瘤侵袭程度可以通过癌细胞产生的外泌体大小来确定，例如外泌体越小，细胞可以越快传播和繁殖越快，癌症发展越快，而KGN细胞来源于人卵巢颗粒细胞瘤细胞，其增殖分化能力相对强于其他两种来源的卵巢颗粒细胞，该研究发现KGN细胞来源外泌体平均粒径明显小于其他两种细胞来源外泌体，结果与CAPONNETTO等[15]研究结果一致；原代人卵巢颗粒细胞分泌的外泌体浓度最高，在124，200 nm呈现2个浓度高峰，透射电子显微镜下可见小部分外泌体套叠成团聚集，虽粒径分析上样前进行了过滤分散，但依然不排除小部分粒径较大颗粒也为外泌体。

此外，由于外泌体物种的异质性和非特异性、分离技术的多样性以及与其他微囊泡在密度、大小、成分上的重合性，使其难以根据形态、大小确定分离到的囊泡为外泌体，而这一问题的解决常需要结合外泌体标志物的筛选[16]。目前普遍认为外泌体所共有的蛋白包括热休克蛋白(HSP70、HSP90)[17]、四跨膜蛋白家族(如CD9、CD63和CD81)、多囊泡胞内体产生相关蛋白(ALIX、TSG101、HSC70和HSP90β )[18]、细胞质蛋白(肌动蛋白和钙磷脂结合蛋白)、GTP 酶RAB家族等，这些成分多与外泌体的形成和起源有关，因此这类蛋白被称之为外泌体标记性蛋白。钙连蛋白Calnexin是存在于细胞内质网膜上的特异性蛋白，在外泌体鉴定中常被用作阴性对照。因此该研究选择了CD63、TSG101作为特异性蛋白进行鉴定，结果显示，3种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体中CD63、TSG101蛋白均呈阳性表达，Calnexin蛋白不表达，进一步证实了通过超速离心获得的颗粒囊泡为外泌体。同时，研究发现在KGN细胞及人原代卵巢颗粒细胞来源外泌体中CD63蛋白出现非唯一性条带，根据条带大小及蛋白分子量，以及SVOG细胞来源外泌体中该蛋白分子表达，作者认为非特异性条带的可能性较大，但也可能与外泌体中的蛋白存在修饰有关，一些蛋白被磷酸化和糖基化后会变大，一些蛋白被剪切后会变小，该情况与POGGIO等[19]已发表的外泌体蛋白质印迹法检测结果也是一致的。

外泌体在免疫反应、神经通讯、繁殖和发育，以及细胞增殖、稳态和成熟方面具有活性[20-22]，并且能够通过自身谷胱甘肽-S-转移酶活性调节谷胱甘肽二硫化物积累，减轻细胞或组织氧化损伤，从而调控衰老模型[23]。那么，颗粒细胞来源外泌体是否参与了颗粒细胞增殖、凋亡这一过程？其变化机制是怎样的？能否通过修饰颗粒细胞来源外泌体进一步调控颗粒细胞的凋亡或衰老呢？这些仍有待进一步探索。超速离心法作为外泌体提取的金标准，被广泛使用，但研究表明该方法提取的外泌体杂质较多，技术难度高，涉及到体外培养细胞的生长状态和超速离心的力度及时间，同时耗时长，如超速离心时间和离心力不适宜，可能导致外泌体未分离或者囊泡破裂、其他蛋白质污染，不利于下一步研究。外泌体的提取方法还包括密度梯度离心、聚合物沉淀、使用表面标记物的免疫亲和捕获、试剂盒提取、超滤离心等[20]，因时间及其他条件限制，还未来得及尝试。后续条件充足的情况下将采取更多方法分离提取比较并进行纯化鉴定，为卵巢颗粒细胞外泌体的分离提取提供最佳实验方案及对象。

综上所述，该研究证实了不同来源人卵巢颗粒细胞均具有外泌体分泌功能，并能够通过超速离心法分离提取，其形态多为圆形或椭圆形，直径在30-200 nm，阳性表达CD63、肿瘤易感基因TSG101，不表达钙连蛋白Calnexin；KGN细胞分泌的外泌体粒径最小，人原代卵巢颗粒细胞分泌的外泌体浓度最高，为后续颗粒细胞外泌体分子含量和通讯机制的研究奠定了基础，同时以它们作为补充或模型来生成合成载体，将所需分子携带到卵母细胞和胚胎中，为辅助生育技术带来帮助。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定

Extraction and identification of exosomes from three different sources of ovarian granulosa cells

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