1.1 设计 体外观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2019年3月至2020年3月在滨州医学院附属医院实验室完成。
1.3 材料 淫羊藿苷(上海如吉生物)；聚己内酯(sigma，美国)；扫描电镜(EVOLS15，Zeiss，德国)；激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，日本)；CO2细胞培养箱(SANYO公司，日本)；酶标仪(SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美国)；紫外-可见光分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美国)；荧光实时定量 PCR 仪(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亚)；α-MEM 培养液(Hyclone)；CCK-8 检测试剂盒(碧云天)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)；N，N-二甲基甲酰胺(国药试剂)；三氯甲烷(国药试剂)；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)；PCR试剂盒(SYBR Premix ExTaqTM，Takara，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 向MC3T3-E1细胞(四川大学赠送)添加α-MEM 培养基(含体积分数10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素)，置于37 ℃、体积分数5%CO2 培养箱中培养，24 h冲洗换液，传代3次后备用。
1.4.2 静电纺丝纳米纤维膜的制备 使用移液枪在避光条件下吸取300 µL二甲基亚砜滴入无菌玻璃瓶内，加入淫羊藿苷粉末20 mg，吹打振荡使药物完全溶解；吸取10 µL上述溶液，使用α-MEM 培养基将淫羊藿苷稀释至10-5 mol/L， 4 ℃冰箱避光保存备用。
使用移液枪准确吸取7.5 mL三氯甲烷和2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺滴入到无菌玻璃瓶内，加入聚己内酯2.4 g，置于常温磁力搅拌机搅拌24 h至聚己内酯全部溶解，直至溶液干净透亮，静置半小时。使用2个10 mL的注射器分别吸取10 mL淫羊藿苷溶液及10 mL聚己内酯溶液并将其固定在微量注射泵上，连接高压静电装置，通过聚氯乙烯管与9号针头(内径为 0.6 mm)相连，针头尖端直流高压电正极，平整锡箔纸固定于接收板上与高压电的负极相连同时将导线接地，设定参数：流速为 3 mL/h，高压电压为(25.0±0.5) kV，接收距离为 15 cm，在室温和相对湿度60%湿度条件下制备淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜。同样的环境下制备单纯聚己内酯纳米纤维膜。完成后将锡箔纸置于真空干燥箱内 24 h，小心取下即获得静电纺丝纳米纤维薄膜。
1.4.3 纳米纤维膜微观形貌 将淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜裁剪成10 mm×10 mm样本，用导电胶将其固定在观测台上，喷金60 s后扫描电镜观察孔径并计算统计纤维平均直径。
1.4.4 淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜体外释药实验 避光下称取淫羊藿苷10 mg，添加150 µL DMSO彻底溶解，用无菌PBS稀释至100 mL。使用移液器分别取0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，3.0 mL淫羊藿苷溶液放置在6个试管中，PBS定容到20 mL，作为标准浓度，使用紫外分光光度计测定标准吸光度值A270 nm。
将淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜紫外线照射消毒1 h，置入含40 mL无菌PBS的密闭容器中，37 ℃恒温水浴箱振荡(100 r/min)。在第1，3，5，7，9，15，20，25，30天的同一时间点分别取出5 mL纤维膜释放液于离心管中，4 ℃恒温保存备用，同时向原溶液中注入5 mL PBS以保证原容积不变。紫外分光光度计分别测试释放液吸光度值A270 nm，测算其药物释放浓度。每组样本重复3次，取平均值作为最终药物释放量，绘制累积药物释放曲线。
1.4.5 激光共聚焦显微镜观察细胞形态 将淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜紫外线照射消毒1 h，置于24孔板中，接种细胞浓度为5×107 L-1的细胞爬片，每孔加入1 mL细胞悬液，分4组：空白组常规培养细胞，纳米纤维膜组加入聚己内酯纳米纤维膜，药物组加入含10-5 mol/L淫羊藿苷的培养基，实验组加入淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜。恒温箱静置培育 24 h，吸净培养液，使用37 ℃预热PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS复洗3次，每次10 min。取100 nmol/L的罗丹明-鬼笔环肽 200 μL覆盖爬片上的细胞，室温避光孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，抗荧光猝灭封固，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞三维骨架形态。
1.4.6 细胞增殖检测 将淫羊藿苷/聚己内酯纤维膜紫外线照射消毒1 h，置于96孔板中备用。选取处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，以5×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板内，每孔100 μL，按照1.4.5分组处理，每组设置5个复孔。培养 1，4，7 d 时，每孔加入10 μL CCK-8 混合液孵育1 h，用酶标仪于450 nm 波长测定吸光度值。
1.4.7 碱性磷酸酶活性检测 将淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜紫外照射消毒，置于6孔板中备用。将MC3T3-E1细胞以5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，每孔1 mL，按照1.4.5分组处理，每组设置3个复孔。培养24 h细胞贴壁后，空白组、纳米纤维膜组、实验组更换为成骨诱导液(含a-MEM培养液、1.0 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L维生素C和100 mmol/L地塞米松)，单纯药物组更换为含10-5 mol/L淫羊藿苷的成骨诱导液。诱导培养 7，14，21 d后弃原培养液，每孔加入200 μL细胞裂解液，充分裂解后收集细胞，离心后取上清，按碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定 405 nm处的吸光度值。
1.4.8 RT-qPCR 检测细胞骨钙素mRNA表达 将MC3T3-E1细胞以3×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板内，每孔2 mL，按照1.4.5分组处理，每组设置3个平行复孔。培养24 h细胞贴壁后，空白组、纳米纤维膜组、实验组更换为成骨诱导液(含a-MEM培养液、1.0 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L维生素C和100 mmol/L地塞米松)，单纯药物组更换为含10-5 mol/L淫羊藿苷的成骨诱导液。诱导7 d后提取各组细胞总RNA，分光光度计检测总RNA纯度，结果显示各组A260 nm/A280 nm值均在1.7-2.1之间，说明其纯度较高，参照反转录说明书合成 cDNA。内参GADPH及骨钙素引物的合成，见表1。
RT-qPCR 反应采用荧光染料法(参照 SYBR Premix Ex Taq说明)，反应条件为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性
5 s，60 ℃退火30 s，45个循环。选择20 μL 体系：SYBRⅡ
10 μL，上游引物、下游引物各 0.8 μL，RT反应液1.6 μL，DEPC水6.8 μL。收集荧光信号进行分析，使用荧光阈值表示RT-qPCR 结果，定义空白组基因表达量为 1，根据公式(2-∆∆Ct)计算目的基因表达量，获得每组基因的相对表达量。
1.5 主要观察指标 淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜的微观形貌、药物累积释放曲线，以及对MC3T3-E1细胞增殖与分化的影响。
1.6 统计学分析 采用 SPSS 21.0 软件进行统计学分析，数据采用x±s 表示。组间差异比较采用单因素方差分析，实验组组间两两比较采用 t 检验，以 P < 0.05 为差异有显著性意义。
