血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2200

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2953-2957.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2200

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血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

魏琴1，张雪2，马磊3，李志强1，寿玺1，段明军1，吴硕4，贾麒钰4，马创4

1新疆医科大学动物实验中心，新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；新疆医科大学第一附属医院，2临床医学研究院，4骨科中心显微修复外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；3新疆医科大学第二附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2020-03-20 修回日期:2020-03-25 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 马创，博士，主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:魏琴，女，1980年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2014年新疆医科大学毕业，硕士，实验师，主要从事细胞培养及组织工程研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区高校科研计划(XJEDU2020Y022)，项目负责人：魏琴；国家自然科学基金(81760397)，项目负责人：马创

Platelet-derived growth factor-BB induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

Wei Qin1, Zhang Xue2, Ma Lei3, Li Zhiqiang1, Shou Xi1, Duan Mingjun1, Wu Shuo4, Jia Qiyu4, Ma Chuang4

1Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Clinical Medical Research Institute of First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Department of Microrestorative Surgery

Received:2020-03-20 Revised:2020-03-25 Accepted:2020-05-09 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Ma Chuang, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Microrestorative Surgery, Department of Orthopedics Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wei Qin, Master, Experimentalist, Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Scientific Research Plan of Universities in Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. XJEDU2020Y022 (to WQ); the National Natural Science Foundation of China, No. 81760397 (to MC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是目前组织工程骨研究领域内最成熟也是运用最多的种子细胞，已经证实具有多向分化潜能，可以向成骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、成血管细胞等分化，并具有自身免疫原性弱、操作方便的特点。
血小板衍生生长因子BB：血小板衍生生长因子最初从血小板中分离出来，是间充质干细胞迁移和增殖的关键生长因子，主要由血小板、内皮细胞、巨噬细胞产生，大量试验证实血小板衍生生长因子BB在骨折愈合早期就出现，作用贯穿全程，各阶段均能够有效诱导软骨细胞及成骨细胞增殖，同时可提高破骨细胞活性、加速骨吸收，促进骨重塑。

背景：研究表明，小鼠前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB可以促进成骨细胞和成血管细胞形成，尚无血小板衍生生长因子BB是否可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的相关研究。
目的：探讨血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可行性。
方法：①体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，第3代细胞经流式鉴定其表面标记物CD45、CD29和CD34的表达，选用纯度较高的骨髓间充质干细胞进行血小板衍生生长因子BB干预实验；②第3代骨髓间充质干细胞经25 μg/L血小板衍生生长因子BB诱导3 d，进行Ⅰ型胶原免疫荧光染色，然后采用碱性磷酸酶改良钙钴法和偶氮偶联法、茜素红法对细胞进行染色，鉴定成骨细胞的表面特征，最后采用RT-PCR检测Runx-2和Gli-2的mRNA水平。
结果与结论：①经细胞免疫荧光染色，诱导后细胞的Ⅰ型胶原绿色荧光表达率>90%；②经碱性磷酸酶改良钙钴法染色，可见细胞胞质中有黑色条索状附着，说明这些细胞均表达有活性的碱性磷酸酶；经碱性磷酸酶偶氮偶联法染色，可见细胞胞浆中含有蓝色的有活性的碱性磷酸酶；经茜素红染色，可见细胞聚集在一起形成小的红色的钙结节；③经RT-PCR检测，血小板衍生生长因子BB诱导后Gli-2和Runx-2的mRNA表达均高于未诱导骨髓间充质干细胞(P < 0.05)；④结果表明，大鼠骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导后可以分化为具有功能的成骨细胞。
https://orcid.org/0000-0003-0344-8305(魏琴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 血小板衍生生长因子BB, 成骨细胞, 钙结节, 碱性磷酸酶

Abstract: BACKGROUND: It has been shown that platelet-derived growth factor-BB secreted by mouse osteoclasts can promote the formation of osteoblasts and vascular cells. Whether platelet-derived growth factor-BB can promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts has not been studied.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of platelet-derived growth factor-BB on inducing bone marrow mesenchymal stem cells of rats into osteoblasts.
METHODS: (1) The bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro. The surface markers CD45, CD29 and CD34 of the third generation were identified by flow cytometry. Bone marrow mesenchymal stem cells with high purity were selected for platelet-derived growth factor-BB intervention experiments. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were induced by 25 μg/L platelet-derived growth factor-BB for 3 days. Cellular immunofluorescence was used to identify type I collagen, followed by alkaline phosphatase modified calcium-cobalt method and azo coupling method kit, alizarin red method. The surface characteristics of osteoblasts were identified. Finally, RT-PCR was used to detect the mRNA levels of Runx-2 and Gli-2 genes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cellular immunofluorescence staining showed that the green fluorescence expression rate of type I collagen was more than 90% after induction. (2) Alkaline phosphatase modified calcium-cobalt method demonstrated that black cords were attached to the cytoplasm of the cells, indicating that these cells expressed active alkaline phosphatase. Alkaline phosphatase azo coupling method showed that blue active alkaline phosphatase was found in the cytoplasm of cells. Alizarin red staining exhibited that induced cells gathered together to form small red calcium nodules. (3) RT-PCR showed that the mRNA levels of Gli-2 and Runx-2 genes were higher than those in bone marrow mesenchymal stem cells after platelet-derived growth factor-BB induction (P < 0.05). (4) It is concluded that rat bone marrow mesenchymal stem cells can be differentiated into functional osteoblasts after being induced by platelet-derived growth factor-BB.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, platelet-derived growth factor BB, osteoblasts, calcium nodules, alkaline phosphatase

中图分类号:

魏琴, 张雪, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 贾麒钰, 马创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.

Wei Qin, Zhang Xue, Ma Lei, Li Zhiqiang, Shou Xi, Duan Mingjun, Wu Shuo, Jia Qiyu, Ma Chuang. Platelet-derived growth factor-BB induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2953-2957.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞原代培养细胞形态及血小板衍生生长因子BB诱导后的形态改变原代培养首次换液后，可见细胞均匀铺满瓶底，呈两极或多极生长，10 d左右细胞融合率可达90%，即可传代。选用第3代细胞经血小板衍生生长因子BB干预，第2天镜下可见少部分漂浮细胞，第3天可见细胞形态由原来的扁平棉絮状生长变成成簇状生长，镜下折光性好，散落的细胞多为两极生长，见图1。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定结果经流式细胞仪鉴定，间充质干细胞抗原CD29呈阳性表达(94.7%)，CD45、CD34呈阴性表达(3.1%，0.2%)，见图2。

2.3 Ⅰ型胶原免疫荧光鉴定结果血小板衍生生长因子BB诱导3 d的骨髓间充质干细胞都有绿色荧光表达，见图3。从图中可以看到未经血小板衍生生长因子BB诱导的骨髓间充质干细胞荧光表达率较低，而经过诱导的细胞绿色荧光表达率>90%。

2.4 碱性磷酸酶染色及茜素红染色鉴定成骨细胞血小板衍生生长因子BB诱导第3天进行成骨分化能力鉴定。经碱性磷酸酶改良钙钴法染色，胞质中有黑色硫化钴沉淀的即为酶活性部位，从图4A1，A2中可见细胞胞质中有黑色条索状附着，说明这些细胞均表达有活性的碱性磷酸酶。经碱性磷酸酶偶氮偶联法鉴定，成骨细胞内碱性磷酸酶可以使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞浆，见图4B1，B2。经茜素红染色鉴定，诱导后的细胞聚集在一起形成小的红色的钙结节，见图4C1，C2。

2.5 Runx-2和Gli-2的mRNA水平血小板衍生生长因子BB诱导组的Runx-2、Gli-2 mRNA表达量明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年12月在新疆医科大学实验室与设备管理处完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性健康SPF级SD大鼠10只，4周龄，体质量(120±20) g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK(新)2013-0001。所有SD大鼠均在新疆医科大学动物实验室按照国际AAALAC标准统一管理，动物实验经过新疆医科大学第一附属医院实验动物与使用管理委员会审核，伦理审批号为IACUC20170706-02。
1.3.2 实验试剂及仪器 α-MEM培养基、澳洲胎牛血清(Gibco
公司)；1%青链霉素、0.25%trypsin-0.02%EDTA消化液、PBS(Hyclone公司)；CD34抗体(Abcam公司)；CD29抗体(BD公司)；CD45抗体(eBioscience公司)；血小板衍生生长因子BB(Catalog: 520-BB；R&D公司)；兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体(北京博奥生物技术有限公司)；碱性磷酸酶改良钙钴法染液、碱性磷酸酶偶氮偶联法染液(北京雷根)；茜素红染色液(北京索莱宝)；RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)；转录试剂盒
(Takara，日本)；引物序列(上海生物工程公司，中国)；CO2恒温培养箱、酶标仪(Thermo公司)；流式细胞仪(BD公司)；荧光倒置显微镜(Zeiss公司)；RT-PCR仪(Bio-RAD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养大鼠颈椎脱臼后，取股骨骨髓用于骨髓干细胞原代培养，具体方法详见参考文献[15]。待细胞传至第3代，消化后用于流式细胞检测。
1.4.2 流式细胞术鉴定取4瓶第3代骨髓间充质干细胞进行消化，待消化完全时，分别加入1 mL完全培养基(体积分数为10%胎牛血清+100 U/mL青链霉素+1%谷氨酰胺+
α-MEM培养基)，每瓶细胞收集于单独的1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗细胞3次，最后用200目筛网过滤，每管计数细胞约1×109 L-1，分别加入CD45、CD34、CD29抗体，4 ℃孵育30 min，PBS清洗细胞1次，重悬于1 mL PBS，上流式细胞仪检测CD29、CD34、CD45的抗原表达量。

1.4.3 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞定向分化经前期实验验证25 μg/L血小板衍生生长因子BB干预3 d
时细胞增殖分化最佳[15]。经流式鉴定后的骨髓间充质干细胞消化接种于共聚焦小皿及24孔板中，待细胞长至60%左右加入含25 μg/L血小板衍生生长因子BB的α-MEM完全培养基培养3 d，镜下观察细胞形态学改变。
1.4.4 Ⅰ型胶原免疫荧光鉴定经流式鉴定后的骨髓间充质干细胞消化接种于共聚焦小皿，待细胞长至50%左右加入含25 μg/L血小板衍生生长因子BB的α-MEM完全培养基培养
3 d，PBS清洗3遍，加入兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体(1∶100稀释)，4 ℃孵育过夜，加入DAPI，室温孵育5 min，激光共聚焦显微镜拍照。
1.4.5 碱性磷酸酶(改良钙钴法)鉴定经流式鉴定后的骨髓间充质干细胞消化接种于铺有盖玻片的24 孔板中，并设置对照组3孔，血小板衍生生长因子BB诱导组3孔，待细胞长至60%左右加入血小板衍生生长因子BB干预3 d，PBS清洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3遍，滴加配置好的碱性磷酸酶基质液，避光孵育15 min，吸去多余液体，滴加硝酸钴溶液，蒸馏水洗30 s，吸弃，滴加硫化液，避光孵育30 min，蒸馏水洗3遍×3 min，滴加碱性磷酸酶染液，蒸馏水洗3遍×3 min，吸弃液体，待样品干后取出封固。
1.4.6 碱性磷酸酶(偶氮偶联法)鉴定经流式鉴定后的骨髓间充质干细胞消化接种于铺有盖玻片的24 孔板中，并设置对照组3孔，血小板衍生生长因子BB诱导组3孔，待细胞长至60%左右加入血小板衍生生长因子BB干预3 d，PBS 清洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3遍，滴加配好的碱性磷酸酶孵育液，避光孵育20 min，PBS清洗3遍，加入甲基绿复染3 min，PBS洗3遍×3 min，吸弃液体，待样品干后取出封固。
1.4.7 茜素红染色鉴定经流式鉴定后的骨髓间充质干细胞消化接种于铺有盖玻片的24 孔板中，并设置对照组3孔，血小板衍生生长因子BB诱导组3孔，待细胞长至60%左右加入血小板衍生生长因子BB干预3 d，PBS清洗2遍，40 g/L
多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3遍，滴加茜素红S染液，避光孵育20 min，PBS洗3遍×3 min，吸弃液体，待样品干后取出封固。
1.4.8 RT-PCR检测成骨Runx-2和Gli-2 mRNA表达收集对照组及血小板衍生生长因子BB干预组细胞，PBS洗2遍，加入
1 mL Trizol裂解，充分混匀，室温放置5 min，加入500 μL氯仿，剧烈振荡，静置后12 000 r/min离心10 min，取上层水相于新EP管中，加入500 μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置
10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL无水乙醇，涡旋混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥约
40 min，用30 μL DEPC水溶解，测定其纯度、浓度，选择纯度值>1.8的总RNA，然后反转录获得cDNA，用SYBR Green试剂盒检测细胞Runx-2和Gli-2 mRNA的表达，反应体系为
20 μL，退火温度为55 ℃。实验重复3次。结果应用公式X= 2-ΔΔCT法分析。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞生长情况及血小板衍生生长因子BB诱导后的形态改变；②血小板衍生生长因子BB诱导后Ⅰ型胶原免疫荧光鉴定结果；③血小板衍生生长因子BB诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定结果；④血小板衍生生长因子BB诱导后Gli-2和Runx-2的mRNA表达。
1.6 统计学分析实验数据采用x±s表示，运用SPSS 23.0软件进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

众所周知，经典的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的时间为14-21 d[16]，期间存在换液传代，可能出现细胞污染、细胞死亡等问题。该实验引入新的诱导因子血小板衍生生长因子BB，前期实验验证25 μg/L血小板衍生生长因子BB干预3 d时细胞增殖分化最佳，该实验就血小板衍生生长因子BB诱导后的成骨细胞特征及其基因表达方面进行了论述。
研究报道，小鼠前破骨细胞分泌的血小板衍生生长因子BB可以促进成骨细胞和成血管细胞形成[17-19]。作为一种多功能生物活性细胞因子，血小板衍生生长因子通过自分泌以及旁分泌进入细胞外基质，作用于靶细胞，一定浓度时可促进成骨细胞增殖分化[20-21]。成骨细胞是骨形成过程中最为重要的种子细胞，血小板衍生生长因子可以显著促进成骨细胞的增殖、加速骨基质形成[22-24]。该实验首先培养出纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞，经流式鉴定纯度可达95%，为下一步诱导实验打下良好的实验基础。细胞经血小板衍生生长因子BB诱导后首先通过细胞免疫荧光染色比较了诱导前后的Ⅰ型胶原表达，结果显示血小板衍生生长因子BB诱导后Ⅰ型胶原表达明显增加，Ⅰ型胶原作为成骨细胞分化过程的早期标志之一，是成骨细胞成熟的重要标志[25]。碱性磷酸酶是成骨细胞的标志性活性酶，实验采用改良钙钴法和偶氮偶联法2种碱性磷酸酶染色都证实了诱导后的细胞含有成骨细胞的标志性活性酶，同时茜素红染色也说明了聚集在一起的细胞形成成团的钙结节，这些都标志着骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导后能够分化为成骨细胞。
该实验又从基因水平进行了成骨早期表达基因Gli-2和下游基因Runx-2的检测。Gli基因的缺失影响骨代谢，导致骨生成量减少，延迟骨折愈合[26]。OLIVEIRA等[27]发现通过激活间充质干细胞的 Hedgehog通路，上调Gli受体表达，能够增强成骨过程中Runx-2基因的表达水平。研究显示，在 Hedgehog-Gli1信号通路关键的跨膜传感器Smo基因敲除小鼠中，Runx-2表达水平显著下降，导致成骨分化进程受阻，继而发生骨质疏松等病理特征[28]，足以说明Runx-2在成骨分化和骨形成方面起重要作用，是启动成骨作用的一个关键转录因子[29]。实验结果显示，经血小板衍生生长因子BB诱导后Gli-2和Runx-2表达均高于对照组，说明诱导后的细胞不但在表面特征上符合成骨细胞的特点，在功能上也具备了成骨细胞的能力。
综上所述，该研究初步验证了大鼠骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导3 d，可以得到纯度较高的成骨细胞，为下一步组织工程骨移植奠定了实验基础，同时课题组研究了大鼠骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导3 d可以向血管内皮细胞分化，主要为加快牵张成骨模型中骨缺损新骨生成提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

Platelet-derived growth factor-BB induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts

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