结缔组织生长因子对肌腱细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响

doi:10.12307/2022.533

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2673-2677.doi: 10.12307/2022.533

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

结缔组织生长因子对肌腱细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响

王全震1，肖颖锋1，万圣祥1，张建1，周波1，孟繁斌1，于龙彪1，于斐2，3

北京大学深圳医院，1手显微外科，2骨关节科，广东省深圳市 518036；3骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东省深圳市 518036

收稿日期:2021-04-21 修回日期:2021-04-22 接受日期:2021-06-01 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 于斐，医师，博士，北京大学深圳医院骨关节科，广东省深圳市 518036；骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东省深圳市 518036
作者简介:王全震，男，1979年生，2006年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事创伤骨科、周围神经损伤修复方面的研究。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金(2021A1515012586，2019A1515110983)，项目负责人：于斐；白求恩•石药骨质疏松科研基金项目(G-X-2020-1107-21)，项目负责人：于斐

Effect of connective tissue growth factor on the secretion of type I and III collagen in tenocytes

Wang Quanzhen1, Xiao Yingfeng1, Wan Shengxiang1, Zhang Jian1, Zhou Bo1, Meng Fanbin1, Yu Longbiao1, Yu Fei2, 3

1Department of Hand and Microsurgery, 2Department of Orthopedics and Joint Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; 3National and Local Joint Engineering Research Center of Orthopedic Biomaterials, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Received:2021-04-21 Revised:2021-04-22 Accepted:2021-06-01 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Yu Fei, MD, Physician, Department of Orthopedics and Joint Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; National and Local Joint Engineering Research Center of Orthopedic Biomaterials, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
About author:Wang Quanzhen, Master, Associate chief physician, Department of Hand and Microsurgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Basic and Applied Basic Research Foundation, Nos. 2021A1515012586 and 2019A1515110983 (both to YF); Osteoporosis Scientific Research and Development Fund of Bethune-China Shiyao Pharmaceutical Group Co., Ltd., No. G-X-2020-1107-21 (to YF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
结缔组织生长因子：是由BRADHAM等在1991年从人脐静脉内皮细胞的条件培养基中获得的，该因子由349个氨基酸构成，分子质量为 34-38 kD，在细胞增殖、分化、迁移过程中起重要作用，与皮肤、血管、肝脏等组织的纤维化密切相关。
Ⅰ、Ⅲ型胶原：是肌腱细胞非常重要的细胞外基质，在人体中起到维持肌肉张力的作用，其中Ⅰ型胶原占肌腱细胞胶原的95%以及肌腱干质量的60%；Ⅲ型胶原排第二，位于正常肌腱鞘及病变肌腱中，也是肌腱愈合时分泌最多的胶原。

背景：肌腱断裂是骨科常见的棘手问题，而肌腱细胞中胶原分泌影响到肌腱断裂的修复过程，结缔组织生长因子影响组织器官的纤维化过程，对细胞胶原的分泌有重要的作用，但其对肌腱细胞胶原分泌的作用却鲜有报道。
目的：通过不同质量浓度的结缔组织生长因子刺激体外培养的原代鸡肌腱细胞，观察细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达情况。
方法：选取8周来亨鸡6只，麻醉处死后取屈趾深肌腱行肌腱细胞原代培养，行Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫荧光鉴定；取4代的原代肌腱细胞，通过不同质量浓度(0，5，10，20，50，100，200，500 μg/L)的结缔组织生长因子刺激4 d，分别行实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附测定法检测不同组别肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ 型胶原mRNA及蛋白的表达情况。
结果与结论：①Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫荧光鉴定原代培养的细胞为肌腱细胞；②实时荧光定量PCR检测提示结缔组织生长因子刺激后肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达量均增加；③酶联免疫吸附测定法检测提示结缔组织生长因子刺激后肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量均增加(P < 0.01)，且两者均随结缔组织生长因子质量浓度的升高而逐渐增高，20 μg/L及50 μg/L的结缔组织生长因子可能是体外刺激肌腱细胞分别生成Ⅰ、Ⅲ型胶原的最佳作用浓度；④在一定范围内，结缔组织生长因子能够促进鸡原代肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。
缩略语：结缔组织生长因子：connective tissue growth factor，CTGF；酶联免疫吸附测定：enzyme linked immunosorbent assay，ELISA

https://orcid.org/0000-0003-3734-4563 (王全震)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 结缔组织生长因子, 肌腱细胞, Ⅰ型胶原, Ⅲ型胶原, 细胞实验

Abstract: BACKGROUND: Tendon rupture is a common thorny problem in orthopedics, and collagen secretion in tenocytes affects the repair process of tendon rupture. Connective tissue growth factor affects the fibrosis process of tissues and organs, and plays an important role in the secretion of cell collagen. However, its effects on the secretion of tenocyte collagen have been rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the expression of type I collagen and type III collagen in primary chicken tenocytes stimulated in vitro with different concentrations of connective tissue growth factors.
METHODS: Six Leghorn chickens, aged 8 weeks, were killed, and deep digital flexor tendon was obtained to culture primary tenocytes. Immunofluorescence staining for type I and III collagen was used to detect the primary tenocytes. Then passage 4 tenocytes were stimulated with connective tissue growth factors at different concentrations (0, 5, 10, 20, 50, 100, 200, and 500 μg/L) for 4 days. Real-time fluorescence quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were used to detect the mRNA and protein expression of type I collagen and type III collagen in different groups of primary tenocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary cultured cells were identified as tenocytes by type I and III collagen immunofluorescence staining. Real-time fluorescence quantitative PCR detection showed that the mRNA expression of type I collagen and type III collagen was increased in tenocytes after connective tissue growth factor stimulation. Enzyme-linked immunosorbent assay detection showed that the protein expression of type I collagen and type III collagen was increased in tenocytes after connective tissue growth factor stimulation (P < 0.01), and both increased gradually with the increase of connective tissue growth factors concentration. Connective tissue growth factors at 20 and 50 μg/L might be the best concentrations to stimulate primary tenocytes to produce type I collagen and type III collagen in vitro. Therefore, connective tissue growth factors within a certain concentration range can promote the secretion of type I collagen and type III collagen in primary chicken tenocytes.

Key words: connective tissue growth factor, tenocyte, type I collagen, type III collagen, cell experiment

中图分类号:

王全震, 肖颖锋, 万圣祥, 张建, 周波, 孟繁斌, 于龙彪, 于斐. 结缔组织生长因子对肌腱细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2673-2677.

Wang Quanzhen, Xiao Yingfeng, Wan Shengxiang, Zhang Jian, Zhou Bo, Meng Fanbin, Yu Longbiao, Yu Fei. Effect of connective tissue growth factor on the secretion of type I and III collagen in tenocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2673-2677.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，样本之间采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2010年3月至2021年2月在深圳市第二人民医院及北京大学深圳医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6 只8 周龄SPF级来亨鸡[18]，雌雄不限，体质量50-70 g，购自广东温氏集团(通过广东温氏集团自新兴大华农禽蛋有限公司购买)，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0019。
1.3.2 主要试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶购自Gibco公司；RhCTGF购自PeproTech公司；DEPC购自Sigma公司；AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit购自Axygen公司；Revert AidTM First Strand CDNA Synthesis Kit、PCR Kit 购自Fermentas公司；Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体购自Bioss公司；Chicken Col-Ⅰ Elisa Kit、Chicken Col- ⅢElisa Kit 购自Gbd公司。
1.3.3 主要仪器普通PCR仪、水平电泳系统、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，酶标仪(芬兰Labsystem公司)，台式冷冻离心机、移液器(德国Eppendorf公司)，细胞培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，液氮罐(四川东亚公司)，灭菌锅(上海申安公司)，烘箱(上海一恒公司)，高速离心机(上海安亭公司)，摇床(北京六一公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 原代肌腱细胞的分离培养取8 周龄来亨鸡6 只，3%戊巴比妥钠注射麻醉后气管窒息法处死[17]，取鸡腿洗净置于超净台中，取屈趾深肌腱，D-Hank’s液清洗3 遍，加入含0.25%胰蛋白酶、0.1%Ⅱ型胶原酶中，于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中消化40 min；弃消化液，D-Hank’s液清洗3 遍，将肌腱剪成1.0-2.0 mm2碎块，加入含0.1%的Ⅰ型胶原酶中于37 ℃空气震荡器中消化过夜；200 目过滤器收集滤液， 1 000 r/min离心10 min，弃上清，用含双抗10%胎牛血清的DMEM混悬细胞，接种于培养皿中，于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养4 d，细胞长满培养皿底80%左右消化传代，备用。
1.4.2 原代肌腱细胞爬片的制作将6 孔板大小的无菌盖玻片置于6 孔板中，取4 代肌腱细胞，计数后将细胞制作成5×107 L-1的混悬液，接种于6 孔板中的盖玻片上，细胞长至接触后取出盖玻片备用。
1.4.3 原代肌腱细胞的鉴定吸净6 孔板中的培养液，取出细胞爬片，PBS洗3遍，冷丙酮固定10 min，A片加Ⅰ型胶原抗体，B片加Ⅲ型胶原抗体，C片加DAPI作为对照。
1.4.4 肌腱细胞的分组取4 代肌腱细胞，计数后将细胞制作成5×106 L-1的混悬液，接种于96 孔板中，每孔200 μL，含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养过夜后弃培养基，分别加入含有0，5，10，20，50，100，200，500 μg/L CTGF因子的10%DMEM培养。

1.4.5 实时荧光定量PCR检测肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达取不同质量浓度CTGF刺激4 d的细胞，提取总RNA，根据NCBI网站GeneBank 查询目的基因Ⅲ型胶原α1、Ⅰ型胶原α1序列，设计合成引物，以GAPDH为内参，序列见表1。设置扩增条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃20 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，循环28次，采用Hema GSG-2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析比较各组灰度值。

1.4.6 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达取不同质量浓度CTGF刺激4 d的细胞，离心收集上清，按照试剂盒说明书进行操作：稀释标准品，0，1，2，4，10，20 μg/L；100 μL标准品、样本加入每孔上清中；10 μL Biological和50 μL酶标记物加入每孔上清中，于37 ℃孵育 1 h；washing buffer洗5次；TMB底物加入每孔上清中，室温孵育15 min；酶标仪450 nm读取吸光度(A)值。
1.5 主要观察指标采用免疫荧光染色对肌腱细胞进行形态观察和鉴定；实时荧光定量PCR及ELISA法分别检测0，5，10，20，50，100，200，500 μg/L CTGF因子刺激4 d的肌腱细胞中，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的表达情况。
1.6 统计学分析全部计量资料采用x±s表示，样本之间采用单因素方差分析，采用SPSS 21.0进行数据分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

手部肌腱断裂可造成休息位时损伤手指伸直或曲屈角度增大，使手指的主动屈伸功能丧失，可伴有手指伸直或曲屈状态等典型畸形，这也是骨科医生关注的重点问题[19-21]。发生肌腱损伤应尽量一期修复，或进行肌腱缝合、移植、移位术等二期缝合。近些年研究证实，有许多物质在肌腱损伤修复中起到重要作用[22]，可以通过改变相关物质的量促进肌腱的损伤修复[23]，比如细胞因子、富血小板血浆、microRNA等[24-26]，而CTGF是此类物质中比较重要的一种[27]。
CTGF与细胞增殖分化密切相关[28-29]，并在组织器官的纤维化中起到重要作用[30-31]，该因子是一种分子质量34-38 kD的由349 个氨基酸组成的富含半胱氨酸的分泌肽，最早是在1991年由BRADHAM等[32]在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现。CTGF能够调节细胞的胶原分泌[33]，并通过影响相关细胞的功能在胶原相关的疾病中起到重要作用，如肌腱断裂等[34]。
肌腱细胞是肌腱组织的最主要细胞，而肌腱细胞的细胞外基质以胶原为主，胶原能够起到维持肌腱细胞张力的作用[35]。按照肌腱细胞外基质中不同类型胶原的含量来看，Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量排前两位，除此之外还有Ⅴ、Ⅶ型胶原等。Ⅰ型胶原在维持正常肌腱功能中作用最大，而Ⅲ型胶原主要在正常肌腱鞘和病变肌腱中存在。当肌腱组织损伤后，其纤维化愈合经历了炎症、修复、重塑3个阶段，而肌腱细胞分泌胶原等细胞外基质最主要是在修复及重塑阶段起作用，当肌腱损伤后，肌腱细胞被激活后分泌各种类型的胶原，起到修复作用；随后，Ⅰ型胶原分泌增多、Ⅲ型胶原分泌减少起到重塑作用[10]。由此可知，通过细胞因子调控Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌能够在肌腱断裂等疾病的损伤修复过程中起到重要作用[36]，而可以针对肌腱损伤的不同阶段，通过不同刺激因子的作用导致不同胶原分泌，比如在修复阶段，可以通过相关因子的作用增加Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌，从而使修复过程加快，或者修复更彻底。而作者所在课题组前期研究证实，CTGF能够促进鸡滑膜细胞和肌腱细胞增殖[17，37]，同时促进鸡滑膜细胞中Ⅰ、Ⅲ 型胶原的分泌[38]，因此提出此次研究的假说，认为CTGF也能够促进鸡肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌，从而进一步在肌腱断裂的修复过程中起到作用。
SHIEH等[33]认为，转化生长因子β可以通过Smad2/3依赖途径以及CTGF的诱导分泌影响人鼻黏膜成纤维细胞的胶原分泌。CHEN等[39]则应用大鼠模型证实在二氧化硫污染环境中进行运动可导致CTGF与心肌胶原同向表达升高，对心肌产生不利影响。YU等[40]发现在小鼠中通过静脉反复注射二氧化硅纳米颗粒可以激活JAK2/STAT3和TGF-β/Smad3通路参与胶原的聚集，这一过程中CTGF的表达量上调。也有研究者证实，在硬皮病相关的真皮成纤维细胞中腺苷A(2A)受体可以通过Fli1和CTGF介导的机制促进胶原蛋白的产生[41]。由此可知，在不同组织的不同疾病中，无论是促进疾病好转还是导致疾病恶化时，CTGF均可以与胶原起到同向变化的作用，而且CTGF上调可以通过相关信号通路的变化导致胶原表达升高。
此次研究证实，在一定的浓度范围内，在体外培养的鸡肌腱细胞中用CTGF刺激后，细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达量均提高，且呈剂量依赖性。作者首先用实时荧光定量PCR检测发现随CTGF质量浓度的升高，除极个别浓度刺激外，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达量大致呈现升高的趋势；随后用ELISA检测从蛋白层面开展进一步的验证，发现随CTGF质量浓度的升高Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量逐渐升高，作者认为20 μg/L及50 μg/L的CTGF可能分别是CTGF刺激鸡肌腱细胞体外影响Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的最佳作用浓度。从而作者认为，CTGF是一种促进肌腱细胞中胶原分泌的良好细胞因子，作用效果明显，可以作为肌腱断裂后促进肌腱损伤修复的诱导因子，但是鉴于Ⅰ、Ⅲ型胶原对CTGF作用的敏感性不同，可以在肌腱断裂损伤修复的不同阶段，使用不同浓度的CTGF造成特定类型的胶原分泌增多，从而在不同的作用阶段更好地起调控作用。而且在这些过程中，CTGF可能是通过JAK/STATE、TGFβ/Smad等信号通路中相关因子的表达，调控肌腱细胞的增殖分化，并影响Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌，起到一个良性循环，并最终在肌腱断裂等修复中起到作用，当然这一观点需要进一步通过实验进行证实。
此文也存在一定的不足之处：首先，文章只是在mRNA和蛋白层面进行了研究，缺乏基因层面的检测，后续会通过基因测序的方法检测细胞干预后基因层面的变化情况；其次，只对细胞干预后Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化进行了检测，缺乏功能学如细胞增殖、细胞周期等的检测，也缺乏机制学相关的内容，后续将会增加流式细胞学技术、分子通路的检测，以完善实验；最后，只在细胞层面进行了检测，缺乏动物中的实验，后续将会补充动物实验全面解释实验结果。
综上所述得出结论，一定质量浓度范围内CTGF能够促进肌腱细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌增多，从而有助于肌腱断裂等疾病的损伤修复。因此，针对肌腱损伤后的修复阶段，可以通过CTGF等因子作用于肌腱细胞，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌，从而加快修复进程，这也为临床上通过细胞因子治疗肌腱断裂提供了理论基础与实验数据支撑。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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本文评价

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