CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达

doi:10.12307/2022.561

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3826-3832.doi: 10.12307/2022.561

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达

向明芝1，2，袁紫林2，3，王刚2，3，程洁2，4，刁波2，3，刘跃平2，3

1武汉科技大学医学院，湖北省武汉市 430081；2中部战区总医院基础医学实验室，湖北省武汉市 430070；3中枢神经系统肿瘤发生与干预湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430070；4南方医科大学第一临床医学院，广东省广州市 510515

收稿日期:2021-01-28 接受日期:2021-03-04 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 刁波，博士，副教授，中部战区总医院基础医学实验室，湖北省武汉市 430070；中枢神经系统肿瘤发生与干预湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430070 刘跃平，硕士，副主任技师，中部战区总医院基础医学实验室，湖北省武汉市 430070；中枢神经系统肿瘤发生与干预湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430070
作者简介:向明芝，女，1992年生，湖南省古丈县人，土家族，武汉科技大学在读硕士，医师，主要从事肿瘤、免疫研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81971478，81771691)，项目参与人：刁波

CD1d-mediated inhibition of the nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammatory factor expression via signal regulatory protein-alpha

Xiang Mingzhi1, 2, Yuan Zilin2, 3, Wang Gang2, 3, Cheng Jie2, 4, Diao Bo2, 3, Liu Yueping2, 3

1Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, Hubei Province, China; 2Basic Medical Laboratory, General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; 3Hubei Key Laboratory of Central Nervous System Tumor and Intervention, Wuhan 430070, Hubei Province, China; 4First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangzhou Province, China

Received:2021-01-28 Accepted:2021-03-04 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Diao Bo, MD, Associate professor, Basic Medical Laboratory, General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; Hubei Key Laboratory of Central Nervous System Tumor and Intervention, Wuhan 430070, Hubei Province, China Liu Yueping, Master, Associate chief technician, Basic Medical Laboratory, General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; Hubei Key Laboratory of Central Nervous System Tumor and Intervention, Wuhan 430070, Hubei Province, China
About author:Xiang Mingzhi, Master candidate, Physician, Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, Hubei Province, China; Basic Medical Laboratory, General Hospital of Central Theater Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81971478, No. 81771691 (to DB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
NLRP3炎性因子：是含核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)样受体(NOD like receptors，NLRs)家族的一员，负责识别病原相关分子模式介导免疫炎性反应，也是作用最广泛的炎性因子。
CD1d：高表达于自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫细胞的一种分子，其结构与MHC-Ⅰ类分子相似，为免疫细胞提呈脂质，扮演激活免疫机制及促进炎性递质释放等多种角色。
信号调节蛋白α(signal-regulatory protein α，SIRPα)：主要由髓系细胞表达的质膜蛋白，并且含有与抑制性免疫受体酪氨酸抑制基序一致的酪氨酸残基，信号调节蛋白α通过磷酸化及与磷酸酶SHP2/SHP1结合诱导特征明确的抑制信号，是公认的抑制性膜受体蛋白。

背景：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性因子被证实与多种炎症性疾病相关，调控其表达将成为治疗相关疾病的关键。
目的：验证CD1d参与了调控NLRP3炎性因子表达，并且进一步证明CD1d是通过信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)来达到调控目的。
方法：①使用Flag-CD1d、HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染293T细胞进行免疫共沉淀实验，验证CD1d与SIRPα的相互作用；②使用Flag-CD1d慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞，RT-qPCR检测NLRP3等基因表达；③使用HA-SIRPα慢病毒过表达载体转染RAW264.7细胞，在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达；④使用SIRPα慢病毒RNAi载体转染RAW264.7细胞，在脂多糖刺激后RT-qPCR、Western blot检测NLRP3等基因和蛋白表达。
结果与结论：①免疫共沉淀实验证实CD1d与SIRPα存在相互作用；②过表达CD1d基因后，NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显低于正常组(P < 0.05)；③在脂多糖刺激后过表达SIRPα组NLRP3基因表达明显低于正常组(P < 0.05)；pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达与正常组差异无显著性意义(P > 0.05)；过表达SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显低于SIRPα干扰组(P < 0.01)；④脂多糖刺激后干扰SIRPα组NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达明显高于正常组(P < 0.05)；干扰SIRPα组p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达明显高于过表达SIRPα组(P < 0.01)；⑤结果表明，CD1d与细胞膜上SIRPα形成复合物，通过SIRPα抑制下游p38MAPK/NF-κB通路，最终达到抑制NLRP3等炎性因子表达的目的。
缩略语：核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3：nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3；信号调节蛋白α：signal regulatory protein-α，SIRPα

https://orcid.org/0000-0003-2741-9031 (向明芝)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: CD1d, 信号调节蛋白α, NLRP3, 炎性因子, p38MAPK, NF-κB, 通路

Abstract: BACKGROUND: Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammatory factors have been proven to be associated with a variety of inflammatory diseases, and regulating their expression will provide some insights into the treatment of related diseases.
OBJECTIVE: To explore whether CD1d regulates the expression of NLRP3 inflammatory factors so as to verify the underlying mechanism that CD1d regulates the NLRP3 inflammasomes expression via signal regulatory protein-α (SIRPα).
METHODS: (1) 293T cells were transfected with Flag-CD1d and HA-SIRPα lentivirus overexpression vectors for co-immunoprecipitation assay to verify the interaction between CD1d and SIRPα. (2) RAW264.7 was transfected with the Flag-CD1d lentiviral overexpression vector. RT-qPCR was used to detect the expression of NLRP3 and other genes. (3) RAW264.7 was transfected with the overexpression vector of HA-SIRPα lentivirus. The gene and protein expression levels of NLRP3 were detected by RT-qPCR and western blot assay, respectively. (4) SIRPα lentivirus RNAi vector was used to transfect RAW264.7. After lipopolysaccharide stimulation, gene and protein expression levels of NLRP3 were detected by RT-qPCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Co-immunoprecipitation assay confirmed the interactions between CD1d and SIRPα. (2) After overexpression of CD1d gene, the expression levels of NLRP3, pro-IL-1β and pro-IL-18 gene in the experimental group were significantly lower than those in the normal group (P < 0.05). (3) The expression of NLRP3 in the experimental group was significantly lower than that in the normal group after lipopolysaccharide stimulation (P < 0.05), but there were no differences in the expression of pro-IL-1β and pro-IL-18 between the experimental group and the control group (P > 0.05). The protein expression of p38, P-P38, NLRP3, pro-IL-1β and pro-IL-18 in the experimental group was significantly lower than that in the SIRPα interference group (P < 0.01). (4) The expression of NLRP3, pro-IL-1β, and pro-IL-18 gene in the experimental group was significantly higher than that in the normal group after lipopolysaccharide stimulation (P < 0.05). The protein expression of p38, p-p38, NLRP3, pro-IL-1β, and pro-IL-18 in the experimental group was significantly higher than that in the overexpression SIRPα group (P < 0.01). (5) It is concluded that CD1d forms a complex with SIRPα on the cell membrane, then inhibits the downstream p38MAPK/NF-κB pathway via SIRPα, and finally inhibits the expression of NLRP3 inflammatory factors.

Key words: CD1d, signal regulatory protein-α, NLRP3, inflammatory factor, p38MAPK, NF-κB, pathway

中图分类号:

向明芝, 袁紫林, 王刚, 程洁, 刁波, 刘跃平. CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3826-3832.

Xiang Mingzhi, Yuan Zilin, Wang Gang, Cheng Jie, Diao Bo, Liu Yueping. CD1d-mediated inhibition of the nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammatory factor expression via signal regulatory protein-alpha[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3826-3832.

图/表（结果） 9

2.1 慢病毒构建及验证
2.1.1 慢病毒载体构建及病毒包装将目的基因CD1d、SIRPα和SIRPα-RNAi干扰序列克隆至pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-puromycin、pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puromycin、GV493载体质粒。如图1A所示，质粒pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-puromycin在1-952的位置与CD1d目的基因序列完全一致；如图1B所示，质粒pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-puromycin在1-1288位置与SIRPα目的基因序列完全一致；如图1C所示，GV493质粒序列中含有与设计的SIRPα-RNAi干扰序列(CCG GGC AAG CAT TGA GAC AGG CAA ACT CGA GTT TGC CTG TCT CAA TGC TTG CTT TTT g)完全一致。以上说明慢病毒载体构建成功，可用于后续实验。

2.1.2 慢病毒构建验证
(1)荧光显微镜下观察慢病毒感染细胞的GFP荧光标记情况：生长状态良好的293T细胞、RAW264.7细胞，慢病毒感染48 h后，荧光显微镜下观察结果：添加目的基因实验组及阴性载体对照组，因有GFP标记，所以镜下可见绿色荧光。根据公式(病毒感染率=荧光细胞数/明视野细胞数×100% )计算感染率。①如图2所示，过表达CD1d组病毒感染率为(85.462±1.316)%；过表达SIRPα组病毒感染率为(86.593±1.928)%；过表达CD1d+SIRPα共感染组病毒感染率为(79.724±1.731)%；阴性对照组病毒感染率为(80.219±1.579)%。空白对照组因未添加目的基因片段，无荧光标记，所以荧光显微镜下无绿色荧光。②如图3所示，过表达SIRPα组病毒感染率为(76.872±1.740)%；SIRPα-RNAi干扰组病毒感染率为(78.371±1.327)%；阴性对照组病毒感染率为(77.825±1.147)%。空白对照组无绿色荧光。结果提示目的基因成功感染至细胞中，可以进行下一步实验。

(2)RT-qPCR和Western blot检测基因及蛋白表达验证慢病毒感染情况：过表达CD1d、过表达SIRPα和SIRPα-RNAi干扰慢病毒感染细胞72 h后，结果如图4所示，过表达CD1d组CD1d mRNA及蛋白表达水平较对照组明显升高(mRNA：P < 0.001；蛋白：P < 0.001)；如图5所示，过表达SIRPα组SIRPα mRNA及蛋白表达水平较对照组显著升高(mRNA：P=0.002；蛋白：P=0.001)；SIRPα-RNAi干扰组SIRPα mRNA及蛋白表达水平较对照组显著下降(mRNA：P < 0.001；蛋白：P=0.001)。综上所述，慢病毒转染后达到靶向调控目的基因及蛋白的作用，成功构建过表达CD1d、过表达SIRPα和SIRPα-RNAi干扰慢病毒。

2.2 免疫共沉淀证实CD1d与SIRPα相互作用如图6所示，Input阳性对照显示各细胞裂解液中含有相应蛋白；Output显示在含有两种蛋白的裂解液中下拉CD1d蛋白后可检测出SIRPα蛋白，证实了CD1d与SIRPα两蛋白之间存在相互作用。

2.3 过表达CD1d组及正常组RAW264.7细胞中NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达如图7所示，过表达CD1d组RAW264.7细胞NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18的表达水平较正常组RAW264.7细胞显著降低(NLRP3：P=0.038；pro-IL-1β：P=0.012；pro-IL-18：P=0.031)。

2.4 调控SIRPα基因表达后对下游基因及蛋白的影响 RT-qPCR实验结果显示，脂多糖刺激后，SIRPα-RNAi干扰组NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达水平较对照组明显升高(NLRP3：P < 0.001； pro-IL-1β：P=0.019；pro-IL-18：P=0.001)；过表达SIRPα组NLRP3基因表达水平较对照组明显降低(P=0.011)，但pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达水平较对照组无明显差异(pro-IL-1β：P=0.728；pro-IL-18：P=0.064)，见图8，说明SIRPα基因能负向调控NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示RT-qPCR扩增产物电泳条带位置与目的产物长度相符。

Western blot实验结果表明，SIRPα-RNAi干扰组p38，p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达水平较过表达SIRPα组显著升高(p38：P < 0.001；p-p38：P=0.003；NLRP3：P=0.007；pro-IL-1β：P=0.002；pro-IL-18：P=0.003)，见图9，表明SIRPα能负向调控下游p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达。

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引言

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性因子是固有免疫重要的组成部分。在防御病原体入侵人体过程中NLRP3炎性因子作为胞浆型模式识别受体能快速识别抗原相关分子模式激活并组装成NLRP3炎性小体(NLRP3、pro-Caspase-1和ASC蛋白复合物)。pro-IL-1β/pro-IL-18等无活性的炎性递质在NLRP3炎性小体作用下成熟并分泌胞外[1]，以应对微生物感染和细胞损伤。但NLRP3炎性因子在体内的过度表达与蓄积则会加剧炎症性疾病的进程，已证实NLRP3炎性因子与多种炎性疾病相关，如病毒性重型肝炎、2型糖尿病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、炎性肠病(包括克罗恩、溃疡性结肠炎)、肺炎链球菌感染和脑出血神经炎症等[2-6]，所以负性调控NLRP3炎性因子的表达能为相关炎性疾病提供治疗方向。目前NLRP3炎性因子的表达调控机制尚不完全明确。
CD1d分子是自然杀伤细胞及巨噬细胞等免疫细胞分泌的一种结构类似组织相容性复合体Ⅰ类分子，它通过提呈脂质，激活相关免疫反应[7]。大量研究证明巨噬细胞(NLRP3小体加工及活化的主要场所)表达的CD1d分子能抑制NLRP3等炎性递质的表达，敲除CD1d基因(CD1d-/-)小鼠的溃疡性肠炎症状较正常组明显加剧[8-9]。CUI等[10]进一步表明iGB3/CD1d1启动了反馈信号，抑制p38-MAPK磷酸化，且导致NF-κB自身的RELA通路及NF-κB依赖的JunB和ELK-1信号通路的转录被抑制，从而下调巨噬细胞中NLRP3、白细胞介素1β和白细胞介素18的表达。作者通过建立基于泛素裂解的酵母双杂交技术发现CD1d能与信号调节蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)直接相互作用。SIRPα又被称为非受体类型底物1(non-receptor type substrate 1，PTPNS1)、含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶底物1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase substrate 1，SHPS1)、CD172A或 P84，是SIRP家族中典型的抑制性膜蛋白[11-12]。SIRPα含有与抑制性免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs)一致的酪氨酸残基，而介导SIRPα与蛋白酪氨酸磷酸酶2(phosphatase SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP2)的联系，同时在胞质区域有4个酪氨酸残基是潜在的磷酸化位点，通过磷酸化诱导特征明确的抑制信号[11]。在肿瘤细胞免疫逃逸机制中，CD47在各种类型的实体瘤中呈高表达，与SIRPα形成信号复合体，使这些癌细胞逃脱巨噬细胞介导的吞噬[13]，也参与调节多种髓系细胞的活性，特别是CD8+T细胞[14]。抑制巨噬细胞的吞噬作用似乎由下游招募的SHP-1/SHP-2激酶介导[15]。同时，SIRPα通过负调控p38-MAPK、NF-κB而降低COX-2和细胞因子的表达，该通路与CD1d模式一致。此研究主要验证CD1d参与调控NLRP3炎性因子表达，并且进一步证明CD1d是通过SIRPα来达到调控目的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，两组数据间比较采用独立样本t检验，多组数据间比较采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年1月至2021年1月在中部战区总医院基础医学实验室及中枢神经系统肿瘤发生与干预湖北省重点实验室完成。
1.3 材料脂多糖(美国Sigma-Aldrich公司，货号L2630)；核酸染料(北京索莱宝科技有限公司，货号：G5560)；TAE Buffer[生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B548101-0500]；琼脂糖(北京百奥斯科生物技术有限公司，货号：MD912987)；293T细胞株(武汉大学细胞库)；RAW264.7细胞株(北京百奥斯科生物技术有限公司)；p38MAPK抗体(武汉Protintech公司，批号：14064-1-AP)；CD1d抗体(武汉Protintech公司，批号：17336-1-AP)；pro-IL-18抗体(武汉Protintech公司，批号：60070-1-lg)；GAPDH抗体(武汉Protintech公司，批号：60004-1-lg)；FLAG抗体(武汉Protintech公司，批号：20543-1-AP)；HA抗体(武汉Protintech公司，批号：51064-2-AP)；pro-p38抗体(美国Abcam公司，批号：ab178867)；NLRP3抗体(美国Abcam公司，批号：ab214185)；pro-IL-1β抗体(美国Affinity Biosciences公司)；Trizol(美国Invitrogen公司，货号：15596026)；RIPA裂解液(北京酷来搏科技有限公司，货号：SL1010)；rProtein A Beads琼脂糖珠(武汉勤致杰生物科技有限公司，货号：SA015005)；Re-vertAid Reverse Transcriptase Kit试剂盒(美国Thermoscientific公司)；荧光定量试剂盒(美国KAPA BIOSYSTEMS公司)；pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-puromycin、pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puromycin、pSPAX2、pMD2G质粒[汉恒生物科技(上海)有限公司]；GV493、Helper 1.0、Helper 2.0质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
1.4 实验方法
1.4.1 慢病毒载体构建及病毒包装将过表达CD1d、SIRPα基因序列分别构建到穿梭质粒pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-puromycin、pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puromycin上，采用汉恒的LipofiterTM转染试剂将三质粒(psPAX2 10 μg、pMD2G 5 μg和穿梭质粒10 μg)共转染293T细胞。将SIRPα-RNAi干扰序列构建到穿梭质粒GV493上，采用吉凯转染试剂将三质粒(GV493载体质粒20 μg、pHelper 1.0载体质粒15 μg、pHelper 2.0载体质粒10 μg)共转染293T细胞，转染后48 h分别收集病毒上清液，采用超速离心(4 ℃ 82 700×g离心120 min)的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，进行基因测序。
1.4.2 验证慢病毒是否构建成功采用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基复苏293T细胞，并在体积分数为5%CO2、95%湿度、37 ℃的恒温培养箱中培养；待细胞密度达到80%，使用3%EDTA胰蛋白酶消化，1∶3比例进行传代。待细胞状态良好，收集细胞接种至6孔板，细胞浓度为1×105 L-1，过表达CD1d组进行慢病毒感染。采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基复苏小鼠巨噬细胞RAW264.7，培养条件同上，接种6孔板后过表达SIRPα、SIRPα-RNAi干扰慢病毒分别感染，48，72 h后荧光显微镜下观察转染情况，并收集细胞进行反转录-定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)及蛋白质印迹(Western blot)检测基因及蛋白表达。
1.4.3 免疫共沉淀实验验证CD1d与SIRPα相互作用将293T细胞分成3组，即过表达CD1d组、过表达SRIPα组，过表达CD1d+SRIPα共感染组。用过表达CD1d、SRIPα慢病毒分别感染72 h后收集各组细胞，1 mL RIPA工作液制备细胞裂解液，一部分蛋白进行Western blot实验(Input)，另一部分蛋白加入FLAG抗体(CD1d携带的标签)室温孵育2 h，再加入Protein A琼脂糖珠(100 mL/L)捕捉抗原抗体复合物，收集沉淀后的蛋白用SIRPα抗体进行Western blot实验(Output)。

1.4.4 RT-qPCR检测过表达CD1d后NLRP3等mRNA的表达收集过表达CD1d慢病毒感染72 h后的RAW264.7细胞，分为过表达CD1d组及正常组。使用Trizol法提取总RNA，检测A260/A280的比值和样品浓度，采用反转录试剂盒将RNA反转录成模板cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增(PCR设置条件：95 ℃ 180 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环)。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算NLRP3、pro-IL-1β/pro-IL-18相对表达量。所用引物序列见表1。

1.4.5 琼脂糖凝胶电泳验证RT-qPCR产物称取1 g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入100 mL×TAE Buffer稀释缓冲液，放入微波炉里加热2 min，取出加入10 μL 10 000×SolarRed核酸染料，上样电泳(电压：160 V，电流：184 mA，时间：30 min)，凝胶成像分析仪紫外灯波长302 nm，拍照。根据引物计算扩增产物大小，比对电泳条带是否与目的产物相符。
1.4.6 调控SIRPα后RT-qPCR、Western blot检测下游因子表达过表达SIRPα、SIRPα-RNAi干扰慢病毒感染RAW264.7细胞，分为过表达SIRPα组、SIRPα-RNAi干扰组及正常组， 48 h后加入嘌呤霉素(2 g/L)筛选稳转细胞株，最后使用脂多糖(2 mg/L)分别刺激各组细胞0，12，24 h，用预冷PBS洗涤细胞2遍，加入100 μL RIPA工作液冰上裂解30 min，离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)后取上清即为提取的总蛋白，上清中加入5×蛋白上样缓冲液沸水中变性5 min，配置15%SDS-PAG分离胶电泳(条件：80 V，30 min；120 V，90 min)。
将分离胶条带转印至PVDF膜(条件：150 mA，70 min)，5%脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗孵育过夜(p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18、GAPDH)，TBST洗膜5遍，加入二抗孵育2 h，洗膜5遍后ECL化学发光试剂液(A液∶B液=1∶1)显色3 min，凝胶成像曝光仪曝光并拍摄图片，采用Image J 软件进行分析。RT-qPCR实验方法如1.4.4所述。
1.5 主要观察指标 ①细胞生长状态；②慢病毒感染情况；③NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达水平及p38、p-p38、NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达水平。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 5.0 软件作柱状图；IBM SPSS(V25.0, Armonk, NY, IBM Corp)进行数据分析，计量数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

NLRP3炎性因子是表达于免疫细胞表面的模式识别受体，能为固有免疫反应提呈抗原，在炎症性疾病的发生与发展中发挥着重要作用。多种因素能激活NLRP3炎性小体产生，其机制也相对复杂，除了经典的细菌、病毒、微生物、ATP、线粒体活性氧(mtROS)、K+外流、氧化线粒体DNA以外，近年发现NEK7、半乳糖氨基半乳糖多糖(AGA)、动力蛋白接头组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)等能触发NLRP3炎症小体的组装[16-18]。而且一些非典型的炎症小体途径和替代的炎症小体途径及NLRP3泛素化和磷酸化对NLRP3炎症小体的激活起着非常重要的调节作用[1]。近年来越来越多的NLRP3炎症小体抑制剂被发现，并且在实验研究与临床应用中表现出延缓或减轻相关炎性疾病的潜力。如果能找到有效途径抑制其表达，阻断炎性反应进程，这将为炎性疾病的治疗带来新希望。
近年来发现了大量负向调控NLRP3炎性小体的因素，例如酮体β-羟丁酸、β-葡聚糖、乙型肝炎病毒、MCC950、MicroRNA 223、丝胶、干扰素等[19-24]，主要机制是通过不同作用靶点介导p38MAPK/NF-κB信号通路抑制下游炎性递质的表达，与该研究CD1d通过该通路抑制NLRP3炎性因子表达一致[10]。但CD1d与p38MAPK/NF-κB之间联系的研究甚少，有文章发现在人树突状细胞上CD1d表达的增加是通过PPARg和RARA通路以及部分通过p38MAPK激活介导，但机制有待进一步研究。在一些前期工作基础中作者发现CD1d能与抑制蛋白SIRPα直接结合，所以推测CD1d抑制NLRP3及pro-IL-1β/pro-IL-18表达的可能机制：CD1d在受到刺激后，迅速与SIRPα结合并导致SIRPα胞浆区C-端的酪氨酸磷酸化，进一步招募SHP-1或SHP-2激酶抑制下游p38MAPK通路，从而下调NLRP3及pro-IL-1β/pro-IL-18 mRNA转录及蛋白表达。
此次研究为证实该机制进行了进一步验证，结果显示上调巨噬细胞中CD1d基因的表达，发现NLRP3、pro-IL-1β/pro-IL-18基因表达明显降低，证明了CD1d分子对NLRP3炎性因子确实有抑制作用。这与最新一项研究指出的CD1d通过一个上游事件导致NF-κB激活，最终介导巨噬细胞中NLRP3及其直接底物IL-1β和IL-18转录下调一致[10]。在此之前仅有文献报道癌细胞上过度表达的跨膜蛋白CD47能与SIRPα蛋白连接，招募SHP-1、SHP-2，激活“不要吃我”信号和抑制巨噬细胞的吞噬功能[25-29]。但关于SIRPα蛋白与CD1d的相关性并没有文献进行阐述。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。此研究的免疫共沉淀结果验证了SIRPα蛋白与CD1d蛋白相互作用，这一发现能为NLRP3的调控机制提供新靶点及思路。通过进一步调控SIRPα基因表达，发现下调组RAW264.7细胞NLRP3、pro-IL-1β/ pro-IL-18基因及蛋白表达显著升高，p38/p-p38蛋白表达也明显升高；上调组RAW264.7细胞NLRP3基因及蛋白表达显著降低，p38/p-p38、pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白表达也明显降低，证实了SIRPα能通过p38MAPK/NF-κB信号通路负性调控NLRP3炎性因子。在一些研究中也表明SIRPα通过下游因子SHP-2参与p38MAPK和NF-κB信号通路的调节[30-31]。有研究敲除树突状细胞SIRPα基因后，发现T淋巴细胞分泌的细胞因子(肿瘤坏死因子α/白细胞介素12/白细胞介素6)和干扰素γ(IFN-DNA)分泌增加[32]。这些研究都证实SIRPα对固有免疫存在负向调节作用。有趣的是，在上调SIRPα后，pro-IL-1β、pro-IL-18基因表达与对照组无明显差异，这些结果可能与某些旁分泌促炎作用相关，比如，白细胞介素1β可以被中性粒细胞衍生的丝氨酸蛋白酶如弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3激活，而不依赖于caspase-1激活通路[33]。总而言之，该实验结果表明：CD1d通过与信号调节蛋白SIRPα结合抑制下游p38MAPK/NF-κB通路，降低NLRP3、pro-IL-1β/pro-IL-18的表达，而抑制炎性因子白细胞介素1β和白细胞介素18成熟与分泌。
该研究也存在的不足之处：p38MAPK信号通路中相关因子的磷酸化水平没有得到分析，虽然已经有很多研究证实SIRPα与p38MAPK/NF-κB通路机制，但是此研究是在特定的巨噬细胞环境，可能存在一定差异；没有检测SIRPα下游SHP-1、SHP-2因子的表达水平，虽然SHP-1、SHP-2在SIRPα调控免疫机制中是必不可少的[34]，但三者之间相互调节机制仍不明朗，有人认为SHP-1可能是SIRPα介导的负调控中的一种协同事件，本质上是SHP-2的拮抗剂，当SIRPα水平降低导致SHP-2与SIRPα的解离，SHP-2才能发挥作用[27]，这有待在完整免疫系统环境中进一步验证。另外，一部分人认为CD1d下调会导致疾病发生。例如肿瘤通过下调CD1d和扰乱细胞信号通路损害CD1d/NKT细胞轴的途径实现免疫逃逸[35]。另一部分人则认为CD1d的过度表达与某些疾病相关，如乳腺癌的进展阶段被证实与CD1d的表达呈正相关[36]，所以对于上调CD1d在临床患者治疗中的收益问题仍存在争议，有待更完善的机制研究和下一步的临床试验予以佐证。最后，CD1d与SIRPα的相互作用是否为引起NLPR3、pro-IL-1β以及pro-IL-18表达变化的必要条件，还需进一步研究。如果能在此研究基础上，阻断两者结合，再观察下游炎性因子表达，这将能说明CD1d与SIRPα的结合是否为引起NLPR3、pro-IL-1β以及pro-IL-18表达变化的必要条件。
综上所述，研究发现CD1d能显著抑制NLRP3炎性因子的表达，并验证了其具体机制是通过与SIRPα结合抑制p38MAPK/NF-κB信号通路而下调下游相关炎性因子的表达。虽然抑制NLRP3炎性因子靶点被大量发现，但是存在不稳定、位点难调控等各种问题。关于免疫细胞分泌的MHCⅠ类CD1d分子的研究相对成熟[37-38]，更容易找到调控细胞分泌的方式，同时SIRPα在该通路起着至关重要的作用，这都将为NLRP3相关性疾病的治疗提供更多思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

CD1d通过信号调节蛋白α抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3等炎性因子的表达

CD1d-mediated inhibition of the nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammatory factor expression via signal regulatory protein-alpha

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