载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (在线): 1-6.

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载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应

范亚茹1，2，李瑞欣2，李凤集2，罗睿2，刘浩2，严颖彬2

1天津医科大学口腔临床学院，天津市 300070；2南开大学附属口腔医院，天津市口腔医院，天津市口腔功能重建重点实验室，天津市 300041

收稿日期:2021-12-03 修回日期:2022-01-15 出版日期:2022-01-08 发布日期:2022-03-12
通讯作者: 刘浩，博士，主任医师，南开大学附属口腔医院，天津市口腔医院，天津市口腔功能重建重点实验室，天津市 300041；严颖彬，博士，主任医师，南开大学附属口腔医院，天津市口腔医院，天津市口腔功能重建重点实验室，天津市 300041
作者简介:范亚茹，女，1994年生，山东省菏泽市人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事口腔颌面部肿瘤的光热治疗研究
基金资助:
天津市科技计划项目(19ZXDBSY00070)，项目负责人：刘浩；国家自然科学基金(11972198)，项目负责人：李瑞欣；天津市临床医学重点学科专项(HWZX001)，项目负责人：刘浩

Characterization and photothermal effect of indocyanine green encapsulated poly lactic acid-co-glycolic acid microspheres

FAN Yaru1,2, LI Ruixin2 , LI Fengji2, LUO Rui2, LIU Hao2,YAN Yingbin2

1School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2The Affiliated Stomatological Hospital of Nankai University, Tianjin Stomatological Hospital, Tianjin Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Function Reconstruction,Tianjin 300041, China

Received:2021-12-03 Revised:2022-01-15 Online:2022-01-08 Published:2022-03-12
Supported by:
This work was supported by the Tianjin Science and Technology Project (19ZXDBSY00070) , the National Natural Science Foundation of China (11972198) and the Special Project of Tianjin Clinical Medicine Key Discipline (HWZX001).

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

光热治疗：是治疗肿瘤的一种新兴手段，主要工作原理是通过光热转换剂吸收的近红外光转换为热量，局部升温来消融肿瘤细胞，具有经济可行性、微创性和避免非靶区损伤等明显优势，对人体正常组织产生的不良反应很小，被国际专家学者称为“绿色疗法”。
近红外光：是介于可见光和中红外光之间的电磁波，波长范围为750-2 500 nm，习惯上又将近红外区分为近红外一窗(650-1 000 nm)和近红外二窗(1 000-1 400 nm)2个区域。光热治疗中所采用的激光光源需要对生物组织具有较好的通透性，而第一生物窗口和第二生物窗口激光对组织具有较强的穿透性，尤其是近红外一窗激光研究最为广泛，所以，光热治疗技术中所采用的激光光源一般是808 nm和980 nm等近红外光。

摘要
背景：吲哚菁绿作为高效的光热转换剂可用于口腔鳞状细胞癌的光热治疗，但其具有水不稳定和光降解等缺点，利用载体负载吲哚菁绿提高其稳定性，对探索口腔鳞状细胞癌的光热治疗研究具有重要意义。
目的：制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿的微球，延缓吲哚菁绿光降解，提高其光热稳定性。
方法：①采用乳液-溶剂蒸发法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿的微球，对其形貌、粒径分布、表面电荷、载药量和包封率进行表征。②将游离吲哚菁绿溶液与吲哚菁绿微球悬液在不同质量浓度下(0.6，0.8，1.0，1.2 g/L)经近红外光辐照5 min，考察溶液温度变化；将游离吲哚菁绿溶液与吲哚菁绿微球悬液在1.0 g/L质量浓度下未避光放置0，3，6，9天，观察近红外光辐照5 min内的温度变化；将游离吲哚菁绿溶液与吲哚菁绿微球悬液在1.0 g/L质量浓度下进行4个开-关激光光照循环，考察溶液温度变化。③将舌鳞癌细胞系SCC-25接种于48孔板内，分8组培养：对照组、空白微球组、1.0 g/L游离吲哚菁绿组、1.0 g/L吲哚菁绿微球组、近红外光照组、空白微球+近红外光照组、1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和1.0 g/L吲哚菁绿微球+近红外光照组。处理12 h后，采用CCK-8法检测细胞活力。
结果与结论：①吲哚菁绿微球表面光滑，平均粒径为(2.54±0.29) μm，Zeta电位为 -(20.2±1.58) mV，包封率和载药率分别为(69.24±1.29)%和(4.87±0.15)%；②游离吲哚菁绿与吲哚菁绿微球具有相似的光热转换能力，但增加激光辐照次数或未避光存放后，游离吲哚菁绿的光热转换能力较吲哚菁绿微球明显降低；③1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和1.0 g/L吲哚菁绿微球+近红外光照组的SCC-25细胞皱缩呈球型，该两组的细胞活力低于对照组(P < 0.001)；④结果表明，吲哚菁绿微球具有高效的光热转换效率，明显延缓了吲哚菁绿的光漂白和光降解。

https://orcid.org/0000-0003-1038-8240 (范亚茹)

关键词: 聚乳酸-羟基乙酸共聚物, 吲哚菁绿, 微球, 口腔鳞状细胞癌, 光热治疗, SSC-25细胞, 近红外光, 乳液-溶剂蒸发法

Abstract: BACKGROUND: Indocyanine green, an efficient photothermal conversion agent, can be used for photothermal therapy of oral squamous cell carcinoma, but it has some shortcomings such as water instability and photodegradation. Using carrier to encapsulate indocyanine green to improve its stability was of great significance for exploring photothermal therapy of oral squamous cell carcinoma.
Objective: Indocyanine green encapsulated poly lactic acid-co-glycolic acid microspheres were fabricated to delay the photodegradation of indocyanine green and improve its photothermal stability to develop reagents for photothermal treatment of oral squamous cell carcinoma.
Methods: The microspheres were prepared by emulsion-solvent evaporation method. The morphology, particle size distribution, surface charge, drug loading and encapsulation efficiency were characterized. The photothermal effect of free indocyanine green and microspheres were investigated at different concentrations, four laser on/off cycles, and left exposed to light for 0, 3, 6 and 9 days. Morphological changes of SCC-25 cells after different treatments were observed under light microscope, and in vitro photothermal anti-tumor effect of microspheres were evaluated by CCK8.
Results: The microspheres had smooth surfaces with particle sizes of (2.54±0.29)μm, zeta potential of -(20.2±1.58)mV, encapsulation efficiency and loading efficiency were (69.24±1.29) % and (4.87±0.15) %, respectively. Compared with free indocyanine green, microspheres have more stable photothermal properties, and tumor cells shrink to spherical shape after photothermal, which can effectively reduce the viability of SCC-25 cells.
Conclusion: Indocyanine green encapsulated poly lactic acid-co-glycolic acid microspheres possessed efficient photothermal conversion ability and can obviously delay photobleaching and photodegradation of indocyanine green. Poly lactic acid-co-glycolic acid is a suitable vehicle of indocyanine green and can be used for photothermal therapy of oral squamous cell carcinoma.

Key words: poly lactic acid-co-glycolic acid, indocyanine green, microsphere, oral squamous cell carcinoma , photothermal therapy, SCC-25 cell, near-infrared, emulsion-solvent evaporation method

中图分类号:

范亚茹, 李瑞欣, 李凤集, 罗睿, 刘浩, 严颖彬.

载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应 [J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.

FAN Yaru, LI Ruixin , LI Fengji, LUO Rui, LIU Hao, YAN Yingbin. Characterization and photothermal effect of indocyanine green encapsulated poly lactic acid-co-glycolic acid microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(在线): 1-6.

图/表（结果） 4

2.1 吲哚菁绿微球的表征结果吲哚菁绿微球为淡绿色粉末，空白微球为白色粉末。光镜下可见吲哚菁绿微球在水溶液中分散均匀，呈现大小不等的球型或类球形，见图2A。扫描电镜下观察到微球表面光滑，形态圆整，见图2B。微球的平均粒径为(2.54±0.29) μm，粒度比较均一，见图2C。微球表现出较低的Zeta电荷，平均为-(20.2±1.58) mV，见图2D。
图2E为吲哚菁绿水溶液在780 nm处的紫外吸收光谱。吲哚菁绿质量浓度在0-30 mg/L范围内，吸光度与浓度呈线性关系，见图2F。吲哚菁绿微球包封率和载药量分别为(69.24±1.29)%和(4.87±0.15)%。

将吲哚菁绿粉末与吲哚菁绿微球未避光放置9 d内的升温曲线，见图3C、D。吲哚菁绿水溶液的升温性能下降，升温效果较吲哚菁绿微球差。第0，3，6，9天时，1.0 g/L吲哚菁绿水溶液光照5 min的最大温度值分别为53.7，50.3，48.2，46.6 ℃，温度差为 30.9，28.0，26.1，24.2 ℃，依次衰减；1.0 g/L吲哚菁绿微球溶液同样光照条件下的最大温度值分别为54.0，54.5， 52.4，50.2 ℃，温度差分别为31.4，30.9，29.5，28.1 ℃，温度差相对没有游离吲哚菁绿明显，见表1。此处温度差定义为未避光放置不同天数时，激光照射条件下两种溶液所能达到的最高平衡温度与PBS光照后平衡温度的差值。另外，在4个开-关光照循环中，1.0 g/L游离吲哚菁绿水溶液表现出可见的温度下降，4个循环的最高温度分别为52.3，51.2，50.3，49.0 ℃，而1.0 g/L吲哚菁绿微球溶液的温度无明显衰减，保持在52.0℃左右，见图3E、F。另外，通过图3G更直观地观察到两者分别放置0 d和9 d时的温度分布，中心温度最高，呈均匀白色，由内到外温度逐渐下降；通过对比，放置9 d的游离吲哚菁绿温度下降更加显著。因此，通过上述实验可以观察到聚乳酸-羟基乙酸共聚物能够有效包裹吲哚菁绿，延缓其光降解，比游离吲哚菁绿具有更稳定的光热效应。

2.3 吲哚菁绿微球的体外光热抗肿瘤细胞效应检测结果见图4。
光镜下可见，1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和
1.0 g/L吲哚菁绿微球+近红外光照组的SCC-25细胞皱缩呈球型，其他6相细胞为多边形。空白微球组、1.0 g/L游离吲哚菁绿和1.0 g/L吲哚菁绿微球的细胞活力与对照组相似
(P > 0.05)，几乎达到100%，表明吲哚菁绿微球具有较高的细胞相容性；1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和1.0 g/L
吲哚菁绿微球+近红外光照组的细胞活力分别为35.8%和28.4%，与对照组比较差异有显著性学意义(P < 0.001)，表明游离吲哚菁绿与吲哚菁绿微球均具有光热消融肿瘤细胞的能力。由于实验采用的是未避光放置3 d的吲哚菁绿粉末和吲哚菁绿微球配制的溶液，而吲哚菁绿微球光照组显示出较游离吲哚菁绿光照组更低的细胞存活率，表明负载后吲哚菁绿的光能性能更加稳定。
2.4 微球的细胞相容性由CCK-8实验可知，吲哚菁绿微球具有较高的细胞相容性。

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引言

口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，手术作为目前主要的治疗手段不可避免会造成组织缺陷或颜面畸形，而放化疗作为传统的辅助治疗往往伴随着严重的毒副作用[1]。光热治疗是近年来用于肿瘤治疗的一种新方法，具有侵袭性小、选择性高等特点，作用原理是将光热转换剂吸收的光能转换成热量来消融肿瘤细胞[2]。由于激光照射深度有限，光热治疗对接近皮肤表层的和内镜易检查到的组织表面肿瘤具有较好的应用前景，而口腔鳞癌好发于舌、颊、牙龈、腭等口腔浅表结构，特别适合光热治疗[3]。吲哚菁绿是美国食品和药物管理局批准的唯一一种可用于人体医学成像和诊断的近红外有机染料[4]。除了作为肿瘤成像对比剂所具有的特殊成像性能外，吲哚菁绿还表现出优异的光热性能，是一种良好的光热转换剂，可用于肿瘤的光热治疗[5]。然而，由于具有水不稳定性、光降解和体内半衰期短(2-4 min)等缺点，造成了吲哚菁绿的使用范围受到限制[6-7]。
基于纳米颗粒的吲哚菁绿递送系统有望打破这些限制。吲哚菁绿作为双亲性染料可被装入各种载体中，如二氧化硅、磷酸钙、脂质体和高分子胶束等[8-10]。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物因其良好的生物降解性和生物相容性已被美国食品和药物管理局批准为临床缝合材料，是目前最有前途的吲哚菁绿载体之一[11]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体时其表面可接受抗体修饰，从而提高微球靶向性[12]；或者在其表面枝接亲水性聚乙二醇，进一步改善药物的药动学和药效
学[13]。目前国内外对聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球的研究多数集中在成像方面，部分涉及光热或光动力治疗。研究显示对吲哚菁绿进行聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载，可有效防止吲哚菁绿分子的水中聚集及与血液中蛋白的相互作用，从而提高吲哚菁绿的光学稳定性。此外，负载后的吲哚菁绿不仅保持了水、热、光稳定性，而且循环半衰期增加到14 min，是游离吲哚菁绿的3-7倍[14-15]。
此次实验拟制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球，对其性能表征，系统地与游离吲哚菁绿在不同条件下进行光热性能比较，以获得能够实现吲哚菁绿光热性能稳定的载体，为口腔鳞状细胞癌的光热治疗提供新的思路。

材料方法

1.1 设计微球制备与体外细胞实验，两组间比较采用t检验分析，多组间比较比较采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年6-10月在南开大学附属口腔医院天津市口腔功能重建重点实验室完成。
1.3 材料舌鳞癌细胞系SCC-25(武汉北纳生物科技有限公司)；吲哚菁绿、聚乳酸-羟基乙酸5050(相对分子质量5×104)、聚乙烯醇17-88(上海源叶生物科技有限公司)；二氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)；CCK8试剂(索莱宝生物科技有限公司)；胎牛血清和DMEM高糖培养基(美国，Gibco)。均质分散机(德国艾卡)；磁力搅拌器(上海司乐)；扫描电镜(日本日立)；激光粒径测定仪、zeta电位分析仪(美国，Brookhaven 公司)；紫外-可见分光光度计(澳大利亚，安捷伦)；光学显微镜(日本，Nikon)；808 nm激光器(中国，长春雷锐光电科技有限公司)；近红外成像仪(美国，FLIR E5)。
1.4 方法
1.4.1 聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球的制备微球制备流程见图1所示。
1.4.2 称取4 mg吲哚菁绿粉末分散于200 μL去离子水中，超声处理30 min使其完全溶解，作为内水相；称取50 mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于2 mL二氯甲烷中，作为油相；以10 mL浓度为1%的聚乙烯醇作为外水相。高速剪切
(15 000 r/min)条件下将内水相加入油相，乳化2 min，形成稳定的初乳(水/油)；之后将初乳加入到外水相中，高速剪切(10 000 r/min )条件下乳化 1 min，得到水/油/水复乳。室温下置于磁力搅拌器上旋转(400 r/min旋转5 h)，加速二氯甲烷挥发。最后，对溶液进行离心，8 000 r/min离心10 min，将沉淀的微球用去离子水反复清洗，真空冷冻干燥后获得固化微球(整个操作过程要求严格避光)。制作空白微球时，将双蒸水作为内水相，其余步骤与聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球相同。
1.4.2 吲哚菁绿微球的表征
(1)微球形貌、粒径及电位的表征：取适量吲哚菁绿微球粉末分散在去离子水中，光学显微镜下观察微球大体形态；将少量的吲哚菁绿微球粉末涂抹在导电胶上，喷金后利用扫描电镜对微球表观形貌进行表征。将干燥的吲哚菁绿微球样品分散于双蒸水中(pH=7)，超声振荡获得均质微球悬浮液，对其进行粒径和电位检测；样品循环检测5次，取其均值作为最后的测定值。
(2)微球载药率和包封率的测定：
吲哚菁绿水溶液的紫外吸收光谱和标准曲线：采用紫外分光光度计对吲哚菁绿水溶液进行紫外吸收光谱检测。以蒸馏水作为基准，移液枪吸取5 μL吲哚菁绿水溶液，取1 μL滴入测试孔中，设定扫描波长 200-1 000 nm，确定最大吸收波长。精确称取1 mg 吲哚菁绿粉末分散于去离子水中，超声30 min使其完全溶解，配制成质量浓度为100 mg/L的母液。之后进行梯度稀释，得到质量浓度为1.25，2.5，5.0，10，20，30 mg/L的标准液，检测不同质量浓度吲哚菁绿水溶液的吸光度值，并绘制标准曲线。
载药率和包封率的测定：为了确定吲哚菁绿微球中吲哚菁绿的载药量，取10 mg冻干的微球样品放入离心管内，加入2 mL二氯甲烷溶液，超声振荡使微球完全溶解；再加入
5 mL去离子水，10 000 r/min离心5 min，收集上清，紫外分光光度计在780 nm处测其吸光度值，通过标准曲线获得吲哚菁绿的含量，进而计算吲哚菁绿微球的载药量和包封率。
包封率(%)=(微球中包裹的吲哚菁绿质量/总吲哚菁绿质量)×100%
载药率(%)=(微球中包裹的吲哚菁绿质量/吲哚菁绿微球的总质量)×100%
1.4.3 吲哚菁绿微球与游离吲哚菁绿的光热性能检测为了探索不同吲哚菁绿含量的光热性能，称取适量的吲哚菁绿微球，分散到去离子水中，配制成含有吲哚菁绿质量浓度为0.6，0.8，1.0，1.2 g/L的吲哚菁绿微球悬液。同样精确称取吲哚菁绿粉末，配成相同质量浓度的游离吲哚菁绿水溶液。将两种溶液分别加入48孔板中，经功率为1.2 W/cm2的808 nm近红外光辐照5 min，红外热成像仪实时监测激光诱导的溶液温度变化。为了比较两者的光稳定性，对1.0 g/L吲哚菁绿水溶液和1.0 g/L吲哚菁绿微球溶液进行4个开-关激光光照循环，观察溶液的温度变化；另外，将吲哚菁绿粉末与吲哚菁绿微球常温不避光保存，分别于0，3，6，9 d时，配制成吲哚菁绿质量浓度为1.0 g/L的溶液，经功率为1.2 W/cm2的808 nm激光辐照5 min，观察两者的升温速率与最终平衡温度。
1.4.4 吲哚菁绿微球的体外光热抗肿瘤效应将未避光放置3 d的吲哚菁绿粉末和吲哚菁绿微球配制成吲哚菁绿质量浓度为1.0 g/L的溶液。将SCC-25细胞以2×104/孔的密度接种于48孔板中，孔内含有体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，37 ℃孵育24 h后弃去培养液，分8组培养：对照组、空白微球组、1.0 g/L游离吲哚菁绿组、1.0 g/L吲哚菁绿微球组、近红外光照组、空白微球+近红外光照组、1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和1.0 g/L吲哚菁绿微球+近红外光照组。空白微球悬液、吲哚菁绿微球悬液与吲哚菁绿溶液的加入量为1 mL，近红外光照条件为：808 nm，1.2 W/cm2，辐照10 min。
处理12 h后，采用CCK-8法测定不同处理后的细胞活力。首先去除孔板中溶液，PBS轻轻清洗3次；其次，每孔加入300 μL新鲜DMEM高糖培养基和30 μL CCK-8试剂，置于CO2恒温培养箱中避光孵育4 h；每孔取出100 μL溶液加入96孔板，酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，计算细胞存活率。
细胞存活率=(待测孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)
此处对照孔为加入不含吲哚菁绿的PBS，空白孔为只加培养液和CCK-8溶液(无细胞)。
其中无激光辐照孔(对照组、空白微球组、1.0 mg/L游离吲哚菁绿组和1.0 g/L吲哚菁绿微球组)的吸光度值，用于表明材料的细胞毒性；其他组(近红外光照组、空白微球+近红外光照组、1.0 g/L游离吲哚菁绿+近红外光照组和
1.0 g/L吲哚菁绿微球+近红外光照组)的吸光度值，用于表明光热治疗消融SCC-25细胞的能力。为了观察光热治疗后肿瘤细胞的形态变化，将剩余样本用PBS轻轻清洗3次后光镜下拍照。
1.5 主要观察指标吲哚菁绿微球的光热性能与体外光热抗肿瘤效应。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据采用x±s形式表示，两组间比较采用t检验分析，多组间比较采用方差分析，以GraphPad Prism 7.0软件进行绘图，P < 0.05定义为差异有显著性意义。统计学方法已经天津医科大学统计学专家审核。

讨论

吲哚菁绿的最大吸收波长在800 nm左右，吸收光能后的吲哚菁绿分子通过电子在轨道的跃迁吸收成为激发态，并通过3种不同的途径失活其激发态；首先，吸收的能量转化为荧光，可用于组织的光声成像[16]；其次，一小部分吸收的光能转换为有毒的化学物质(如单线态氧、超氧阴离子和羟基自由基等)，这是光动力治疗的基础[17]；最后，大部分吸收的光能在分子内部转换成热量，为光热治疗消融肿瘤细胞提供了必要条件[18]。因此，此次实验主要利用吲哚菁绿吸收光能转化为热能的特点，研究吲哚菁绿的光热效应。然而，吲哚菁绿在应用中具有很多局限性[19-21]，主要表现在以下几个方面：①水不稳定性：发光材料多具有大π共轭体系，在水溶液中由于分子间π-π作用或其他非辐射渠道形成的激基复合物可消耗激发态能量。另外，吲哚菁绿五圆环中的亚胺正离子很不稳定，容易被水解开环。②光漂白现象：吲哚菁绿结构是两端氮杂环中间含有多个次甲基长共轭链，在长时间光照下多个次甲基会发生断裂；或光吸收趋于饱和后不可逆地破坏激发态分子。③循环半衰期短：静脉注射后立刻与α-脂蛋白和球蛋白结合，随血液循环迅速分布于全身血管内，经胆道入肠排泄。一般正常人静脉注射20 min后约有97%从血中排除。④光降解：吲哚菁绿在水溶液中的降解遵循一级动力学，光暴露加速了吲哚菁绿的降解。⑤热降解：较高的温度可显著加速吲哚菁绿在水溶液中的降解。因此，为了解决以上问题，可采用不同的制备策略将吲哚菁绿与载药系统结合，来提高其水稳定性和光稳定性。近年来，纳米颗粒载药系统受到了广泛的关注，其中聚合物纳米粒子是一种常见的药物载体，而聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种经FDA批准的具有良好生物相容性的聚合物载体，被广泛应用于骨或软骨组织再生或各种小分子药物、蛋白质和基因的载体[22-23]；特别是，聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球自1984年以来一直被用作长效给药系统[18]。另外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物可生物降解为聚乳酸和羟乙酸，前者进入三羧酸循环代谢为二氧化碳和水排出体外；后者在肾中以原形排泄，或者进入三羧酸循环，同样以二氧化碳和水的形式消除，对机体无毒无害[24]。
据报道，目前聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备方法有5种，包括乳液-溶剂蒸发法、相分离法、喷雾干燥法、超临界流体法和膜乳化法[25]。其中，乳液-溶剂蒸发法是制备聚乳酸-羟基乙酸微球最常用的方法，制备流程简单、易于操作，此种方法可包封多种药物如抗癌药物、抗炎药物和抗生素等。另外，在目前药物递送系统中，生物活性分子如蛋白质、多肽和核酸分子等，由于其水溶性，在乳化过程中容易向连续水相扩散。然而，乳液-溶剂蒸发技术已被广泛应用于高水溶性化合物的包埋，可以防止包裹后的生物分子降解，控制释放速率和程度，提高加载效率[26-27]。进一步来说，聚乙烯醇作为乳液稳定剂能够维持2个或2个以上不混溶相分散的理化状态，防止相的分离，从而使乳化液体系更加稳定[28]。然而在实际操作中，利用乳化-溶剂蒸发法制备微球的影响因素较多，如药物性质和溶解度、聚合物的用量、选用的有机溶剂以水油相比例等、关键参数较多，工业化生产难度较大。此次实验根据前期预实验结果优化实验参数，制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球，球体表面光滑，形态均一；包封率和载药量分别为(69.24±1.29)% 和(4.87±0.15)%。由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物链端羧基的存在，微球表现出较高的电位负值，范围为-18.62至-21.78 mV。而在有些报道中，Zeta值接近零，可能是微球上有聚乙烯醇的残留，掩盖了表面的带电基团[29]。在比较游离吲哚菁绿与吲哚菁绿微球的光热性能时发现，随着吲哚菁绿质量浓度的增加，两者的升温速率与温度均增加，相同吲哚菁绿质量浓度的两种溶液，升温性能相当。而在未避光放置不同天数的光热升温曲线中发现，吲哚菁绿微球明显较游离吲哚菁绿升温速率快，且最终平衡温度高。另外，在4次激光开-关光照循环中，游离吲哚菁绿从第1次到第4次的光照中，最高温度约下降3.0 ℃，而吲哚菁绿微球溶液在观察期间最高温度无明显衰减。以上实验结果表明，游离吲哚菁绿与吲哚菁绿微球具有相似的光热转换能力，但增加激光辐照次数或未避光存放后，游离吲哚菁绿的光热转换能力较吲哚菁绿微球明显降低。研究证明，温度超过48 ℃且持续4-6 min会对肿瘤细胞造成不可逆的损伤[30]。在体外光热消融肿瘤细胞实验中，选择未避光放置3 d的吲哚菁绿粉末和吲哚菁绿微球配制成质量浓度为1.0 g/L的溶液，1.2 W/cm2的近红外激光辐照时间10 min，温度分别达到并稳定在50.0 ℃和54.0 ℃左右，足以杀死肿瘤细胞。由于微球光照后的平衡温度更高，显示出较游离吲哚菁绿更低的细胞存活率。由此可见，无论是光热性能研究或是体外抗肿瘤实验，均表明了聚乳酸-羟基乙酸共聚物的包裹能够有效延缓吲哚菁绿光的降解，使吲哚菁绿的光热性能更加稳定。
综上所述，通过乳液-溶剂蒸发法成功制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载吲哚菁绿微球，微球具有良好的生物相容性，较游离吲哚菁绿具有更稳定的光热性能，暴露于近红外光(808 nm，1.2 W/cm2)辐照10 min后，SCC-25细胞存活率明显降低。微创性的光热治疗为口腔鳞状细胞癌的治疗提供了一种新的解决方案，有可能避免传统治疗方法的缺点。接下来将建立荷瘤裸鼠模型，进一步探索吲哚菁绿微球在体内的光热抗肿瘤效果，为口腔鳞状细胞癌的光热治疗提供理论依据。

载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应

Characterization and photothermal effect of indocyanine green encapsulated poly lactic acid-co-glycolic acid microspheres

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