柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化

doi:10.12307/2022.946

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (8): 1205-1210.doi: 10.12307/2022.946

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化

唐亮1，李熙恒1，牛瑞娟1，李欣悦1，邹馨颖1，毛天骄2，李江1，2

1吉林大学口腔医院，吉林省长春市 130021；2广州医科大学附属口腔医院，广东省广州市 510150

收稿日期:2021-12-22 接受日期:2022-01-30 出版日期:2023-03-18 发布日期:2022-07-27
通讯作者: 李江，主任医师，教授，博士生导师，吉林大学口腔医院，吉林省长春市 132001；广州医科大学附属口腔医院，广东省广州市 510150
作者简介:唐亮，男，1994年生，吉林省四平市人，吉林大学在读硕士，主要从事口腔修复方面的研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2021YFE0108000)，项目负责人：李江

Naringin regulates the function of RAW264.7 macrophages to affect the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells

Tang Liang1, Li Xiheng1, Niu Ruijuan1, Li Xinyue1, Zou Xinying1, Mao Tianjiao2, Li Jiang1, 2

1Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; 2Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Received:2021-12-22 Accepted:2022-01-30 Online:2023-03-18 Published:2022-07-27
Contact: Li Jiang, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Tang Liang, Master candidate, Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China, No. 2021YFE0108000 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
柚皮苷：是一种药物单体，主要存在于芸香科果皮和果肉中，为中药骨碎补的主要成分之一，主要有抗炎和促进成骨等特点。
脂多糖：为革兰阴性菌细胞壁中的一种特有成分，有利于细胞膜完整性，可引起免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动。

背景：柚皮苷作为一种中药单体，具有抗炎、促进成骨和抗癌等作用；RAW264.7巨噬细胞在骨破坏过程中发挥重要作用。有研究发现降低炎症水平可以促进MC-3T3-E1细胞的成骨分化，所以通过抑制炎症相关通路，可能对成骨细胞分化具有促进作用。
目的：观察柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能是否会影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化。
方法：采用CCK-8法检测不同浓度柚皮苷对脂多糖诱导的RAW264.7细胞的毒性。将RAW264.7细胞分成7组：即对照组(DMEM培养基)、炎症模型组(1 mg/L脂多糖)和柚皮苷组(1 mg/L 脂多糖+50，100，150，200，250 μmol/L柚皮苷)，通过RT-PCR检测炎症因子mRNA水平变化，筛选出抗炎浓度较好的3组(150，200，250 μmol/L柚皮苷组)数据用于后续实验。将RAW264.7细胞分成4组：炎症模型组、150，200，250 μmol/L柚皮苷组分别取各组的上清液制备炎症上清液。最后将上述制取的炎症上清液与成骨诱导培养基1∶1比例混合共同培养MC-3T3-E1细胞并分为5组：对照组、炎症模型组、150，200，250 μmol/L柚皮苷组，培养7，14 d进行成骨相关基因的检测，并进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性实验。
结果与结论：①1 mg/L的脂多糖对巨噬细胞无毒性作用，200 μmol/L柚皮苷对脂多糖诱导的巨噬细胞有细胞毒性作用(P < 0.05)；②筛选药物抗炎浓度过程中，与对照组相比柚皮苷浓度为150，200，250 μmol/L时抗炎效果较好(P < 0.05)，此3组浓度用于后续实验；③碱性磷酸酶染色结果显示，与对照组相比柚皮苷浓度200 μmol/L时染色效果最好，且14 d比7 d染色效果更佳；④与对照组相比，200 μmol/L柚皮苷组的成骨基因mRNA表达水平最接近对照组，成骨效果最差的为炎症模型(P < 0.05)；⑤碱性磷酸酶活性实验中，7 d时与对照组相比，柚皮苷浓度为200 μmol/L时碱性磷酸酶活性最强(P < 0.05)；与炎症模型组相比，柚皮苷浓度为200 μmol/L时最佳(P < 0.05)；14 d时，与对照组相比，200 μmol/L组无显著差异；与炎症模型组相比，200 μmol/L组活性最强；⑥以上结果证明，柚皮苷通过调节RAW264.7巨噬细胞功能可改善炎症状态下MC-3T3-E1细胞的成骨分化。
缩略语：巨噬细胞炎性蛋白1α：macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α

https://orcid.org/0000-0002-9562-7098 (唐亮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 柚皮苷, 抗炎, 成骨, MC-3T3-E1细胞, RAW264.7细胞

Abstract: BACKGROUND: Naringin, as a monomer of traditional Chinese medicine, has the anti-inflammatory and anti-cancer effects and can promote osteogenesis. RAW264.7 cells play an important role in bone destruction. Some studies have found that reducing inflammation can promote the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells. So, it may promote osteogenic differentiation by inhibiting inflammation-related pathways.
OBJECTIVE: To observe whether naringin can regulate the function of RAW264.7 cells to affect the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells.
METHODS: The cytotoxicity of different concentrations of naringin to RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide was tested by cell counting kit-8 method. RAW264.7 cells were divided into seven groups: control (DMEM culture), model group (1 mg/L lipopolysaccharide), and naringin groups (1 mg/L lipopolysaccharide+50, 100, 150, 200, 250 μmol/L naringin). In different concentration naringin groups, the mRNA levels of inflammatory factors were detected by RT-PCR. Data of three naringin groups with better anti-inflammatory concentrations (150, 200, 250 μmol/L) were selected for follow-up experiments. RAW264.7 cells were divided into four groups: inflammation model, 150, 200, 250 μmol/L naringin groups. The above four groups were used as inflammatory supernatant. The inflammatory supernatant prepared above was mixed with osteogenic induction medium in a ratio of 1:1 to co-culture MC-3T3-E1 cells. Culture cells were divided into five groups: control group, inflammation model group, 150, 200, 250 μmol/L naringin groups. Osteogenesis-related gene detection, alkaline phosphatase staining, and alkaline phosphatase activity experiment were carried out on 7 and 14 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: 1 mg/L lipopolysaccharide has no toxic effect on macrophages, but 200 μmol/L naringin showed a cytotoxic effect on macrophages induced by lipopolysaccharide (P < 0.05). In the process of screening the anti-inflammatory concentration of naringin, the concentration of naringin at 150, 200, and 250 μmol/L compared with the control group had good anti-inflammatory effects (P < 0.05). Therefore, 150, 200, and 250 μmol/L naringin were used for subsequent experiments. Alkaline phosphatase staining results showed that compared with the control group, 200 μmol/L naringin had the best dyeing result and the dyeing effect was better on 14 days than 7 days. The mRNA expression level of osteogenesis-related genes in the 200 μmol/L naringin was the closest to that in the control group and the inflammation model group had the worst osteogenic effect (P < 0.05). In the alkaline phosphatase activity experiment, compared with the control group and inflammation model group, 200 μmol/L naringin showed the strongest alkaline phosphatase activity on 7 days of culture (P < 0.05). Compared with the control group and inflammation model group, 200 μmol/L naringin showed no statistical significance in the alkaline phosphatase activity on 14 days of culture. Whilst compared with the inflammation group, the strongest alkaline phosphatase activity was found in the 200 μmol/L naringin group. The above results show that naringin can improve the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells in the inflammatory state by regulating the function of RAW264.7 macrophages.

Key words: naringin, anti-inflammation, osteogenesis, MC-3T3-E1 cell, RAW264.7 cell

中图分类号:

唐亮, 李熙恒, 牛瑞娟, 李欣悦, 邹馨颖, 毛天骄, 李江. 柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1205-1210.

Tang Liang, Li Xiheng, Niu Ruijuan, Li Xinyue, Zou Xinying, Mao Tianjiao, Li Jiang. Naringin regulates the function of RAW264.7 macrophages to affect the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(8): 1205-1210.

图/表（结果） 5

参考文献

[1] 陆定贵, 林佳杰, 姚顺晗,等. 关节软骨损伤修复的临床研究进展[J]. 微创医学,2021,16(4):538-541.
[2] HUNTER DJ, SCHOFIELD D, CALLANDER E. The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2014; 10(7):437-441.
[3] SOLDATOS NK, STYLIANOU P, KOIDOU VP, et al. Limitations and options using resorbable versus nonresorbable membranes for successful guided bone regeneration. Quintessence Int. 2017;48(2):131-147.
[4] GUAN J, GAN L, JIN D, et al. Overexpression of circ_0021739 in Peripheral Blood Mononuclear Cells in Women with Postmenopausal Osteoporosis Is Associated with Reduced Expression of microRNA-194-5p in Osteoclasts. Med Sci Monit. 2021;27:e929170.
[5] HUANG MY, TU CE, WANG SC, et al. Corylin inhibits LPS-induced inflammatory response and attenuates the activation of NLRP3 inflammasome in microglia. BMC Complement Altern Med. 2018;18(1): 221.
[6] YOSHIDA H, SUZUKI M, TANAKA K, et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody prevents loss of bone structure and bone strength in collagen-induced arthritis mice. Scand J Rheumatol. 2018;47(5):384-391.
[7] JERZAK MM. Decreased Production of TNF-α and IL-6 Inflammatory Cytokines in Non-Pregnant Idiopathic RPL Women Immunomodulatory Effect of Sildenafil Citrate on the Cellular Response of Idiopathic RPL Women. J Clin Med. 2021;10(14):3115.
[8] WU AC, RAGGATT LJ, Alexander KA, et al. Unraveling macrophage contributions to bone repair. Bonekey Rep. 2013;2:373.
[9] WU H, CHENG K, GUO Q, et al. Mapping Knowledge Structure and Themes Trends of Osteoporosis in Rheumatoid Arthritis: A Bibliometric Analysis. Front Med (Lausanne). 2021;8:787228.
[10] ZHAO Y, LI Y, QU R, et al. Cortistatin binds to TNF-α receptors and protects against osteoarthritis. EBioMedicine. 2019;41:556-570.
[11] ILCHOVSKA DD, BARROW DM. An Overview of the NF-kB mechanism of pathophysiology in rheumatoid arthritis, investigation of the NF-kB ligand RANKL and related nutritional interventions. Autoimmun Rev. 2021;20(2):102741.
[12] 丁佩惠, 唐琪, 陈莉丽. 柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响[J]. 中国中药杂志,2009,34(13):1712-1716.
[13] 张乐其, 柳毅, 徐高丽,等. 中药柚皮苷诱导成骨作用的研究进展[J]. 口腔医学,2016,36(3):277-280.
[14] KAWAGUCHI K, MARUYAMA H, HASUNUMA R, et al. Suppression of inflammatory responses after onset of collagen-induced arthritis in mice by oral administration of the Citrus flavanone naringin. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2011;33(4):723-729.
[15] VINCENZI A, GOETTERT I, SOUZA F. An evaluation of the effects of probiotics on tumoral necrosis factor (TNF-α) signaling and gene expression. Cytokine Growth Factor Rev. 2021;57:27-38.
[16] JIANG J, YAN L, SHI Z, et al. Hepatoprotective and anti-inflammatory effects of total flavonoids of Qu Zhi Ke (peel of Citrus changshan-huyou) on non-alcoholic fatty liver disease in rats via modulation of NF-κB and MAPKs. Phytomedicine. 2019;64:153082.
[17] LV Z, WU W, GE S, et al. Naringin protects against perfluorooctane sulfonate-induced liver injury by modulating NRF2 and NF-κB in mice. Int Immunopharmacol. 2018;65:140-147.
[18] 谈济洲, 聂二民, 张春元,等. 锌离子对炎症微环境下成骨细胞成骨相关蛋白表达的影响[J]. 中华口腔医学杂志,2016,51(8):486-490.
[19] CHEN M, LIU Q, XU Y, et al. The effect of LyPRP/collagen composite hydrogel on osteogenic differentiation of rBMSCs. Regen Biomater. 2021;8(1):rbaa053.
[20] 张勃昕,吉爱红,曹正垚, 等. miR-34a对人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 口腔生物医学,2019,10(1):1-5.
[21] WANG LM, ZHAO N, ZHANG J, et al. Tumor necrosis factor-alpha inhibits osteogenic differentiation of pre-osteoblasts by downregulation of EphB4 signaling via activated nuclear factor-kappaB signaling pathway. J Periodontal Res. 2018;53(1):66-72.
[22] LIU S, ZHOU M, LI J, et al. LIPUS inhibited the expression of inflammatory factors and promoted the osteogenic differentiation capacity of hPDLCs by inhibiting the NF‐κB signaling pathway. J Periodontal Res. 2020;55(1):125-140.
[23] KANESHIRO S, EBINA K, HI K, et al. IL-6 negatively regulates osteoblast differentiation through the SHP2/MEK2 and SHP2/Akt2 pathways in vitro. J Bone Miner Metab. 2014;32(4):378-392.
[24] 周旭华, 陈发明, 陆港霞,等. 新生儿缺氧缺血性脑病血清单核细胞趋化蛋白-1与巨噬细胞炎性蛋白-1α的变化及临床意义[J]. 中国儿童保健杂志,2010,18(2):154-156.
[25] CAO Y, CHEN J, REN G, et al. Punicalagin Prevents Inflammation in LPS-Induced RAW264.7 Macrophages by Inhibiting FoxO3a/Autophagy Signaling Pathway. Nutrients. 2019;11(11):2794.
[26] REN J , SU D , LI L , et al. Anti-inflammatory effects of Aureusidin in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages via suppressing NF-κB and activating ROS- and MAPKs-dependent Nrf2/HO-1 signaling pathways. Toxicol Appl Pharmacol. 2019;387:114846.
[27] HAMEISTER R, LOHMANN CH, DHEEN ST, et al. The effect of TNF-α on osteoblasts in metal wear-induced periprosthetic bone loss. Bone Joint Res. 2020;9(11):827-839.
[28] YANG C, LIU W, SHAN H, et al. Naringin inhibits titanium particles-induced up-regulation of TNF-α and IL-6 via the p38 MAPK pathway in fibroblasts from hip periprosthetic membrane. Connect Tissue Res. 2021;62(5):485-494.
[29] 宋囡,何文智,王智民,等.骨髓间充质干细胞在骨向分化的作用及中医药研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(1):95-99.
[30] NAMBI G. Does low level laser therapy has effects on inflammatory biomarkers IL-1β, IL-6, TNF-α, and MMP-13 in osteoarthritis of rat models—a systemic review and meta-analysis. Lasers Med Sci. 2021; 36(3):475-484.
[31] MADHU LN, KODALI M, ATTALURI S, et al. Melatonin improves brain function in a model of chronic Gulf War Illness with modulation of oxidative stress, NLRP3 inflammasomes, and BDNF-ERK-CREB pathway in the hippocampus. Redox Biol. 2021;43:101973.
[32] TAMAI R, SUZUKI K, MASHIMA I, et al. MPMBP down-regulates Toll-like receptor (TLR) 2 ligand-induced proinflammatory cytokine production by inhibiting NF-κB but not AP-1 activation. Int Immunopharmacol. 2020;79:106085.
[33] GIANNONI P, MARINI C, CUTRONA G, et al. Chronic lymphocytic leukemia cells impair osteoblastogenesis and promote osteoclastogenesis: role of TNFα, IL-6 and IL-11 cytokines. Haematologica. 2021;106(10):2598-2612.
[34] KOMORI T. Functions of Osteocalcin in Bone, Pancreas, Testis, and Muscle. Int J Mol Sci. 2020;21(20):7513.
[35] CHEN YN, WEI P, YU BS. Higher concentration of serum C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen is positively related with inflammatory factors in postmenopausal women with H-typehypertension and osteoporosis. Orthop Surg. 2019;11(6):1135-1141.

引言

骨损伤在生活中严重影响患者的身心健康，较为严重者甚至影响患者肢体运动，其治疗难度也更高[1-4]。骨损伤后损伤部位会立即产生炎症反应，其中RAW264.7巨噬细胞为主要的致炎细胞，通过核因子κB信号通路产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)等炎症因子作用于成骨细胞抑制成骨相关基因的表达，进而阻止骨愈合甚至造成骨的丢失[5-7]。也有研究发现降低炎症水平可以促进MC-3T3-E1细胞的成骨分化[8]，所以通过抑制炎症相关通路，可能对成骨细胞分化具有促进作用[9-11]。因而，此次实验主要研究经调控后的RAW264.7巨噬细胞产生的炎症环境对MC-3T3-E1细胞成骨分化的影响。

在治疗骨损伤疾病时，尤其骨缺损面积较大且治疗难度系数较高时，中药发挥了重要作用[12-13]。柚皮苷作为中药骨碎补的主要成分，具有抗炎、成骨、抗氧化和降低胆固醇等作用[12-14]。柚皮苷主要通过抑制核因子κB信号通路来抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、MIP-1α等炎症因子的产生，从而达到抗炎效果[15-17]。MC-3T3-E1细胞作为小鼠前成骨细胞具有良好的成骨特性，不同研究中会利用骨钙蛋白、骨桥蛋白、RUNX2、骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白等成骨相关发生基因作为成骨分化的指标[18-20]，此次实验以骨钙蛋白、骨桥蛋白、RUNX2作为主要的成骨标志。已有研究表明炎症因子肿瘤坏死因子α可抑制RUNX2的产生[21]，白细胞介素6可抑制骨桥蛋白与骨钙蛋白的mRNA表达[22-23]，炎症因子MIP-1α可促进肿瘤坏死因子与白细胞介素6的产生[24]，进而达到抑制成骨的效果。上述炎症因子抑制相关成骨蛋白的生成，若将柚皮苷的抗炎特性与MC-3T3-E1细胞的成骨特性联系在一起，则更有利于对柚皮苷药效的研究。

然而目前尚未见通过柚皮苷调控RAW264.7巨噬细胞功能来影响MC-3T3-E1细胞成骨分化的研究。此次实验依据前期研究结果用1 mg/L 脂多糖诱导巨噬细胞24 h来制造炎症模型[25-27]，并观察炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、MIP-1α的mRNA水平变化验证炎症造模是否成功。柚皮苷调控巨噬细胞的功能，主要通过观察炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、MIP-1α的mRNA水平变化验证柚皮苷是否可降低炎症因子水平。若柚皮苷可有效抑制炎症因子表达，则观察诱导后的MC-3T3-E1细胞成骨相关基因骨钙蛋白、骨桥蛋白、RUNX2的mRNA水平变化，以碱性磷酸酶活性及染色来判断脂多糖诱导的巨噬细胞在柚皮苷调控下是否对MC-3T3-E1细胞的成骨分化有影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，多个样本均值间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年1-11月在吉林大学口腔医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(上海碧云天生物技术有限公司)和小鼠前成骨细胞系 MC-3T3-E1购自美国组织培养库(American Tissue Culture Collection，ATCC 细胞库)。实验过程遵循了本地及国家法规。
1.3.2 材料和仪器 CCK-8检测试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、40 g/L多聚甲醛、BCIP/NBT 碱性磷酸酶、碱性磷酸酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，柚皮苷、超净台(宝辰鸡光科技有限公司)，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素等试剂、二甲基亚砜(美国 Gibco 公司)，内参β-actin、炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、小鼠MIP-1α、成骨因子RUNX2重组蛋白、骨桥蛋白、骨钙蛋白等引物(上海生工有限公司)，CO2恒温细胞培养箱(日本SANYO公司)，Vanox倒置显微镜(日本Olympus公司)，酶标仪(美国Bio-TEK公司)。
1.4 方法
1.4.1 溶液的配制柚皮苷溶解于二甲基亚砜中，制得250 μmol/L的储备液储藏于4 ℃冰箱用于后续实验。取脂多糖，加入PBS配置成1 g/L贮备液，于-20 ℃储藏。
1.4.2 RAW264.7和MC-3T3-E1细胞的培养将RAW264.7细胞和MC-3T3-E1细胞从液氮中取出并复苏，用含1%的青-链霉素和含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37 ℃，体积分数5%的CO2恒温孵育箱中培养，每3 d传代1次，传3代后待细胞恢复活力用于后续实验。
1.4.3 细胞毒性实验将RAW264.7细胞分为对照组、炎症模型组、不同浓度(50，100，150，200，250 μmol/L)柚皮苷组，按照每孔6×103细胞接种于96孔板中，每组设置3个复孔。对照组细胞培养24 h后用DMEM培养基继续培养24 h；脂多糖组用1 mg/L 脂多糖培养24 h后用DMEM培养24 h；不同浓度柚皮苷组用1 mg/L 脂多糖诱导24 h，然后分别加入含50，100，150，200，250 μmol/L 柚皮苷的培养基培养24 h后弃去培养基，每孔加入100 μL DMEM培养基和10 μL CCK-8试剂，继续孵育4 h，采用酶标仪测定波长450 nm处吸光度(A)值。
1.4.4 筛选抗炎药物浓度将 RAW264.7细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后将细胞分为7组：对照组(DMEM培养基)、炎症模型组(1 mg/L脂多糖)和柚皮苷组(1 mg/L 脂多糖+50，100，150，200，250 μmol/L柚皮苷)。炎症模型组、柚皮苷组加入含1 mg/L 脂多糖的培养基，24 h后更换为不含或含柚皮苷的完全培养基，继续培养24 h。使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，测定RNA 浓度后定量1 µg RNA 为模板，反转录为cDNA，使用实时荧光定量 PCR 仪检测炎症相关基因白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、MIP-1α的 mRNA 表达，引物序列见表1，采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.4.5 柚皮苷作用于脂多糖诱导的RAW264.7细胞上清液的制取实验分为炎症模型组和不同浓度柚皮苷组(150，200，250 μmol/L组)，将1×105个RAW264.7巨噬细胞接种于细胞培养瓶中，培养24 h后，各组均加入1 mg/L 脂多糖诱导24 h，再将炎症模型组更换为10%完全培养基，柚皮苷组分别加入不同浓度柚皮苷溶液培养24 h后，所有组弃培养液，用PBS清洗后更换10%完全培养基继续培养24 h，然后收集各组上清液，1 000 r/min离心20 min，0.22 μm的滤器过滤，吸取上清，装入10 mL离心管中放入4 ℃冰箱中保存用于后续实验。
1.4.6 成骨诱导实验将MC-3T3-E1细胞，以5×105/孔接种于6孔板，置于CO2孵箱中培养24 h待细胞贴壁后，分为对照组(成骨诱导液)、炎症模型组(炎症模型组上清液+成骨诱导液)、柚皮苷150，200，250 μmol/L组(各浓度组上清液+成骨诱导液)，每组5个复孔，所有组别培养液均是1.4.5步骤中对应上清液与成骨诱导液(含10%体积分数胎牛血清、20 nmol地塞米松、20 mmol β-甘油磷酸钠+100 mg/L抗坏血酸的DMEM培养基)1∶1比例混合制成混合成骨诱导培养基培养MC-3T3-E1细胞。每2 d更换1次上述混合成骨诱导培养基，根据实验需要分别诱导7，14 d。

(1)碱性磷酸酶活性检测：MC-3T3-E1细胞成骨诱导7，14 d，使用 PBS清洗，按照试剂盒的操作说明收集各组细胞裂解液，分别取30 µL加入细胞裂解液、10 μL缓冲液、10 μL基质液至96孔板，37 ℃孵育15 min 后加入150 µL显色液，测量样品在520 nm 波长处的吸光度值并计算各组的碱性磷酸酶活性。

(2)碱性磷酸酶染色：MC-3T3-E1细胞成骨诱导7，14 d，使用 PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定后，在室温避光条件下，按照说明书的步骤，配制 BCIP/NBT 工作液进行碱性磷酸酶染色，反应中止后在显微镜下观察碱性磷酸酶染色面积，碱性磷酸酶染色阳性可见细胞质呈蓝紫色，并且有蓝紫色颗粒物。

(3) RT-PCR检测各组MC-3T3-E1细胞成骨相关基因表达水平：MC-3T3-E1细胞成骨诱导14 d，使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，测定RNA 浓度后定量1 µg RNA 为模板，反转录为cDNA，使用实时荧光定量 PCR 仪检测成骨相关基因骨桥蛋白、RUNX2、骨钙蛋白的mRNA表达，采用2-ΔΔCt法进行数据分析。相关引物见表1。
1.5 主要观察指标 ①细胞毒性作用；②RAW264.7细胞炎症因子mRNA表达水平；③MC-3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性及染色结果；④MC-3T3-E1成骨相关基因 mRNA 表达水平。

1.6 统计学分析文章统计学方法已经由吉林大学专家审核。采用 SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，多组间样本平均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用 SNK-q 检验。以 P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨损伤在生活中较为常见，可由意外事故、人为损伤等因素导致[1-4]。在骨缺损过程中伴随着炎症的产生，由巨噬细胞，中性粒细胞，血小板细胞共同产生白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、MIP-1α等炎症因子作用于成骨细胞并抑制成骨相关基因的表达进而抑制成骨[5-8，27]。其中脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞为常见的炎症模型。CAO等[25-26，28]用安石榴甙通过抑制FoxO3a/自噬信号通路来预防脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞产生炎症等实验均与此次实验采用的炎症模型相同，脂多糖浓度和时间筛选结果也一致。在炎症影响骨愈合的同时，其治疗过程也更为复杂。在骨损伤治疗过程中，中药发挥了重要作用，与化学合成药物相比不良反应更小[29]，其中骨碎补广泛应用于骨损伤的治疗，柚皮苷作为骨碎补的有效单体成分之一，具有抗炎、成骨、抗癌、降低胆固醇的作用[12-14]。柚皮苷虽同时具有成骨与抗炎的作用，但是有效抗炎药物浓度与成骨药物浓度相差较大，因此两种作用不会发生叠加[12-13]。其中柚皮苷的主要抗炎机制是通过抑制核因子κB通路来抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、MIP-1α等炎症因子的产生[30-32]。通过查阅文献可知，炎症因子肿瘤坏死因子α可抑制基因Runx2的 mRNA表达，白细胞介素6可抑制骨桥蛋白与骨钙蛋白的mRNA表达，MIP-1α可促进肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的产生，进而抑制骨的愈合[21-24]。骨桥蛋白、骨钙蛋白、Runx2是骨代谢过程中的重要指标，可以反映成骨细胞活性和骨形成情况，所以对骨桥蛋白、骨钙蛋白、Runx2的mRNA表达起抑制作用，即对骨的形成有抑制作用[33-35]。因此可采用柚皮苷调节巨噬细胞功能来影响MC-3T3-E1细胞的成骨效果。

为研究柚皮苷调控脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞对MC-3T3-E1细胞成骨分化的影响，首先进行了细胞毒性实验，实验数据表明与炎症模型组比较，柚皮苷浓度为200 μmol/L时可明显抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞增殖(P < 0.05)，该浓度下柚皮苷可能通过抑制RAW264.7巨噬细胞增殖而发挥抗炎作用。为排除此种可能，可增加对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞增殖率无影响的柚皮苷浓度组用于后续实验。同时考虑到柚皮苷抗炎是否有效，对炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、MIP-1α的mRNA水平进行检测，结果表明，柚皮苷为150，200，250 μmol/L时炎症因子水平下降明显(P < 0.05)，说明柚皮苷具有抗炎效果，根据上述实验结果作者应用150，200，250 μmol/L柚皮苷用于后续实验。在柚皮苷可抗炎的前提下进行炎症上清液的制备，用成骨诱导液与炎症上清液按1∶1比例混合诱导MC-3T3-E1细胞；碱性磷酸酶活性检测结果显示，7 d和14 d 碱性磷酸酶活性均高于炎症模型组(P < 0.05)；碱性磷酸酶染色结果观察时，不同浓度柚皮苷组染色面积及颜色深度均强于炎症模型组，弱于对照组，且14 d优于7 d；观察成骨蛋白相关基因骨桥蛋白、骨钙蛋白、Runx2 mRNA的表达水平可知，与炎症模型组相比，不同浓度柚皮苷组各基因mRNA表达水平均提高。上述结果均说明柚皮苷可促进炎症环境下MC-3T3-E1细胞的成骨分化。

综上所述，柚皮苷在一定浓度下可以通过调节经脂多糖诱导的巨噬细胞功能，使其产生炎症因子的能力下降，从而改善炎症状态下MC-3T3-E1细胞的成骨分化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化

Naringin regulates the function of RAW264.7 macrophages to affect the osteogenic differentiation of MC-3T3-E1 cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[3]	梁家琪, 刘恒旭, 阳金鑫, 杨椅, 邓旭辉, 谭明健, 罗炯. 运动与肠道菌健康效益的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1292-1299.
[4]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[5]	徐星星, 文超举, 孟茂花, 王勤英, 陈镜桥, 董强. 口腔种植中的碳纳米材料[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1062-1070.
[6]	唐昊天, 廖荣东, 田京. 压电材料修复骨缺损的应用及设计思路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1117-1125.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[10]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[11]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[12]	张敏, 张晓明, 刘童斌. 柚皮苷在骨组织再生领域的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 787-792.
[13]	张力宸, 陈亮, 顾勇. 无机离子仿生骨膜调控免疫微环境促进骨修复[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 346-353.
[14]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.
[15]	李睿, 刘珍, 郭子歌, 卢瑞杰, 王晨. 纯钛表面载阿司匹林微球与聚多巴胺复合涂层促进成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 374-379.