羟基磷灰石复合二氧化锆泡沫陶瓷的理化性能与细胞化性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1653

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (18): 2871-2879.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1653

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羟基磷灰石复合二氧化锆泡沫陶瓷的理化性能与细胞化性能

柴乐¹，全仁夫²，吕建兰¹，黄小龙²，张灿¹，任伟凡¹，钱建胜¹

¹浙江中医药大学，浙江省杭州市 310053；²浙江中医药大学附属江南医院，浙江省杭州市 311200

收稿日期:2018-11-08 出版日期:2019-06-28 发布日期:2019-06-28
通讯作者: 全仁夫，主任医师，浙江中医药大学附属江南医院脊椎外科，浙江省杭州市 310053
作者简介:柴乐，男，1991年生，河南省焦作市人，汉族，浙江中医药大学第三临床医学院在读硕士，主要从事组织工程研究。
基金资助:
浙江省医药卫生科技项目(2014KYA191)，项目负责人：全仁夫；浙江省重大科技专项(2014C03031)，项目负责人：全仁夫

Physicochemical properties and cellularization of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics

Chai Le¹, Quan Renfu², Lü Jianlan¹, Huang Xiaolong², Zhang Can¹, Ren Weifan¹, Qian Jiansheng¹

¹Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China; ²Jiangnan Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311200, Zhejiang Province, China

Received:2018-11-08 Online:2019-06-28 Published:2019-06-28
Contact: Quan Renfu, Chief physician, Jiangnan Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311200, Zhejiang Province, China
About author:Chai Le, Master candidate, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China
Supported by:
the Medical and Health Scientific Program of Zhejiang Province, No. 2014KYA191 (to QRF); the Major Scientific Research Fund of Zhejiang Province, No. 2014C03031 (to QRF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

羟基磷灰石/二氧化锆：羟基磷灰石是骨的主要无机成分，具有优异的生物相容性，但其强度低、韧性差；二氧化锆(ZrO₂)陶瓷材料具有较高的弯曲强度、断裂韧性和较低的弹性模量。故用二氧化锆作为羟基磷灰石增强体后，可获得力学性能和生物相容性俱佳的生物复合材料。

细胞毒性：是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机制，有时需要进行特定物质细胞毒性检测，比如药物筛选。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测。

背景：研究已证实羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料具有良好的促骨再生能力，但关于其遗传毒性还未见报道。

目的：检测羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料的孔隙率与抗压强度，以及遗传毒性与细胞毒性，探索人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞在羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料上的成骨分化能力。

方法：在添加造孔剂的情况下，采用高温烧结法制备羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料，检测其孔隙率与抗压强度。采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验检测羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料的遗传毒性。分别采用羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料浸提液(实验组)、苯酚溶液(阳性对照组)、生理盐水(阴性对照组)培养L929细胞，24 h后，采用CCK-8法检测细胞毒性。将人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞接种于羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料上，培养第3，7，10，14天，检测细胞碱性磷酸酶分泌量；培养第14天，免疫组织化学法检测复合体细胞Ⅰ型胶原表达，扫描电镜观察细胞黏附情况。

结果与结论：①羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料的孔隙率为(76.72±0.75)%，抗压强度为(11.60±1.35) MPa；②鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验显示，羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料的代谢产物无致突变、无致癌作用；③CCK-8实验显示，实验组的细胞存活率与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但明显高于阳性对照组(P < 0.05)；④随着培养时间的延长，细胞碱性磷酸酶分泌量逐渐增加，各时间点间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；⑤培养第14天，大量人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞均匀分布于羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料表面，细胞形态及生长良好，并且Ⅰ型胶原表达较多；⑥结果表明，羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷材料具备一定的抗压能力，无致突变作用和细胞毒性，可促进人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞的成骨分化。

ORCID: 0000-0002-4230-5465(柴乐)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 羟基磷灰石, 二氧化锆, 抗压强度, 遗传毒性, 细胞毒性, 成骨分化, 细胞毒性检测, 复合体细胞Ⅰ型胶原表达

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramic materials have the ability to promote bone regeneration, but their genotoxicity has not been reported.

OBJECTIVE: To detect the porosity, compressive strength, genotoxicity and cytotoxicity of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics and to explore the osteogenic differentiation of artificially induced pluripotent stem cells cultured on the hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics.

METHODS: The hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics was prepared by high temperature sintering method with addition of pore-forming agent. The porosity and compressive strength of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics were detected, and the genotoxicity of the material were tested using Salmonella typhimurium reverse mutation test. L929 cells were cultured with hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics extract (experimental group), phenol solution (positive control group), and normal saline (negative control group). After 24 hours of culture, the cytotoxicity was detected using cell counting kit-8 toxicity test. Artificially induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells were inoculated onto the hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics. On the 3^rd, 7^th, 10^th and 14^th days of culture, the amount of alkaline phosphatase secreted by the cells was detected. On the 14^th day of culture, the expression of type I collagen in the cells was detected by immunohistochemistry, and cell adhesion was observed by scanning electron microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity and compressive strength of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics were (76.72±0.75)% and (11.60±1.35) MPa, respectively. (2) In the Salmonella typhimurium reverse mutation test, the metabolites of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics were not mutagenic or carcinogenic. (3) In the cell counting kit8 test, the survival rate of the cells in the experimental group was close to that in the negative control group (P > 0.05), but still significantly higher than that in the positive control group (P < 0.05). (4) With the extension of culture time, the secretion amount of alkaline phosphatase was increased gradually, and there was significant difference at different observational time points (P < 0.05). (5) On the 14^th day of culture, a great amount of artificially induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells evenly distributed and grew well on the surface of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics, and these cells had good morphology and highly expressed type I collagen. To conclude, the hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics has a certain compressive capacity and does not exhibit mutagenic effects and cytotoxicity, and promote the osteogenic differentiation of artificially induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells cultured on its surface.

Key words: hydroxyapatite, zirconium dioxide, compressive strength, genotoxicity, cytotoxicity, osteogenic differentiation, cytotoxicity test, type I collagen expression in complex cells

中图分类号:

柴乐，全仁夫，吕建兰，黄小龙，张灿，任伟凡，钱建胜. 羟基磷灰石复合二氧化锆泡沫陶瓷的理化性能与细胞化性能[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(18): 2871-2879.

Chai Le, Quan Renfu, Lü Jianlan, Huang Xiaolong, Zhang Can, Ren Weifan, Qian Jiansheng. Physicochemical properties and cellularization of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(18): 2871-2879.

图/表（结果） 12

2.1 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的结构在添加造孔剂的情况下，采用高温烧结法制备出羟基磷灰石/ZrO₂多孔生物泡沫陶瓷材料，见图1，材料外形良好，直径大致为16 mm、长25 mm的白色半圆柱体，表面粗糙可见众多空隙，见图1A，B；扫面电镜观察可见泡沫陶瓷表面不同，大致呈球形，表面颗粒圆滑且分散较好，每个球形直径较小，为10-20 nm，二氧化锆有少量的团聚现象，见图1C；超景深显微镜观察显示，材料表面好似一个个球状凸起且表面较为粗糙，每一个球状凸起都有二三个空隙相连且空隙分布大致均匀，每个球状物有相互连通，并向深处延伸，使支架内部联通性较好，大致无闭合，见图1D。

2.2 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的能谱分析对羟基磷灰石/ZrO₂材料进行X射线衍射检测后，发现ZrO₂几乎无变化，而羟基磷灰石分解，见图2。根据X射线衍射显示，羟基磷灰石与ZrO₂在煅烧过程中分解为Ca₃(PO₄)₂、CaO、CaZrO₃等，其中最主要元素有O、Na、Si、P、Ca。材料中各元素的质量比为：O∶Na∶Si∶P∶Ca =48.80%∶1.83%∶7.00%∶14.79%∶24.92，原子量比为：65.54%∶1.67%∶5.29%∶0.24%∶13.54%，见图3。烧结后，材料中的主要元素为O、Ca，为人体所必须的元素。

2.3 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的孔隙率及极限抗压强度羟基磷灰石/ZrO₂梯度复合泡沫陶瓷的孔隙率及极限抗压强度检测结果，由上海大学材料学院提供。表1所示，涂2层羟基磷灰石泡沫陶瓷的孔隙率为(76.72±0.75)%，名义抗压强度为(2.71±0.4) MPa，实际抗压强度为(11.60± 1.35) MPa，可见制成多孔泡沫陶瓷后对材料强度有较大影响。另外涂覆羟基磷灰石后，材料孔隙率没有明显下降，说明不存在或仅存在少量浆料堵孔现象，保证了羟基磷灰石/ZrO₂梯度复合泡沫陶瓷内部具有联通的三维网状空洞。

2.4 鼠伤寒沙门氏菌回复性突变和细胞毒性分析

受试物的致突变作用(-S9)：在不存在代谢活化体系的情况下，不同浓度羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料对鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535的致突变实验结果，见表2。二甲亚砜对照组的自发回复突变个数分别为(15±1)，(6±1)，(18±4)，(48±8)，(4±2)个克隆/孔；TA97a菌株阳性对照化合物(9-氨基吖啶缘酸盐一水合物组)、TA98菌株阳性对照化合物(2-硝基芴组)、TA100菌株阳性对照化合物(叠氮钠组)、TA102菌株阳性对照化合物(过氧化氢异丙苯组)、A1535菌株阳性对照化合物(叠氮钠组)的回复突变个数分别为(56±4)，(50±10)，(106±13)，(193±13)，(50±10)个克隆/孔，分别为DMSO对照组的3.7，8.4，5.9，4.0，16.7倍。不同浓度羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料组TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535的回复突变克隆数均与DMSO对照组相当、略高或略低，都未达到2倍，克隆形态正常，提示受试物无遗传毒性。

受试物代谢产物的致突变作用(+S9)：在存在代谢活化体系的情况下，不同浓度羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料对鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535的致突变实验结果，见表3。在加入S9代谢活化体系的情况下，DMSO对照组的自发回复突变个数分别为(17±2)，(5±1)，(8±1)，(45±2)，(2±1)个克隆/孔；阳性对照化合物2-氨基蒽组的回复突变个数分别为(143±10)，(224± 19)，(114±5)，(208±15)，(63±5)个克隆/孔，分别为DMSO组的8.6，48.1，14.3，4.6，27倍。羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料组TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535的回复突变克隆数均与DMSO对照组相当、略高或略低，都未达到2倍，且克隆形态正常，提示受试物的代谢产物无遗传毒性。

细胞毒性：背景菌落由依赖组氨酸的细菌微小克隆形成，可通过10倍显微镜观察。受试物羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料处理后的背景菌落情况，见表4。羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料对背景菌落无明显影响，提示受试物在所试剂量下没有表现出细胞毒性。在加入S9代谢活化体系的情况下，该材料对背景菌落也无明显影响，提示该材料的代谢物在所试剂量下没有表现出细胞毒性，见表5。

2.5 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的细胞毒性实验组、阴性对照组、阳性对照组的细胞存活率分别为99.22%， 99.97%，41.98%；实验组、阴性对照组细胞存活率高于阳性对照组(P < 0.01)，实验组与阴性对照组细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.6 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料与间充质干细胞共培养实验结果

碱性磷酸酶分泌量：随着培养时间的延长，碱性磷酸酶的分泌量增加，其中3 d分泌量为52.55 U/L，7 d分泌量为57.34 U/L，10 d分泌量为61.58 U/L，14 d分泌量为 72.83 U/L，见图5；χ²检验显示，5个时间点间碱性磷酸酶分泌量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明能随着时间的延长，间充质干细胞放入成骨分化能力增强。

Ⅰ型胶原表达：共培养第14天，免疫组织化学显示细胞较为均匀的分布于材料之上，并且可见大量Ⅰ型胶原，见图6。

细胞爬行及黏附状态：扫面电镜观察可见材料表面均匀分布着间充质干细胞，细胞黏附良好且数量较多，见图7A，其中红色部分圆球状为间充质干细胞的细胞核，细小灰色部分(条索样状)为该细胞的树突与轴突；细胞生长正常，形态良好，见图7B。

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引言

羟基磷灰石是骨的主要无机成分，具有优异的生物相容性，已被广泛用于许多组织的修复，以改善骨植入物的直接接触，最终减少愈合时间^[1]。在体液作用下，羟基磷灰石植入人体后会被部分降解，释放出人体组织所必需的钙、磷元素，并被人体组织吸收、利用，结合入新的组织，使羟基磷灰石植入物和人体骨组织获得良好的结合，但其强度低、韧性差，限制了临床应用^[2-3]。据文献报道，掺杂金属氧化物纳米颗粒聚合物可提高羟基磷灰石的机械强度^[4-5]。二氧化锆(ZrO₂)陶瓷材料具有较高的弯曲强度、断裂韧性和较低的弹性模量，并且具有一定的生物相容性^[1]。故用ZrO₂作为羟基磷灰石增强体后，可获得力学性能和生物相容性俱佳的生物复合材料^[6-7]。目前临床上通过移植人工骨来治疗骨缺损已变得十分普遍，不管人工骨来源于何种材料，其移植成功的关键在于术后移植骨内能否有正常的新生骨组织长入。如何提高人工骨组织材料的成骨性能和与骨融合率，受到了广泛关注^[8]。现最引人瞩目的突破口是，设计具有内部联通的三维多孔人工骨组织替换材料。研究表明具有合适空洞大小的人工骨组织材料，能够满足成骨细胞及其他骨细胞在其内部分化、爬行和扩增，这对稳固材料与骨组织界面的连接具有不可忽视的作用^[9]。Tamai等^[10]指出，具有内部联通的多孔羟基磷灰石泡沫陶瓷材料拥有良好的骨传导效应，故将羟基磷灰石/ZrO₂致密体制成泡沫陶瓷材料后，有望通过改变孔隙率来调节其强度，得到力学性能最贴近自然骨结构的高仿真人工骨材料。该泡沫陶瓷材料植入动物体内后，具有良好的促骨再生能力^[11-12]。对于该材料的生物相容性及对成骨细胞体外活性的影响已有报道^[13-14]，但对该材料及其代谢产物的遗传毒性还未见报道，已影响到该材料的进一步体内研究。故实验检测羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的孔隙率与抗压强度，以及遗传毒性与细胞毒性，探索人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞在羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料上的成骨分化能力，为羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的理化性能提供客观依据，为材料安全性作出客观评价。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年1月至2018年3月在上海大学材料学院、浙江大学生命科学院完成。

1.3 材料羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料(上海大学材料材料学院提供)；人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞(课题组黄小龙提供)；L929细胞系(中科院上海生命科学院)；诱导的SD大鼠肝S9组(瑞德肝脏疾病研究有限公司)；鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 (Moltox公司)；9-氨基吖啶盐酸盐-水合物、2-硝基芴、叠氮钠、氢过氧化枯烯、2-氨基蒽(Sigma-Aldrich公司)；氯化三联苯1254(Arochlor)；NADPH(罗氏)；牛肉浸膏(Oxoix，批号：111679502)；酵母提取物(Aobox，批号：01014)；DMSO(Invitrogen)；琼脂(BioFROXX，批号：1110GR100)；乙醇(无锡展望，批号：64175)；冰乙酸(无锡展望，批号：64197)；β-甘油磷酸钠(索莱宝，批号：GB100)；碱性磷酸酶试剂盒(碧云天，批号：P0321)；RPMI1640完全培养基(Sigma公司)；磁力搅拌器 (GL-3250A，Qilinbeier)；超纯水制备系统(F8PN28684，CMillipore公司)；高速离心(5810R，Eppendorf)；恒温培养箱(SOX-100B-D，上海博迅)；移液器(5810R，Eppendorf)；水浴锅(HI1210 Leica公司)；荧光倒置显微镜(IX71，Leica公司)；酶联免疫测试仪(MK3型，Thermo公司)；扫描电镜(S-3000N，HITACHI)。

1.4 实验方法

1.4.1 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的制备采用箱式电阻炉对ZrO₂粉体进行预烧处理，处理温度在30-800 ℃之间时升温速度为2 ℃/min，800-1 250 ℃之间时升温速度为4 ℃/min，升温至1 250 ℃后保温4 h，完成粉体预处理。加入材料的配比：聚乙烯醇、羧甲基纤维素的含量均为0.5%，硅溶胶的含量为10%，聚丙稀酸铵的含量为0.6%，使整体浆料固相率约为60%。高速球磨机300 r/min研磨 3 h，以制取浆料，然后先加入一定量去离子水和硅溶胶，搅拌10 min，加入羧甲基纤维素、消泡剂辛醇、ZrO₂粉体，再搅拌3 h，等待挂浆。将试样置于室温下干燥，然后放入烘箱中110 ℃烘干12 h。然后进行第2次研磨、挂浆，使整体浆料固相率降至57%。第2次起使用离心挂浆法，即先将未处理的有机泡沫材料放入离心管底部，再将浸泡好的含浆料有机泡沫放入，1 500 r/min离心1 min。经过相同工艺烘干后行第3次挂浆，整体浆料固相率调整至54%，对上述挂浆后预制体试样进行3段式烧结：①烘干阶段：在室温至100 ℃时，升温速度为2 ℃/min，目的挥发预制体试样内残余的水分；②挥发阶段：在100-200 ℃时，控制升温速度为1 ℃/min；在200-500 ℃时，控制升温速度在1 ℃/ 2 min；升温至500 ℃时，保温1 h；升温到500-750 ℃时，控制升温速度为2 ℃/3 min；升温至750 ℃后，保温1 h；升温到750-1 200 ℃时，控制升温速度为2 ℃/min；③高温焙烧阶段：持续烧结温度保持在3 ℃/min，到达1 550 ℃最高烧结温度后，再保温3 h并随炉冷却，得到纯ZrO₂泡沫陶瓷材料。

采取两步浸涂法涂覆梯度羟基磷灰石涂层。第一次浸涂浆料配比为：ZrO₂粉体为31.1%、羟基磷灰石粉体为13.3%、磷酸乙酯为1.4%、乙基纤维素为0.2%、双蒸水为53%。先将羟基磷灰石粉体加热至800 ℃，保温2 h预处理，再与上述原料在50 ℃热水中混合，搅拌5 h。将烧结出的纯ZrO₂泡沫陶瓷材料浸入浆料，等完全浸透后取出，甩去多余浆料，100 ℃烘干5 h，再加热到900 ℃保温5 h，最后加热到1 250 ℃保持1 h。第2次浸涂浆料配比为：ZrO₂粉体为3.9%，羟基磷灰石粉体为35.5%，磷酸乙酯为1.4%，乙基纤维素为0.2%，双蒸水为58%，配置好浆料后重复上述步骤。得到羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料。

1.4.2 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料孔隙率检测测定浸入饱和陶瓷试样的水体积与饱和陶瓷试样本身的总体积，二者之比换算可得出陶瓷孔隙率。具体步骤：①称量完全干燥的陶瓷试样质量，计为M₁；②用细绳绑好试样，将试样完全浸没入有足量蒸馏水的烧杯中，用煮沸法加热至沸腾，持续煮沸2 h，使陶瓷试样达到饱和吸水状态，再冷却至室温；③将上述煮沸饱和吸水试样取出，放入装有蒸馏水的敞口塑料杯里，称取烧杯质量，记为m₁；④缓慢提起细绳，使饱和吸水试样悬浮于水中，称取烧杯质量，计为m₂，m₁-m₂即为饱和陶瓷试样在水中的质量M₂；⑤从水中取出饱和吸水陶瓷试样，迅速读出天平数值，计为m₃，m₁-m₃即为饱和吸水陶瓷试样在空气中的质量，计为M₃。则气孔隙率q的计算公式如下：

1.4.3 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料抗压强度检测进行抗压强度实验时分别计算泡沫陶瓷材料名义抗压强度与实际抗压强度。名义抗压强度由泡沫陶瓷材料所受压力除以陶瓷整体表面积得出，表示泡沫陶瓷材料的整体抗压强度大小。实际抗压强度由泡沫陶瓷材料所受压力除以陶瓷的实际受力面积(即除去空隙面积后余下的实际面积)得出，表示泡沫陶瓷材料实际受力的强度大小。实验采用了CMT5105微机控制电子万能试验机，加载速率为40 N/min，直至试样碎裂。

1.4.4 鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验^[15] 选择选鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、A1535，采用标准平板掺入法进行回复突变实验。S9代谢活化系统中TA97a组、TA98组、TA100组、TA102组、A1535组的阳性对照化合物分别选用9-氨基吖啶缘酸盐一水合物组、2-硝基芴、叠氮钠、过氧化氢异丙苯、叠氮钠。将1.6 mL融化的上层琼脂(含0.5 mmol/L生物素-组氨酸溶液)加入无菌试管中，置于(48±3) ℃水浴锅中备用。取1只装有1.6 mL 上层琼脂的试管，依次加入0.08 mL菌液、0.08 mL不同浓度受试物、0.4 mL磷酸钠缓冲液或S9代谢活化系统。将试管中的各成分迅速混合均匀后，分别向GM琼脂板中每孔加入0.54 mL。每个受试物浓度3个复孔。将6孔板置于室温15 min，直至上层琼脂固化。之后，将6孔板倒置，放在(37±3) ℃培养箱中孵育74 h，人工计数形成的克隆数，然后用10倍解剖显微镜观察背景菌斑的情况。如果孵育后不能马上计数，可将6孔板放在4 ℃保存1周时间。对6孔琼脂板中每个孔内形成的克隆进行观察和计数，并与DMSO对照组比较，计算克隆增加的倍数。如果克隆数呈剂量依赖性增加，或克隆数较DMSO对照组增加3倍以上，可视为有致突变作用。此外，镜下观察背景菌落情况，按分级打分：0表示背景菌落正常；1表示背景菌落有轻微的减少、变薄；2表示背景菌落有中等程度的减少、变薄；3表示仅有少量背景菌落存在；4表示没有观察到背景菌落存在。

1.4.5 CCK-8细胞毒性实验^[16] 灭菌泡沫陶瓷材料，置入浸提介质灭菌生理盐水中，材料与浸提介质比例为1 g/5 mL，37 ℃恒温箱中静置7 d，过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。

取冻存的L929细胞系，37 ℃快速解冻后，加入2 mL RPMI1640完全培养基，1 200 r/min离心3 min，弃去上清，然后再加入3 mL对应的完全培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。复苏24 h后，观察细胞生长情况，当细胞密度达到80%以上时可进行传代；将培养皿中原有的培养液倒去，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶消化细胞，观察细胞消化情况，待细胞变圆后吸去胰酶，加入完全培养基，将细胞吹打为单细胞悬液，将细胞混匀；将细胞按照一定的比例分盘，加入适量培养液进行培养，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中；每天观察细胞状态，扩培到细胞量足够后续实验时进行铺板。待细胞生长至对数生长期时，调整细胞浓度为6×10⁷ L^-1，以每孔100 μL接种到96孔板中，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中预培养1 d，使细胞贴壁；实验组将10 μL材料浸提液与培养板内原培养液进行等量交换后继续培养，阳性对照组将10 μL 0.64%苯酚与培养板内原培养液进行等量交换后继续培养，阴性对照组将10 μL生理盐水与培养板内原培养液进行等量交换后继续培养；另外设8个未处理细胞对照孔和8个不含细胞的培养基空白孔。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(避免产生气泡)，继续孵育4 h，用酶标仪于波长450 nm下测定吸光度值。计算细胞存活率：

细胞存活率(%)=(A₁-A₃)÷(A₂-A₃)×100%，其中A₁为实验孔吸光度值，A₂为对照孔吸光度值，A₃为空白孔吸光度值。

1.4.6 羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料与细胞共培养^[17] 高温灭菌羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料，用无菌0.1 g/L多聚赖氨酸浸泡过夜，无菌条件下晾干，然后放入培养皿中并用完全培养液浸润，在培养皿底部放置磁铁；将纯化后的人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞制成悬浮液，然后逐滴缓慢滴在泡沫陶瓷材料上，DMEM/F12培养基培养，置于体积分数5%CO₂培养箱内，37 ℃液面下培养2周，细胞融合后改为气-液界面培养10 d。此处将自制的不锈钢网加入到培养皿中，将材料放在不锈钢网支架上，保持气-液界面。液面下培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，以后每天观察1次。

碱性磷酸酶分泌量检测^[18]：体外培养第3，7，10，14天，收集各个时间点的细胞样本，采用细胞裂解液裂解细胞；取出检测试剂盒中的所有试剂，恢复至室温使用；取一管显色底物，溶解于2.5 mL检测缓冲液中，充分溶解和混匀，冰上放置，6 h内使用；取10 μL p-nitrophenol溶液(10 mmol/L)，用检测缓冲液稀释至0.2 mL，最终浓度为 0.5 mmol/L；取96孔板，分别设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，标准品的用量分别为4，8，16，24，32，40 μL，样品(细胞样本)加入量是50 μL；用枪头轻轻吹打混匀， 37 ℃孵育5-10 min，每孔加入100 μL反应终止液，此时标准品或有磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色，在405 nm测定吸光度。碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH=9.8的DAE缓冲液中，37 ℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1 μmol p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶量，定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义计算出样品碱性磷酸酶活性。

免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达^[19]：培养第14天，PBS漂洗1次后，40 g/L多聚甲醛固定15-30 min；PBS洗2次；体积分数3.5%胎牛血清室温下封闭15 min；一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min；加二抗，37 ℃孵育 1 h；室温避光孵育15 min，荧光显微镜下拍照。

扫描电镜观察细胞爬行及黏附状态：培养第14天，将与细胞共培养的材料取出，4 ℃预冷PBS漂洗后，2.5%冷戊二醛固定24 h；吸出固定液，用PBS漂洗，彻底除去戊二醛；乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。

1.5 主要观察指标羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料的孔隙率与抗压强度、遗传毒性与细胞毒性，以及促人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞成骨分化的能力。

1.6 统计学分析建立资料数据库，导入SPSS 19.0统计学软件，进行数据分析。计量采用x(_)±s表示，进行t 检验及χ²检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

研究显示以石墨粉末作为造孔剂制备的羟基磷灰石/ ZrO₂多孔泡沫陶瓷材料，表面粗糙，呈气泡状白色固体，内部存在众多连通孔隙结构，孔隙率为(76.72±0.75)%，平均抗压强度为(11.60±1.35) MPa，鼠伤寒沙门氏菌回复性突变和CCK-8细胞毒性实验均未发现该材料本身及代谢产物存在遗传毒性和细胞毒性；进一步将其与人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞共培养，扫描电镜观察到材料表面人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞分布均匀，细胞黏附良好、数量较多，并且人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞在羟基磷灰石/ZrO₂多孔泡沫陶瓷材料上能被顺利诱导分化为成骨细胞。

研究表明，人工材料表面粗糙和多孔隙的支架结构有利于细胞的黏附、分化，并且当材料孔隙率达78%左右时^[20]，有利于细胞在材料内的黏附、迁移、分化和增殖。研究制备的羟基磷灰石/ZrO₂复合材料，在烧结过程中会产生二氧化碳等气体^[21-22]，有利于孔隙和孔隙连通结构的形成材料平均孔隙率为76.72%，接近78%，同时其表面结构粗糙，这些特点为细胞的黏附生长提供了良好环境^[23-25]。为了保证材料在具有较高孔隙率的情况下维持足够的抗压强度，实验采用涂2层羟基磷灰石烧结的泡沫陶瓷，保证材料中羟基磷灰石的占有比，最终测量其实际抗压强度为(11.60±1.35) MPa。以上研究表明，羟基磷灰石/ZrO₂复合材料与骨组织力学性能相似，植入体内后可在骨修复过程中发挥重要作用^[26]。将羟基磷灰石/ZrO₂复合材料植入体内后，可被人体溶解吸收^[27-28]，说明其具有可降解性。羟基磷灰石/ZrO₂复合材料的可降解性能确保了材料不会长时间存在于体内，可减少不良反应的发生。

为确保材料植入体内后不会产生有害物质危及生命^[29]，对材料做了致突变与细胞毒性实验。实验中将不同浓度的羟基磷灰石/ZrO₂复合材料溶液置于鼠伤寒沙门氏菌中，回复突变克隆数与DMSO对照组对比均未达到2倍，且无背景菌落产生，说明该材料及其代谢产物无致突变或致癌作用^[30]。用L929细胞对材料细胞毒性进行检测，实验组和阴性对照组细胞存活率都高达99%，说明该材料也无细胞毒性。羟基磷灰石/ZrO₂泡沫陶瓷材料中的重要成分羟基磷灰石，无致突变作用和细胞毒性已被证实^[31]，ZrO₂作为优异的黏合剂也被证实无细胞毒性^[32]。但ZrO₂的致突变作用还未曾报道，因此对于羟基磷灰石/ZrO₂材料有无致突变作用还没有定论。若羟基磷灰石/ZrO₂复合材料应用于临床，必须满足一定的生物相容性和低毒性^[33]，所以材料的致癌性不明，将直接影响材料的发展。而此次实验证明，羟基磷灰石/ZrO₂多孔泡沫陶瓷材料无致突变和细胞毒性，对其安全性做出了客观性评价。

在确定材料安全性后，可将羟基磷灰石/ZrO₂与种子细胞结合，构建组织工程骨。在组织工程骨中，细胞和材料相互作用，会影响成骨细胞增殖分化的过程^[34]，因此细胞能否在材料上增殖分化就至关重要。在种子细胞的选择上，作者选用目前新型种子细胞人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞。据报道人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞具有增殖及向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化潜能^[35-37]，是一种可能成为治疗骨骼疾病的细胞^[38]。实验将人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞在羟基磷灰石/ZrO₂多孔泡沫陶瓷材料上体外培养后，碱性磷酸酶值会随着时间的延长而增长，说明细胞在初期可黏附于材料表面结构粗糙上并开始增殖分化，随着细胞的增多，碱性磷酸酶量也随之增加，故可推断细胞在材料上生长具有较强的成骨分化能力。该推断可从培养第14天的荧光电镜和扫描电镜观察结果证实，众多细胞黏附于材料之上，复合体Ⅰ型胶原的表达量较多。通过实验可发现人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞可在羟基磷灰石/ZrO₂材料上黏附生长，且具有一定的成骨分化能力。因此人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞复合羟基磷灰石/ZrO₂材料，可能成为新型组织工程骨研究的主流之一。

羟基磷灰石/ZrO2泡沫陶瓷材料的孔隙率为(76.72± 0.75)%，名义抗压强度为(2.71±0.40) MPa，实际抗压强度为(11.60±1.35) MPa；该材料及其代谢物无细菌毒性；CCK-8毒性实验说明该材料无细胞毒性；将材料与人工诱导多能干细胞来源间充质干细胞体外培养后，细胞具有一定的增殖及成骨分化能力，且细胞形态良好，为该材料进一步的体内研究及临床应用提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

羟基磷灰石复合二氧化锆泡沫陶瓷的理化性能与细胞化性能

Physicochemical properties and cellularization of hydroxyapatite/zirconium dioxide foam ceramics

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