负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架修复大鼠脊髓损伤

doi:10.12307/2022.305

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
胶原/硫酸肝素支架：胶原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性与低免疫原性，已被广泛应用于组织损伤修复中，但是其单独应用存在易被吸收、机械性能差等不足。硫酸肝素是存在于细胞表面与细胞间质中的一种线性多糖，是神经基底膜的重要组成成分之一。在神经组织工程支架的制备中以胶原蛋白与硫酸肝素为原料，可高度模拟神经基底膜，有利于神经的再生，并且硫酸肝素可提高胶原蛋白材料的机械强度，为神经再生保持一定的空间结构。
虎杖苷：是中药虎杖的主要成分，主要来源于虎杖干燥的根和茎，为白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，其分子结构中含有3个酚羟基，具有抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、抗血小板聚集、抑制血栓形成、改善微循环、抗休克、保护肝脏、减轻肺损伤、神经保护、镇咳、平喘、免疫调节和保护心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞及抗肿瘤活性等多种药理学作用。

背景：目前关于虎杖苷神经保护作用的研究逐渐成为神经科领域关注的热点，研究方向多集中在缺血性脑血管病方面，在脊髓损伤修复中应用的研究较少。
目的：以胶原/硫酸肝素支架为载体，将虎杖苷局部应用于脊髓损伤部位，观察修复效果。
方法：①制备胶原/硫酸肝素支架与负载0.5，1，1.5 mmol/L虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架，将第3代大鼠神经干细胞分别接种于4种支架上，采用CCK-8法检测细胞增殖情况；在诱导神经干细胞的神经向分化过程中，采用免疫荧光染色与RT-PCR检测胶质纤维酸性蛋白、Tuj-1和Oligo的表达。②建立成年雄性SD大鼠半横切脊髓损伤模型，分3组，模型对照组(n=10)不植入任何材料，对照组(n=10)植入胶原/硫酸肝素支架，实验组(n=10)植入1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架；同时设立假手术组(n=10)。术后8周内，利用BBB评分测试大鼠右后肢运动功能；术后第8周取材，进行脊髓组织学观察、免疫组化分析与Western Blot 检测。
结果与结论：①培养第3，7天时，负载1 mmol/L虎杖苷支架上的细胞增殖吸光度值高于其他3组支架(P < 0.05)。②诱导7 d后的免疫荧光染色显示，负载1，1.5 mmol/L虎杖苷支架组的胶质纤维酸性蛋白表达少于其他两组，Oligo与Tuj-1表达多于其他两组。③RT-PCR检测结果显示，负载1，1.5 mmol/L虎杖苷支架组的胶质纤维酸性蛋白 mRNA表达水平低于其他两组(P < 0.05)，4组间的Tuj-1 mRNA表达水平无明显差异，负载1 mmol/L虎杖苷支架组的Oligo mRNA表达水平高于其他3组(P < 0.05)。④脊髓损伤修复实验显示，实验组术后2-8周的BBB评分始终高于模型对照组与对照组(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示，对照组与观察组脊髓缺损部位被支架填充，组织间的间隙小于模型对照组，其中观察组的组织连续性与组织间隙改善好于对照组；免疫组化与Western Blot 检测显示，实验组的神经丝蛋白200的表达高于对照组、模型对照组(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的表达低于对照组、模型对照组(P < 0.05)。⑤结果表明，负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架可促进脊髓损伤的修复。

https://orcid.org/0000-0002-9910-762X (刘康)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 虎杖苷, 胶原, 硫酸肝素, 支架, 组织工程支架, 生物材料, 脊髓修复, 脊髓损伤

Abstract: BACKGROUND: At present, the research on the neuroprotective effect of polydatin has gradually become a hot spot in the field of neurology. The research direction is mostly focused on ischemic cerebrovascular disease, and there are few studies on the application of spinal cord injury.
OBJECTIVE: With collagen/heparin sulfate scaffold as carrier, polydatin was applied to the injured spinal cord to observe the repair effect.
METHODS: (1) Collagen/heparin sulfate scaffolds and collagen/heparin sulfate scaffolds loaded with 0.5, 1, 1.5 mmol/L polydatin were prepared. The third generation of rat neural stem cells was seeded on four kinds of scaffolds, and the proliferation of cells was detected by CCK-8 assay. During inducing neural differentiation of neural stem cells, the expression levels of glial fibrillary acidic protein, Tuj-1 and Oligo were detected by immunofluorescence staining and RT-PCR. (2) The spinal cord injury model of adult male SD rats was established and divided into three groups. The model control group (n=10) was not implanted with any materials. The control group (n=10) was implanted with collagen/heparin sulfate scaffold, and the experimental group (n=10) was implanted with 1 mmol/L polydatin/collagen/heparin sulfate scaffold. Meanwhile, sham operation group (n=10) was set up. BBB score was used to test the motor function of the right hind limb within 8 weeks after operation. At 8 weeks after operation, the spinal cord tissues were taken for histological observation, immunohistochemical analysis, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 3 and 7 days of culture, the absorbance value of cell proliferation on 1 mmol/L polydatin/collagen/heparin sulfate scaffold was higher than that on the other three scaffolds (P < 0.05). (2) Immunofluorescence staining 7 days after induction showed that the expression of glial fibrillary acidic protein in 1 and 1.5 mmol/L polydatin/collagen/heparin sulfate scaffold groups were less than those in the other two collagen/heparin sulfate scaffold groups, but the expression levels of Oligo and Tuj-1 were more than those in the other two collagen/heparin sulfate scaffold groups. (3) RT-PCR results showed that the expression of glial fibrillary acidic protein mRNA in 1 and 1.5 mmol/L polydatin/collagen/heparin sulfate scaffold groups was lower than that in the other two collagen/heparin sulfate scaffold groups (P < 0.05). There was no significant difference in the expression of Tuj-1 mRNA among the four groups. The expression of Oligo mRNA in 1 mmol/L polydatin/collagen/heparin sulfate scaffold group was higher than that in the other three groups (P < 0.05). (4) Spinal cord injury repair experiments showed that the BBB score of the experimental group was always higher than that of the model control group and the control group 2-8 weeks after operation (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that the spinal cord defects in the control group and the observation group were filled with scaffolds, and the space between the tissues was smaller than that in the model control group. The tissue continuity and space in the observation group were better than those in the control group. Immunohistochemical analysis and western blot assay showed that the expression of neurofilament-200 protein in the experimental group was higher than that in the control group and model control group (P < 0.05). The expression of glial fibrillary acidic protein in the experimental group was lower than that in the control group and model control group (P < 0.05). (5) It is concluded that polydatin loaded collagen/heparin sulfate scaffolds can promote the repair of spinal cord injury.

Key words: polydatin, collagen, heparin sulfate, scaffold, tissue engineering scaffold, biomaterials, spinal cord repair, spinal cord injury

中图分类号:

刘康, 王勇平, 左可斌, 杨海涛, 贾斌. 负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架修复大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4500-4506.

Liu Kang, Wang Yongping, Zuo Kebin, Yang Haitao, Jia Bin. Polydatin loaded collagen/heparin sulfate scaffold in the treatment of spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(28): 4500-4506.

图/表（结果） 10

2.1 制备的胶原/硫酸肝素支架大体观与微观形貌胶原/硫酸肝素支架的大体观与微观形貌见图2，扫描电镜下可见支架内部具有较高的孔隙率，适宜细胞存活。

2.2 神经干细胞在支架上的增殖检测结果由图3可见，培养第1天时，各组细胞增殖无明显差异(P > 0.05)；培养第3，7天时，0.5，1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架上的细胞增殖吸光度值高于胶原/硫酸肝素支架与1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架(P < 0.05)，1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架上的细胞增殖吸光度值高于0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架(P < 0.05)；培养第7天时，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架上的细胞增殖吸光度值低于胶原/硫酸肝素支架(P < 0.05)。

2.3 神经干细胞在支架上的分化检测结果免疫荧光染色显示，各组支架上均可见胶质纤维酸性蛋白、Tuj-1和Oligo蛋白的表达，但是表达水平有一定的差异，1，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的胶质纤维酸性蛋白标记阳性细胞少于胶原/硫酸肝素支架组、0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组，Oligo与Tuj-1标记阳性细胞多于胶原/硫酸肝素支架组、0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组，其中1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的Oligo标记阳性细胞最多，见图4。

进一步的RT-PCR检测结果显示，1，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的胶质纤维酸性蛋白mRNA表达水平低于胶原/硫酸肝素支架组、0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组(P < 0.05)，4组间的Tuj-1 mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05)，1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的Oligo mRNA表达水平高于其他3组(P < 0.05)，见图5。

2.4 虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架的缓释性能实验结果由图6可见，在最初的12-24 h内虎杖苷存在突释现象，3 d之后虎杖苷的释放趋于平稳，至28 d时虎杖苷的累积释放率在62%左右，说明虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架具有一定的缓释性能。

2.5 各组大鼠运动功能的恢复脊髓半横断损伤后，各组大鼠后肢运动和感觉功能丧失；至术后第1周时，各组大鼠后肢运动功能开始恢复，随着术后时间的延长，BBB评分逐渐升高，实验组术后2-8周的BBB评分始终高于模型对照组与对照组(P < 0.05)，对照组术后2-8周的BBB评分始终高于模型对照组(P < 0.05)，见图7。

2.6 各组大鼠脊髓组织学观察结果苏木精-伊红染色显示，假手术组脊髓完整，模型对照组脊髓存在较大的缺损，并且可见组织间存在较大的空隙；对照组与观察组脊髓缺损部位被支架填充，组织间的间隙小于模型对照组，其中观察组的组织连续性好于对照组，并且组织间隙进一步缩小，见图8。

2.7 各组大鼠脊髓免疫组化观察结果免疫荧光染色显示，假手术组脊髓组织内未见明显的胶质纤维酸性蛋白(红色荧光)阳性表达，其余3组均可见胶质纤维酸性蛋白阳性表达，其中以模型对照组表达最强，实验组表达最弱；4组脊髓组织内均可见神经丝蛋白200(绿色荧光)阳性表达，但是组间差异明显，模型对照组仅见微弱的神经丝蛋白200阳性表达，对照组与实验组可见大量的神经丝蛋白200蛋白阳性表达，其中以实验组的神经丝蛋白200阳性表达最接近假手术组，见图9。

2.8 各组大鼠脊髓组织Western blotting检测结果与假手术组比较，模型对照组的神经丝蛋白200的蛋白表达显著降低(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达显著升高(P < 0.05)；与模型对照组比较，对照组与实验组的神经丝蛋白200的蛋白表达显著升高(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与对照组比较，实验组的神经丝蛋白200的蛋白表达显著升高(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达显著降低(P < 0.05)，见图10。

2.9 支架的生物相容性由细胞增殖与分化实验及体内修复实验可知，胶原/硫酸肝素支架与负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架具有良好的生物相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，体内动物实验，组间比较采用one-way ANOVA分析方法。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年6月在甘肃中医药大学完成。
1.3 材料
1.3.1 主要药物与试剂硫酸肝素(南京赛泓瑞生物科技有限公司)；虎杖苷(南京广润生物制品有限公司)；DMEM/F12培养基(尚恩生物技术有限公司)；CCK-8溶液(上海富衡生物科技有限公司)；Tuj-1荧光抗体、GFAP荧光抗体、Oligo荧光抗体(艾美捷科技有限公司)；Prime Script™RT-PCR反转录盒(北京麦瑞博生物科技有限公司)；小鼠抗GFAP、兔抗NF-200、tublin(南京金斯瑞生物科技有限公司)。
1.3.2 主要仪器与设备 DNM-9602酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；ZNCL-S-5D磁力搅拌器(上海越众仪器设备有限公司)；Nikon A1激光共聚焦显微镜(上海材料与制造大型仪器区域中心)；石蜡切片机(济南千司生物技术有限公司)；离心机(湖南平凡科技有限公司)。
1.3.3 实验动物成年雄性SD大鼠30只，购自兰州市食品药品检验检测研究院，使用许可证号：SYXK(甘)2019-0001。
1.4 方法
1.4.1 制备胶原/硫酸肝素支架参考曹宗锐等[18]实验中的方法制备胶原/硫酸肝素支架，简要方法如下：将市售的新鲜牛腱粉碎后浸泡于0.05 mol/L Tris缓冲液中12 h；离心后收集沉淀物，加入含有胃蛋白酶的乙酸溶液充分溶解沉淀物；离心收集上清，加入3.5 mol/L NaCl溶液混匀后收集沉淀物，透析后获得I型胶原蛋白。在50 mL乙酸溶液(0.05 mol/L)中加入1 g的I型胶原蛋白与50 mg的硫酸肝素，磁力搅拌约30 min，置于4 ℃冰箱过夜；将混合溶液置于紫外线光下15 min下进行交联反应；置于真空冷冻干燥机中冻干2 d，依次进入1%NaOH溶液、去离子水中分别浸泡12，48 h。⁶⁰Co灭菌备用。
1.4.2 制备负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架将胶原/硫酸肝素支架分别浸入0.5，1，1.5 mmol/L的虎杖苷溶液中，4 ℃孵育24 h，制备负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架。
1.4.3 体外实验
神经干细胞在支架上的增殖：将胶原/硫酸肝素支架与负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架分别置于24孔板底，将第3代大鼠神经干细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×104的密度接种于24孔板内，同时每孔加入200 µL含2%B27、20 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 µg/L表皮生长因子的 DMEM/F12培养基。培养1，3，7 d后去除原培养基，每孔加入CCK-8 溶液50 µL继续培养2 h，利用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。
神经干细胞在支架上的分化：将胶原/硫酸肝素支架与负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架分别置于6孔板底，将第3代大鼠神经干细胞以4×105的密度接种于6孔板内，同时每孔加入含体积分数2%胎牛血清、2%B27、2%链霉素-青霉素抗生素的 DMEM/F12培养基。诱导培养7 d后进行免疫荧光染色与RT-PCR检测。
免疫荧光染色：利用免疫荧光染色观察各组细胞胶质纤维酸性蛋白、Tuj-1和Oligo蛋白的表达，简要步骤如下：吸出各孔内的培养基，将40 g/L多聚甲醛2 mL加入各孔中固定24 h；吸出多聚甲醛，PBS清洗，加入体积分数5%山羊血清孵育30 min；吸出山羊血清，向500 µL的一抗(Tuj-1荧光抗体、胶质纤维酸性蛋白荧光抗体、Oligo 荧光抗体，稀释度为1∶200)加入各孔中，4 ℃孵育12 h；吸出一抗后PBS清洗3次，将500 µL的荧光染色二抗加入各孔内，37 ℃孵育1 h；吸出二抗溶液后PBS清洗3次，将500 µL的DAPI溶液加入各孔内孵育5 min；吸出DAPI溶液，激光共聚焦显微镜下观察。

RT-PCR检测：利用RT-PCR检测各组细胞胶质纤维酸性蛋白、Tuj-1和Oligo mRNA的表达。吸去各孔中的培养基，抽提细胞RNA，检测RNA的浓度与纯度，利用Prime Script™RT-PCR反转录盒反转录合成cDNA，反应体积为10 µL。以反转录所得 cDNA 作为模板，用不同引物序列进行扩增。PCR 扩增条件为：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，95 ℃30 s，40个循环。结果采用2-ΔΔCt法分析数据，分析各组 mRNA表达水平。扩增引物序列见表1。

1.4.4 负载虎杖苷胶原/硫酸肝素支架的缓释性能根据体外实验结果，选择适宜的虎杖苷浓度进行缓释性能实验。将0.1 g的1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架放入24孔板内，加入人工模拟体液1 mL，于6，12，24 h 及 3，7，14，21，28 d 收集人工模拟体液，12 000 r/min离心10 min，经 0.22 μm 滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪检测虎杖苷浓度，计算药物累积释放率。每个测试点之后重新加入新鲜的PBS。
1.4.5 体内实验
脊髓损伤造模与分组处理：取成年雄性SD大鼠30只，腹腔注射30 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉，背部备皮后俯卧位固定于手术台上，消毒术区，无菌条件下取后正中切口逐层切开3 cm左右，钝性分离肌肉后咬除T9-T11棘突及相应椎板，显露T9-T11脊髓，切开硬脊膜，切除右侧3 mm长度脊髓组织。假手术组(n=10)大鼠仅暴露脊髓，未给予切除操作。将造模后的大鼠随机分为3组：模型对照组不植入任何材料，对照组植入胶原/硫酸肝素支架，实验组植入1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架，逐层缝合，见图1。等待动物苏醒。术后分笼饲养。

动物行为学检测：术后1，3，5 d及1，2，3，4，5，6，7，8周时，采用BBB评分评估大鼠的运动功能[19]。将大鼠放入纸板实验箱内4 min，轻敲板壁，使其自由爬行，观察损伤动物右后肢3个关节踝关节、膝关节、髋关节的活动范围和灵活程度，躯干运动及整体协调情况。所得评分越高说明大鼠运动功能恢复越好。
脊髓组织学观察：术后8周时，麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，取T7-T11节段脊髓组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，脱水处理后制作冰冻切片(切片厚度6 µm)，苏木精-伊红染色后显微镜下观察。
免疫组化观察：利用免疫组化染色分析脊髓组织胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200的表达。将冰冻切片室温放置30 min，丙酮固定10 min，PBS清洗3次；体积分数3%过氧化氢孵育10 min，PBS清洗2次；体积分数10%正常山羊血清室温孵育 10 min；倾去血清，分别滴加适当比例稀释的小鼠抗-胶质纤维酸性蛋白(1∶200)、兔抗-神经丝蛋白200(1∶500)，37 ℃孵育 1 h；PBS冲洗3次，滴加适当比例稀释的二抗，37 ℃孵育 10 min，PBS冲洗3次，镜下观察。
Western Blot检测：利用Western Blot检测脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200的蛋白相对表达。取出冻存的脊髓组织，加入预冷的组织蛋白提取液，二者比例为250 mg∶1 mL；置于匀浆器中匀浆，组织完全裂解后12 000 r/min离心20 min；提取总蛋白，采用BCA法检测总蛋白浓度。制备合适浓度的分离胶，加入玻璃间隙中；配制SDS-PAGE浓缩胶，加入分离胶上方；待浓缩胶凝固后放入电泳槽内，加入电泳缓冲液；将实验样品加入样品孔内，样品孔旁边加入蛋白Marker；90 V恒压电泳，待目的蛋白样品在分离胶内达到最佳分离位置时停止电泳；选择适合大小的PVDF膜、转膜，封闭液封闭2 h；取出膜，孵育一抗(小鼠抗胶质纤维酸性蛋白、兔抗神经丝蛋白200、tublin，抗体浓度1∶1 000)与二抗(抗体浓度1∶500)；取出膜，ECL发光显影。
1.5 主要观察指标负载虎杖苷胶原/硫酸肝素支架对神经干细胞增殖与分化的影响，以及负载虎杖苷胶原/硫酸肝素支架修复神经损伤的效果。
1.6 统计学分析数据以x±s表示。组间比较采用one-way ANOVA分析方法，P < 0.05为差异有显著性意义。采用统计学软件SPSS 21.0进行数据分析处理。

讨论

脊髓损伤后的组织凋亡性空洞会在损伤部位形成大量的胶质瘢痕，阻碍轴突的生长及神经细胞的定向迁移，进而阻碍神经结构与功能的恢复[20-21]，天然或是人工的材料可用来填充凋亡性空洞，促进损伤的修复。胶原蛋白作为一种天然聚合物具有良好的生物降解性、生物相容性与低免疫原性，已被广泛应用于骨、肌腱、神经、凝胶与烧伤等组织损伤修复中[22-24]，但是其单独应用存在易被吸收、机械性能差等不足，限制了其应用。硫酸肝素是存在于细胞表面与细胞间质中的一种线性多糖，是神经基底膜的重要组成成分之一，而神经基底膜在神经再生中具有重要作用。同时，硫酸肝素可结合多种蛋白质配体(如碱性成纤维细胞生长因子)来调节多种生物活性，包括发育过程、血管生成、血液凝固和肿瘤转移[25]。因此，在神经组织工程支架的制备中以胶原蛋白与硫酸肝素为原料，可高度模拟神经基底膜，有利于神经的再生，并且硫酸肝素可提高胶原蛋白材料的机械强度，为神经再生保持一定的空间结构。目前，胶原/硫酸肝素支架作为神经组织工程支架已被用于周围神经、脊髓和脑损伤的修复。

虎杖苷为白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，属于羟基二苯乙烯类化合物，可通过增强自噬、抗凋亡改善大鼠局灶性脑缺血/再灌注脑组织损伤[26-27]，通过调节原代神经元线粒体和胞浆凋亡蛋白的表达在氧糖剥夺损伤细胞模型中抑制细胞凋亡；另外体外实验显示，虎杖苷可促进间充质干细胞分化为神经元样细胞[28-30]。

为进一步提高虎杖苷的作用效果，将其复合于胶原/硫酸肝素支架中，制备了含不同浓度虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架，首先进行了体外细胞实验，结果显示：相比于单独的胶原/硫酸肝素支架，负载0.5，1.0 mmol/L虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架更有利于神经干细胞的增殖，而负载1.5 mmol/L虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架抑制了细胞的增殖，说明一定浓度范围内的虎杖苷可促进神经干细胞的增殖，过高浓度的虎杖苷不利于神经干细胞的增殖。在诱导神经干细胞分化的实验中发现，1，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的胶质纤维酸性蛋白表达均低于单独的胶原/硫酸肝素支架，虎杖苷能够抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化，并且存在一定的浓度依赖性；1，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的Oligo蛋白表达多于胶原/硫酸肝素支架组、0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组，说明一定浓度范围内的虎杖苷能够促进神经干细胞向少突胶质细胞分化；同时，1，1.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组的Tuj-1蛋白表达高于胶原/硫酸肝素支架组、0.5 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组，说明虎杖苷也可促进神经干细胞向神经元的分化。星形胶质细胞可在损伤局部形成胶质瘢痕，阻碍神经传导通路的重建，不利于脊髓损伤功能的恢复[31-33]。少突胶质细胞作为一种神经支持细胞能够合成分泌髓鞘相关蛋白，促进轴突再生，促进神经功能的恢复[34-35]。进一步的RT-PCR检测结果显示，虎杖苷可呈浓度依赖性降低星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白基因的表达，一定浓度的虎杖苷可促进少突胶质细胞Oligo基因的表达，说明虎杖苷可抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化，促进其向少突胶质细胞分化。综合细胞增殖实验与神经诱导分化实验结果，作者认为1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架更适宜用于动物脊髓损伤修复实验。

体外缓释实验显示，胶原/硫酸肝素支架可作为虎杖苷的载体，体外可持续释放虎杖苷至少28 d。为了进一步评价1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架的体内应用效果，实验构建了大鼠脊髓损伤模型，将单独的胶原/硫酸肝素支架与1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架分别植入损伤部位，BBB评分显示，单独植入胶原/硫酸肝素支架也可促进大鼠后肢运动功能的恢复，而植入1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架促进后肢运动功能恢复的作用更强。术后8周的苏木精-伊红染色结果显示，植入1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架组脊髓损伤部位的组织连续性与缩小损伤后空洞方面优于单独的胶原/硫酸肝素支架，说明1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架为细胞黏附与生长提供了更加良好的环境。免疫荧光与Western blotting检测结果显示，植入单独的胶原/硫酸肝素支架与1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架均可降低损伤脊髓组织内胶质纤维酸性蛋白的表达、提高神经丝蛋白200的表达，而相较于植入单独的胶原/硫酸肝素支架，植入1 mmol/L虎杖苷/胶原/硫酸肝素支架的作用更加显著。神经丝蛋白200是神经元特有的结构蛋白，主要存在于轴突中，脊髓损伤后轴突变形、坏死，神经丝蛋白200表达量减少[36-37]。在脑组织损伤或者局部缺血后，中枢神经系统内源性神经干细胞被激活并向损伤灶迁移，在神经损伤灶处分化为神经元和胶质细胞，促进神经元突触的延伸以及再生纤维与“靶”间建立突触连接和功能重塑，从而形成有效的神经接力网络，但是由于损伤局部微环境不利于神经干细胞的存活与分化，使得神经修复效果较差[38-40]。实验利用虎杖苷调控细胞的增殖与分化，为神经干细胞的增殖与分化提供了良好的微环境。由以上结果可知，单纯植入胶原/硫酸肝素支架可为内源性神经干细胞的移植与分化提供良好的空间，同时填补脊髓损伤部位的空洞，保证了组织的连续性，提供了神经再生修复的物理条件，抑制了胶质瘢痕的形成，从而一定程度促进了脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复。当胶原/硫酸肝素支架负载虎杖苷后植入脊髓损伤部位，随着植入时间的延长，虎杖苷缓慢的从支架中释放，促进内源性神经干细胞增殖并分化为神经元细胞，进一步抑制胶质瘢痕的形成，使得脊髓损伤大鼠的运动功能恢复优于植入胶原/硫酸肝素支架组，说明虎杖苷的加入更加有利于神经功能的恢复。另外，虎杖苷还具有抗氧化应激作用，推测虎杖苷可能通过抑制炎症反应抑制了胶质瘢痕的形成，促进了神经的恢复，但是该推断还有待进一步的研究验证。实验使用的对象为大鼠，大鼠的解剖结构与人体存在较大的差异，后期可选择较大型的哺乳动物进行实验，观察其对脊髓损伤修复的效果。同时，实验选择的胶原/硫酸肝素支架是否为虎杖苷的最佳载体仍需要进一步的研究来证实，未来将制备不同类型的复合支架，以期获得更好的临床疗效。

综上所述，将虎杖苷负载于胶原/硫酸肝素支架中具有良好的缓释作用与生物相容性，可促进神经干细胞的增殖及向神经元与少突胶质细胞的分化，抑制神经干细胞向星形胶质细胞的分化，有利于神经纤维再生与连接；将该支架植入大鼠脊髓损伤部位，可提供良好的结构支撑与局部微环境，促进脊髓损伤的修复，改善大鼠肢体运动功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程