壳聚糖/海藻酸盐复合支架联合山楂叶总黄酮修复脊髓损伤

doi:10.12307/2022.299

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
山楂叶总黄酮：是从干燥山楂叶中提取的一种天然黄酮类活性物质，具有活血理气、降血压与降血脂、抗氧化、抗衰老及增强机体免疫力等药理作用，在缺氧复氧诱导的神经细胞损伤、高脂血症、糖尿病肾病、脑缺血模型中具有改善神经细胞损伤、降血脂、抑制氧化应激、减轻神经元凋亡的功效。
壳聚糖/海藻酸盐复合支架：壳聚糖为聚阳离子高分子材料，侧链结构中含有游离氨基，可与海藻酸盐通过正负电荷吸引作用形成聚电解质复合物，改善海藻酸盐单独作为药物载体时药物释放过快及力学性能较差的不足。故而，实验选择壳聚糖海藻酸盐复合支架作为山楂叶总黄酮的载体进行脊髓损伤修复实验。

背景：有研究证明山楂叶总黄酮对脊髓损伤具有一定的治疗作用，但是给药方式局限于腹腔注射，而直接应用于脊髓损伤部位的报道较少见。
目的：比较负载山楂叶总黄酮缓释微球壳聚糖海藻酸盐复合支架与腹腔注射山楂叶总黄酮联合壳聚糖海藻酸盐复合支架修复脊髓损伤的效果。
方法：制备壳聚糖海藻酸盐复合支架、山楂叶总黄酮缓释微球与负载山楂叶总黄酮缓释微球的壳聚糖海藻酸盐复合支架。取40只SD大鼠，建立脊髓全切损伤模型，随机分4组：损伤对照组术后腹腔注射生理盐水；支架组植入壳聚糖海藻酸盐复合支架，术后腹腔注射生理盐水；支架+药物注射组植入壳聚糖海藻酸盐复合支架，术后腹腔注射20 mg/(kg·d)的山楂叶总黄酮；负载药物支架组植入负载缓释微球的壳聚糖海藻酸盐复合支架，术后腹腔注射生理盐水。术后8周内应用BBB评分与斜板实验评估大鼠运动功能，术后8周时进行脊髓组织病理组织形态观察及Western Blot 检测。
结果与结论：①自术后2周开始，植入支架3组大鼠的BBB评分与斜板实验角度均高于损伤对照组(P < 0.05)，支架+药物注射组、负载药物支架组高于支架组(P < 0.05)，负载药物支架组高于支架+药物注射组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色显示，损伤对照组损伤区域未见脊髓组织，其余3组植入的支架与损伤脊髓端连接较紧密，并且支架材料中长入了组织与细胞，支架+药物注射组与负载药物支架组长入的组织较多；③Western Blot检测显示，植入支架3组的胶质纤维酸性蛋白表达低于损伤对照组(P < 0.05)，神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43表达高于损伤对照组(P < 0.05)；负载药物支架组的胶质纤维酸性蛋白表达低于支架组、支架+药物注射组(P < 0.05)，支架+药物注射组低于支架组(P < 0.05)；负载药物支架组的神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43表达高于支架组、支架+药物注射组(P <0.05)，支架+药物注射组的神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43表达高于支架组(P < 0.05)；④结果表明，山楂叶总黄酮腹腔注射或以缓释微球局部应用联合壳聚糖海藻酸盐复合支架均可促进脊髓损伤的修复，其中以缓释微球局部应用的效果更好。

https://orcid.org/0000-0002-7821-1559(刘名)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 壳聚糖, 海藻酸盐, 山楂叶总黄酮, 脊髓损伤, 复合支架, 缓释微球

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that hawthorn leaf total flavonoids have a certain therapeutic effect on spinal cord injury, but the method of administration is limited to intraperitoneal injection, and there are rare reports of direct application to the site of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To compare the effects of chitosan alginate composite scaffold loaded with hawthorn leaf flavonoids sustained-release microspheres and intraperitoneal injection of hawthorn leaf flavonoids combined with chitosan alginate composite scaffold in the repair of spinal cord injury.
METHODS: Chitosan alginate composite scaffolds, hawthorn leaf flavonoids sustained-release microspheres and chitosan alginate composite scaffolds loaded with hawthorn leaf total flavonoids sustained-release microspheres were prepared. Forty Sprague-Dawley rats were used to establish a model of complete spinal cord injury and were randomly divided into four groups. Injury control group received intraperitoneal injection of saline after surgery. Rats in the stent group were implanted with a chitosan alginate composite stent, and injected intraperitoneally with physiological saline after the operation. Rats in the stent + drug injection group were implanted with chitosan alginate composite stent, and injected intraperitoneally with 20 mg/(kg·d) hawthorn leaf total flavonoids after surgery. Rats in the drug loaded stent group were implanted with chitosan alginate composite stent loaded with sustained-release microspheres, and injected intraperitoneally with physiological saline after the operation. BBB score and inclined plate test were used to evaluate the motor function of rats within 8 weeks after operation. The pathological morphology and western blot assay of spinal cord tissue were observed at 8 weeks after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Since 2 weeks after operation, BBB score and inclined plate test angle of three groups of stent implantation were higher than those of injury control group (P < 0.05), and those of stent + drug injection group and drug loaded stent group were higher than those of stent group (P < 0.05), and that of drug loaded stent group was higher than that of stent + drug injection group (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining showed that in the injury control group, no spinal cord tissue was found in the injured area, and only thin filamentous connection was found. The stent implanted in the other three groups was closely connected with the injured spinal cord end, and tissue and cells grew into the scaffold material. There were more tissues in the stent + drug injection group and drug loaded stent group. (3) Western blot assay demonstrated that the expression of glial fibrillary acidic protein in three groups of stent implantation was lower than that in injury control group (P < 0.05). The expression levels of neurofilament protein 200, myelin basic protein, and growth-associated protein 43 were higher in the three groups of stent implantation than those in the injury control group (P < 0.05). The expression of glial fibrillary acidic protein in drug loaded stent group was lower than that in stent group and stent + drug injection group (P < 0.05), and that in stent + drug injection group was lower than that in stent group (P < 0.05). The expression levels of neurofilament protein 200, myelin basic protein, and growth-associated protein 43 were higher in drug loaded stent group than that in stent group and stent + drug injection group (P < 0.05). The expression levels of neurofilament protein 200, myelin basic protein, and growth-associated protein 43 were higher in stent + drug injection group than that in stent group (P < 0.05). (4) The results have showed that intraperitoneal injection of total flavonoids from hawthorn leaves or local application of sustained-release microspheres combined with chitosan alginate composite scaffolds can promote the repair of spinal cord injury, and the effect of local application of sustained-release microspheres is better.

Key words: chitosan, alginate, hawthorn leaf flavonoids, spinal cord injury, composite stent, sustained release microspheres

中图分类号:

刘名, 王凯. 壳聚糖/海藻酸盐复合支架联合山楂叶总黄酮修复脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4466-4471.

Liu Ming, Wang Kai. Chitosan/alginate composite scaffold combined with hawthorn leaf flavonoids for spinal cord injury repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(28): 4466-4471.

图/表（结果） 6

2.1 微球与支架的微观形貌利用扫描电镜观察复合支架与药物缓释微球的微观形貌，可见壳聚糖海藻酸盐复合支架内部呈高孔隙率的三维网状结构，药物缓释微球呈表面较光滑的球状，并且可见药物缓释微球均匀分布于复合支架内，见图1。

2.2 各组大鼠行为学BBB评分术后1周时，各组大鼠的BBB评分均为0；从术后2周开始，4组大鼠的后肢运动功能逐渐恢复，其中支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组大鼠的BBB评分开始高于损伤对照组(P < 0.05)，负载药物支架组高于支架组、支架+药物注射组(P < 0.05)，支架+药物注射组高于支架组(P < 0.05)。各组大鼠术后各时间的后肢运动功能BBB评分曲线，见图2。

2.3 各组大鼠斜板实验结果随着术后时间的延长，各组大鼠斜板实验角度逐渐增大，损伤对照组术后4，6，8周的斜板实验角度均大于术后1周(P < 0.05)，并且术后4，6，8周的斜板实验角度比较差异有显著性意义(P < 0.05)；其余3组组内术后1，2，4，6，8周的斜板实验角度比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
术后1周时，4组斜板实验角度比较差异无显著性意义(P ﹥0.05)；术后2周时，4组斜板实验角度存在差异，支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组斜板实验角度大于损伤对照组(P < 0.05)，负载药物支架组大于支架组、支架+药物注射组(P < 0.05)，支架+药物注射组大于支架组(P < 0.05)，并且该差异一直持续至术后8周。各组大鼠术后各时间的斜板实验角度变化，见表1。

2.4 各组大鼠脊髓组织形态学观察术后8周光镜下观察脊髓横断面可见，损伤对照组损伤区域未见脊髓组织，仅见较细的丝状连接，其余3组植入的支架与损伤脊髓端连接较紧密，并且支架材料中长入了组织与细胞，支架+药物注射组与负载药物支架组长入的组织较多，见图3。

2.5 各组大鼠脊髓Western Blot检测术后8周时利用Western Blot 检测4组脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白相对表达，结果显示：损伤对照组可见较强的胶质纤维酸性蛋白蛋白条带，较微弱的神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43蛋白条带；其余3组的胶质纤维酸性蛋白蛋白弱于损伤对照组，神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白条带强于损伤对照组。
半定量分析结果显示，支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达低于损伤对照组(P < 0.05)，负载药物支架组低于支架组、支架+药物注射组(P < 0.05)，支架+药物注射组低于支架组(P < 0.05)；支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43蛋白表达高于损伤对照组(P < 0.05)，负载药物支架组神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白表达高于支架组、支架+药物注射组(P < 0.05)，支架+药物注射组神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白表达高于支架组(P < 0.05)。各组脊髓组织胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白检测结果见图4。

2.6 材料的生物相容性由脊髓组织学观察结果可知，负载山楂叶总黄酮缓释微球壳聚糖海藻酸盐复合支架具有良好的生物相容性。

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引言

脊髓损伤造成损伤节段神经支配的运动与功能障碍、肌张力异常及病理反射等神经损伤表现[1]，严重影响患者的生活质量，目前主要的治疗方式有药物治疗[2-4]、手术治疗与康复锻炼等[5-7]，上述治疗方式仅能保护残存的神经功能、控制继发性损伤，治疗效果非常有限。因此，如何有效地修复脊髓损伤是神经科学和脊柱科学领域的研究热点和难点。

近些年来，组织工程技术成为修复脊髓损伤最具应用前景的方式之一。目前应用于构建组织工程脊髓的支架材料主要有人工合成的可降解材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸与聚乳酸羟基乙酸等)与天然的细胞支架材料(包括胶原、海藻酸盐与壳聚糖等)[8-9]。人工合成的可降解材料存在制作工艺复杂、塑形困难、生物相容性差等缺点，降解产物呈酸性，对宿主组织与种子细胞可能会产生不利影响；而天然的细胞支架材料具有良好的生物相容性，降解产物易于吸收，但力学性能较差、塑形困难。目前的研究多将性质互补的或可协同作用的材料混合制成复合支架，发挥取长补短的优势。

山楂叶总黄酮是从干燥山楂叶中提取的一种天然黄酮类活性物质，具有活血理气、降血压与降血脂、抗氧化、抗衰老及增强机体免疫力等药理作用，在缺氧复氧诱导的神经细胞损伤、高脂血症、糖尿病肾病、脑缺血模型中具有改善神经细胞损伤、降血脂、抑制氧化应激、减轻神经元凋亡的功效[10-13]。近年有研究证明，山楂叶总黄酮对脊髓损伤具有一定的治疗作用[14-15]，但是该药的给药方式局限于腹腔注射，而直接应用于脊髓损伤部位的报道较少见。

所以，实验拟改进山楂叶总黄酮的给药途径，将其制成缓释微球并负载于壳聚糖海藻酸盐复合支架上，比较负载缓释微球壳聚糖海藻酸盐复合支架与腹腔注射山楂叶总黄酮联合壳聚糖海藻酸盐复合支架修复脊髓损伤的效果，为临床应用提供一定的实验室参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机分组，动物体内实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年6月在青海省人民医院完成。
1.3 材料山楂叶总黄酮(山西晋城中晋药业有限公司)；壳聚糖(脱乙酰度98%，西安百川生物科技有限公司)；海藻酸盐(武汉峰耀同辉化学制品有限公司)；聚乳酸羟基乙酸共聚物(山东鑫富实业有限公司)；冷冻干燥机(型号：LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司)。
成年健康雄性SD大鼠40只，体质量(240±10) g，购自青海省药品检验检测院，使用许可证号为：SYXK(青)2019- 0001。40只实验动物均制备脊髓损伤模型，造模后随机分为损伤对照组、支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组，每组10只。实验中对动物处置符合科技部颁行的《关于善待实验动物的指导性意见》，严格遵守动物福利以及伦理原则的相关要求。动物实验获得青海省人民医院伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 壳聚糖海藻酸盐复合支架的制备[16] 称取0.4 g壳聚糖粉末，置于含有2%乙酸10 mL的烧杯中，充分搅拌混匀，制备4%的壳聚糖水凝胶。称取0.2 g海藻酸盐，置于含10 mL三蒸水的烧杯中，充分搅拌混匀，制备2%的海藻酸盐水凝胶。将制备的两种水凝胶混合，置于磁力搅拌器上200 r/min搅拌30 min，导入90 mm平皿中，紫外下照射60 min充分交联，形成壳聚糖海藻酸盐水凝胶。将获得的水凝胶低压消泡后注入内径约1 mm的多通道模具中，-80 ℃过夜。置于预冷的冷冻干燥机中低压真空冷冻干燥48 h。干燥后常温下脱模，将复合支架置于1%NaOH中2 h，三蒸水反复冲洗至中性。低压真空冷冻干燥制得成型的壳聚糖海藻酸盐复合支架。
1.4.2 药物缓释微球的制备[17] 将5 mg的山楂叶总黄酮溶于5 mL去离子水中，作为内水相；将250 mg聚乳酸羟基乙酸共聚物溶于10 mL 二氯甲烷与丙酮溶剂中，作油相；将内水相逐滴加入油相中，使内水相与油相的体积比为1∶4，立即超声处理(100 W，30 s)，使混合相均匀，形成初乳；将初乳逐滴加至50 mL 1%聚乙烯醇溶液(外水相)中，同时行超声处理(100 W，30 s)，形成复乳；转至通风橱内500 r/min磁力搅拌过夜，15 000 r/min离心10 min，弃上清液后PBS清洗 2次，即得到山楂叶总黄酮/聚乳酸羟基乙酸共聚物微球混悬液，放入冷冻干燥机干燥，即可得到药物缓释微球。
1.4.3 负载药物支架的制备将壳聚糖海藻酸盐支架分别放于平底离心管内，加入药物缓释微球混悬液，混合均匀后4 000 r/min离心15 min；弃掉上清液后加入5 mL 10%明胶溶液，2 000 r/min离心10 min；放入真空干燥机中冷冻24 h，即得到负载药物的壳聚糖海藻酸盐复合支架，置于4 ℃冰箱备用。扫描电镜下观察复合支架与药物缓释微球的微观形貌。
1.4.4 脊髓损伤造模与实验分组采用2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠。以 T10-T12棘突为中心作一长 2.0-3.0 cm 的背部正中切口，逐层分离皮肤、韧带和双侧椎旁肌后暴露 T10-T12 棘突和椎板，咬除棘突和椎板，显露T10-T12节段待损伤脊髓。用锋利的无菌刀片横断脊髓并切除1.5 mm。
造模后即刻按照实验分组进行干预，支架组、支架+药物注射组、负载药物支架组分别将壳聚糖海藻酸盐复合支架、壳聚糖海藻酸盐复合支架、负载药物的壳聚糖海藻酸盐复合支架植入脊髓横断处。缝合硬脊膜，逐层关闭皮下与皮肤。每天辅助排尿2次，直至排尿反射恢复。术后观察切口愈合、肢体活动情况。支架+药物注射组术后腹腔注射20 mg/(kg·d)的山楂叶总黄酮，其余3组腹腔注射等量生理盐水。持续注射至实验结束。
1.4.5 大鼠行为学变化术后1，2，4，6，8周时，采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分表与斜板实验评估各组大鼠后肢行为学变化。
BBB评分与斜板实验测试前保证实验动物膀胱均排空，在100 cm×120 cm 的扁平塑料模板上观察大鼠后肢4 min，由2位非实验人员进行独立评分，最后取平均值。该评分范围为0-21分，0分为完全瘫痪，评分越高说明实验动物后肢功能恢复越好。斜板实验时准备一大小为 30 cm×40 cm 的木板，将同样大小的天然橡胶垫置于木板上，将大鼠身体纵轴垂直于模板纵轴放置，不断增加斜板倾斜角度，记录大鼠可维持身体平衡而不从板上摔落的最大倾斜角度。
1.4.6 病理形态观察术后8周时麻醉实验大鼠，按照原切口暴露损伤段脊髓，取出损伤脊髓节段上、下各1 cm的脊髓组织，PBS反复清洗后称质量，取其中一部分进行病理形态学观察，另一部分置于冻存管内液氮保存。将标本置于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，于4 ℃冰箱中保存。所取标本依次经脱水、浸蜡、石蜡包埋后，10 µm切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察损伤部位组织形态学变化。
1.4.7 Western Blot检测利用Western Blot 检测脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白相对表达。取出冻存的脊髓组织，加入预冷的组织蛋白提取液，二者比例为250 mg∶1 mL；置于匀浆器中匀浆，组织完全裂解后12 000 r/min离心20 min；提取总蛋白，采用BCA法检测总蛋白浓度。制备合适浓度的分离胶，加入玻璃间隙中；配制SDS-PAGE浓缩胶，加入分离胶上方；待浓缩胶凝固后放入电泳槽内，加入电泳缓冲液；将实验样品加入样品孔内，样品孔旁边加入蛋白Marker；90 V恒压电泳，待目的蛋白样品在分离胶内达到最佳分离位置时停止电泳；选择适合大小的PVDF膜、转膜，封闭液封闭2 h；取出膜，孵育一抗(兔抗生长相关蛋白43及小鼠抗胶质纤维酸性蛋白、髓磷脂碱性蛋白、神经丝蛋白200、tublin，抗体浓度1∶1 000)与二抗(抗体浓度1∶500)；取出膜，ECL发光显影。
1.5 主要观察指标各组大鼠的运动功能、脊髓组织病理组织形态观察及Western Blot检测结果。
1.6 统计学分析采用统计软件SPSS 21.0进行统计学方面的处理。测试结果数据以x±s的形式表示，组间比较进行单因素方差分析。两两比较的显著性水平设为α=0.05。

讨论

众所周知，脊髓损伤将经历原发性损伤与继发性损伤两个过程，原发性损伤是不可逆的，但是继发性损伤是在初次损伤后发生的大型组织自毁级联反应，损伤程度远高于初次损伤[18]，故而阻止继发性损伤的进展、保护残存脊髓的功能，启动神经轴突再生与神经保护作用是治疗脊髓损伤的重要策略。随着生命科学与材料学的快速发展，脊髓组织工程脊柱为治疗脊髓损伤提供了新的策略。
组织工程是利用细胞生物学与工程学原理，研制与开发修复与改善损伤组织形态和功能的一门学科。自1993年LANGER等[19]首次提出组织工程概念以来，该技术发展迅速、应用广泛，成为修复组织损伤的理想方法。海藻酸盐具有良好的生物相容性、生物黏附性、无毒性与可降解性，已被广泛作为药物载体而进行研究[20-22]。壳聚糖为聚阳离子高分子材料，侧链结构中含有游离氨基，可与海藻酸盐通过正负电荷吸引作用形成聚电解质复合物，改善海藻酸盐单独作为药物载体时药物释放过快及力学性能较差的不足[23-24]。故而，实验选择壳聚糖海藻酸盐复合支架作为山楂叶总黄酮的载体进行脊髓损伤修复实验。

山楂叶总黄酮被广泛用于脑卒中的治疗。研究显示，山楂叶总黄酮可减少神经元丢失及氧化损伤、抑制炎症反应、改善神经元细胞存活；改善线粒体功能，促进新生神经元的增殖、存活与分化及神经可塑性，临床应用前景广阔[25-26]。

查阅国内外文献发现，将山楂叶总黄酮用于脊髓损伤治疗的相关研究较少，例如：ZHANG等[15]采用Allen法建立大鼠脊髓损伤模型，通过腹腔注射5，10，20 mg/kg的山楂叶总黄酮观察治疗作用，神经功能BBB评分、脊髓组织形态学与Western Blot 检测显示，山楂叶总黄酮能减少脊髓损伤大鼠的细胞凋亡，发挥神经保护作用，促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，并且存在剂量依赖关系；付雯雯[27]采用ALLEN’S打击法建立大鼠脊髓中度损伤模型，通过腹腔注射25 mg/kg的山楂叶总黄酮观察治疗作用，神经功能BBB评分、脊髓组织形态、免疫荧光染色、Western-blot和PCR技术检测结果显示，山楂叶总黄酮可以降低炎症因子的表达水平，改善损伤脊髓局部微环境，减少神经细胞的死亡率，增强脊髓轴突再生，加快大鼠运动功能的恢复。但是这些相关研究应用山楂叶总黄酮的给药途径局限于腹腔注射，将其以支架载药成分局部应用于脊髓损伤的报道较少见，并且对于腹腔注射给药与局部应用的效果差异不清楚。实验采用W/O/W法制备山楂叶总黄酮缓释微球，利用壳聚糖海藻酸盐复合支架负载该微球并植入大鼠脊髓损伤处，与腹腔注射给药联合壳聚糖海藻酸盐复合支架治疗方式进行对比。

实验BBB评分与斜板实验显示，植入壳聚糖海藻酸盐复合支架3组大鼠的运动功能恢复情况明显好于损伤对照组，并且该3组相应的病理形态学观察也明显好于损伤对照组，说明壳聚糖海藻酸盐复合支架对脊髓损伤具有一定的修复作用，与郑华斌等[16]、YAO等[28]将壳聚糖海藻酸盐复合支架植入脊髓损伤模型后大鼠后运动功能恢复的结果相似。另外，实验还观察到支架+药物注射组、负载药物支架组大鼠的运动功能与病理形态结果优于支架组，说明山楂叶总黄酮对脊髓损伤修复具有积极的作用，可促进大鼠运动功能的恢复，促进脊髓损伤的修复，并且脊髓损伤区域胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的蛋白表达表现出类似的结果，进一步说明山楂叶总黄酮能够上调神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的表达、降低胶质纤维酸性蛋白表达来促进脊髓损伤的修复。神经丝蛋白200是神经元特有的结构蛋白之一，主要表达于神经元细胞的细胞质和轴突中，其数量可以反映脊髓损伤后轴突损伤和修复程度[29-30]。胶质纤维酸性蛋白是成熟星形胶质细胞的中间纤维蛋白，为细胞骨架蛋白[31-32]。髓磷脂碱性蛋白是中枢神经系统髓鞘的主要蛋白质，位于髓鞘浆膜面，维持中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定，具有神经组织特异性[33-34]。生长相关蛋白43是一种轴突膜蛋白，参与突触发育形成和神经细胞再生[35-37]。需要注意的是，应用药物两组修复脊髓损伤的效果也存在差异，负载药物支架组的修复效果好于支架+药物注射组，说明山楂叶总黄酮虽然对脊髓损伤修复具有促进作用，但是给药途径以局部应用效果更好。作者分析这可能是两种给药方式导致山楂叶总黄酮在体内的药动学差异造成的。腹腔注射给药以门静脉为主要吸收途径，需要通过肝脏再向全身组织分布，需要一定的时间才能达到较佳的药效浓度，但是考虑到首过效应会一定程度地影响局部血药浓度与药效，峰谷效应较明显，所以能够维持药物峰值而发挥作用的时间相对较短。而负载药物支架组中的药物缓释微球能够保证药物随时间缓慢释放，使药物直接在及脊髓损伤区域以局部吸收为主，峰谷效应不明显，能够维持药物峰值而发挥作用的时间相对较长。

综上所述，无论是将山楂叶总黄酮以腹腔注射方式还是局部载药方式联合壳聚糖海藻酸盐复合支架均可促进脊髓损伤的修复，促进大鼠运动功能的恢复，提高脊髓组织中神经丝蛋白200、髓磷脂碱性蛋白、生长相关蛋白43的表达，其中以局部载药方式联合壳聚糖海藻酸盐复合支架的治疗方式效果更显著，为后期研究提供了一定的实验依据。下一步考虑加入种子细胞或生长因子进一步观察修复效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程