TiO2纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3022

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (10): 1500-1506.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3022

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TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性

张利兴1，田昂2，李锡1，白希壮1

1中国医科大学人民医院运动医学与关节外科，辽宁省沈阳市 110016；2东北大学材料与冶金学院，辽宁省沈阳市 110819

收稿日期:2020-02-13 修回日期:2020-02-22 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-04-08 发布日期:2020-12-17
通讯作者: 白希壮，教授，中国医科大学人民医院运动医学与关节外科，辽宁省沈阳市 110016
作者简介:张利兴，男，1992年生，辽宁省葫芦岛市人，汉族，中国医科大学人民医院在读硕士，主要从事骨科领域生物材料的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81671811)

Drug-release characteristic and biological toxicity of TiO₂ nanotube/hydroxyapatite loaded vancomycin coating

Zhang Lixing1, Tian Ang2, Li Xi1, Bai Xizhuang1

1Department of Sports Medicine and Joint Surgery, People’s Hospital of China Medical University, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 2School of Materials and Metallurgy, Northeastern University, Shenyang 110819, Liaoning Province, China

Received:2020-02-13 Revised:2020-02-22 Accepted:2020-05-09 Online:2021-04-08 Published:2020-12-17
Contact: Bai Xizhuang, Professor, Department of Sports Medicine and Joint Surgery, People’s Hospital of China Medical University, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Zhang Lixing, Master candidate, Department of Sports Medicine and Joint Surgery, People’s Hospital of China Medical University, Shenyang 110016, Liaoning Province, China2020-02-13
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671811

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
TiO2纳米管：二氧化钛金属表面改性的一种常见方式，具备一端开口的纳米管型结构，可通过阳极氧化方式进行制备。因其结构的容纳性可作为药物载体，此外由于形貌特点，其本身具备一定的生物相容性能和抑制细菌黏附性能。
羟基磷灰石：为人体骨组织无机物的重要组成部分，具备良好的生物相容性能。作为植入的羟基磷灰石涂层可通过表面固溶离子交换的方式在局部形成富钙磷微环境，促进与正常骨组织的整合。

背景：在钛金属表面改性和涂层化修饰的方案中，表面纳米管改性及羟基磷灰石涂层修饰构建的药物缓释体系具有广阔的临床应用前景。
目的：构建载盐酸万古霉素的二氧化钛纳米管/羟基磷灰石复合载药涂层，研究复合涂层的体外药物缓释性能及细胞毒性。
方法：以两步阳极氧化法在钛表面制备二氧化钛纳米管涂层，再通过电泳沉积方法制备羟基磷灰石涂层，从而得到钛基表面纳米管/羟基磷灰石的复合涂层结构。随后以该复合涂层为药物承载平台，通过物理吸附方式进行盐酸万古霉素的装载，最终得到载药复合涂层。检测载药二氧化钛纳米管涂层、载药羟基磷灰石涂层、载药复合涂层的体外释药性能。利用不同浓度的载药复合涂层浸提液培养人成骨细胞，采用MTT法检测细胞毒性。将人成骨细胞分别接种于羟基磷灰石涂层、二氧化钛纳米管涂层、载药复合涂层表面，观察细胞形态变化。
结果与结论：①相较于载药二氧化钛纳米管涂层与载药羟基磷灰石涂层，载药复合涂层具有更长的药物缓释效能，药物释放时间超过了150 h；②在10%，50%，100%浓度的载药复合涂层浸提液中，成骨细胞的相对活性均>70%，无明显细胞毒性；③3种涂层表面的成骨细胞生长良好，细胞骨架完整，细胞的核质比例正常，与单纯培养的细胞形态无明显无别；④结果表明，二氧化钛纳米管/羟基磷灰石/盐酸万古霉素涂层具有良好的体外药物缓释性能，无明显的细胞毒性。

https://orcid.org/0000-0001-5735-4289 (张利兴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 载药涂层, 植入材料, 感染, 电泳沉积, 二氧化钛纳米管, 羟基磷灰石, 药物缓释, 细胞毒性

Abstract: BACKGROUND: In the scheme of titanium surface modification and coating modification, the drug sustained-release system constructed by surface nanotube modification and hydroxyapatite coating modification has broad clinical application prospects.
OBJECTIVE: To construct composite drug loading coating of titanium dioxide nanotube/hydroxyapatite loaded with vancomycin hydrochloride, and analyze the drug release performance and cytotoxicity of the composite coating in vitro.
METHODS: A two-step anodic oxidation method was used to construct titanium dioxide nanotubes on the titanium surface, and the prepared hydroxyapatite was loaded on the surface of the nanotubes by electrophoretic deposition, so as to obtain a nanotube/hydroxyapatite composite coating structure. Subsequently, the composite coating was used as a drug-loaded platform, and vancomycin hydrochloride was loaded by physical adsorption to finally obtain a composite drug-loaded coating. The in vitro drug release properties of hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride, titanium dioxide nanotubes/vancomycin hydrochloride, titanium dioxide nanotubes/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride coating were measured. Human osteoblasts were cultured with titanium dioxide nanotubes/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride coating extracts of different concentrations. MTT assay was used to detect cytotoxicity. Human osteoblasts were inoculated on the surface of hydroxyapatite, titanium dioxide nanotubes, titanium dioxide nanotubes/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride, and the changes of cell morphology were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride, titanium dioxide nanotube/vancomycin hydrochloride coating, titanium dioxide nanotube/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride coating had a longer drug sustained-release effect. The release time exceeded 150 hours. (2) The 10%, 50%, and 100% concentration of titanium dioxide nanotubes/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride coating extract had no obvious cytotoxicity. The relative activity of osteoblasts was more than 70%. (3) The osteoblasts on the three kinds of coating surface grow well; the cytoskeleton was intact; and the nucleus-cytoplasm ratio of the cells was normal, which was not significantly different from the morphology of the cells in pure culture. (4) The results show that the coating of titanium dioxide nanotubes/hydroxyapatite/vancomycin hydrochloride has good drug release properties in vitro without obvious cytotoxicity.

Key words: material">, drug loaded coating">, implant materials">, infection">, electrophoretic deposition">, titanium dioxide">, nanometer">, hydroxyapatite">, drug release">, cytotoxicity

中图分类号:

张利兴, 田昂, 李锡, 白希壮. TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1500-1506.

Zhang Lixing, Tian Ang, Li Xi, Bai Xizhuang. Drug-release characteristic and biological toxicity of TiO₂ nanotube/hydroxyapatite loaded vancomycin coating[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(10): 1500-1506.

图/表（结果） 9

2.1 扫描电镜检测结果二氧化钛纳米管表现为规则排列，一端开口的管状结构，其管径大约为100 nm，见图1A；电泳沉积纳米管表面的羟基磷灰石表现为堆积的颗粒，颗粒直径约为100 nm，完全覆盖于纳米管的表面，见图1B；装载的药物吸附于制备羟基磷灰石涂层表面，见图1C。

2.2 能谱分析检测结果复合涂层表面的主要成分为钙和磷，见图2A；装载药物后复合涂层表面氯元素升高，证明了万古霉素在涂层表面的有效负载，除氯元素外其表面的钙磷元素则是其基底羟基磷灰石的反映，此外涂层表面可见升高的钠元素，见图2B，其原因是用于溶解盐酸万古霉素的无菌PBS中含有钠盐。

2.3 X射线衍射物相分析检测结果对制备的粉体、纳米管成分进行物相分析，结果显示：粉体的主要成分为羟基磷灰石，而钛表面涂层成分为二氧化钛纳米管。对复合涂层及载药复合涂层物相分析，发现与二氧化钛纳米管和羟基磷灰石相对应的峰，见图3，表明通过电泳化学法制备的复合涂层未改变表层的羟基磷灰石构成，而加载药物后涂层成分也未发生变化。

2.4 载药复合涂层药物缓释结果
药物标准曲线：在281 nm的吸收波长下，盐酸万古霉素的吸光度和浓度之间存在线性关系，为A=0.000 21C+ 0.001 579(R2=0.995 1)，见图4。

涂层累计释药量随时间变化结果：载药羟基磷灰石涂层在100 h内药物释放达到了总的载药量4 mg，载药二氧化钛纳米管涂层药物释放时间达到超过100 h，载药复合涂层药物释放时间超过了150 h，见图5。相比于载药二氧化钛纳米管涂层、载药羟基磷灰石涂层，载药复合涂层达到了更长的药物释放时间。涂层累计释药率随时间变化结果：载药羟基磷灰石涂层和载药二氧化钛纳米管涂层在前6 h的药物释放率超过了50%，载药复合涂层在12 h释药率达到50%，随后各组均有一个涂层缓释阶段，但载药复合涂层有比载药羟基磷灰石涂层和载药二氧化钛纳米管涂层更长的释药效能，见图6。各组前期药物快速释放之后药物会缓慢释放，其原因是吸附于涂层表面的药物会在几小时内快速释放，而装载在涂层及纳米管内部的药物则会随时间逐渐释放出来，表现出一定的药物缓释效能。

2.5 复合载药涂层的细胞毒性结果
细胞形态检测结果：与人成骨细胞共培养1 d时，阴性对照组、10%浸提液组、50%浸提液组细胞分布均匀，生长状态良好，100%浸提液组和阳性对照组部分细胞缩小变圆。共培养3，5 d时，100%浸提液组和阳性对照组缩小变圆细胞数目降低，其余各浓度组细胞密度升高，排列紧密，见图7。

MTT实验检测结果：培养1，3，5 d时，各浓度载药复合涂层浸提液组间吸光光度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，计算各组细胞相对活力均>70%，无明显细胞毒性，见表1。

细胞黏附生长形态检测：罗丹明-鬼笔环肽染色显示(图8)，载药复合涂层表面细胞生长良好，细胞骨架完整，细胞核圆、居中，细胞的核质比例正常，相比于空白组、二氧化钛纳米管涂层组和复合涂层组细胞黏附生长状态无明显差别，细胞无骨架破损、紊乱，细胞能在载药复合涂层表面正常黏附生长，涂层对表层黏附细胞无毒性作用。

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引言

根据Grand View Research的最新报告，2015年全球骨科植入物市场价值为43亿美元，预计到2024年骨科植入物市场将达到62亿美元，激增的老年人口和运动损伤人数推动了对外科植入物的需求[1]。在外科植入物中，金属占据着重要位置，尤其是钛及其合金，金属钛因良好的耐腐蚀性、较低杨氏模量、类似皮质骨的机械性能及良好的生物相容性在临床上得到广泛应用[2-5]。但钛金属本身无抗菌性，并不能抑制感染的发生，而感染又是目前临床上不容忽视和亟待解决的难题，感染发生时细菌易于在假体表面形成生物膜，只能通过大剂量抗生素或手术移除植入物来消除感染[6-7]，大剂量应用抗生素会对患者产生毒副作用[8]，假体取出手术不仅对患者造成二次伤害，还会给患者带来沉重的经济负担[9]。故而通过金属表面改性和涂层化修饰构建一种局部给药系统，局部药物缓释预防假体感染无疑是一个更好的策略。但目前构建的载药涂层存在着早期爆发性释放和难以持续缓释的问题，而且构建的复合涂层在发挥药物缓释效能的基础上也要确保其对正常组织无毒副作用。
在钛金属表面改性和涂层化修饰的方案中，表面纳米管改性及羟基磷灰石涂层修饰构建的药物缓释体系具有广阔的临床应用前景。二氧化钛纳米管具有一端开口的管状结构，在装载和释放生物活性药物方面已经得到证实[10-11]。羟基磷灰石是人体骨骼重要的无机组成成分，有良好的生物学活性[12]，其作为药物载体也具备一定的潜力[13-20]。课题组前期通过电化学法制备了大管径二氧化钛纳米管表面羟基磷灰石，其具备良好的促成骨性能[21]，通过仿生沉积对两种材料进行整合，构建纳米管表面羟基磷灰石复合载药涂层也表现出了良好的体外药物缓释性能[22]。结合前期研究经验，实验采用电泳化学沉积方法来整合钛纳米管和羟基磷灰石两种材料，电泳化学沉积是一种快速非线性的涂层构建方式，其不仅能够在各种形貌的基底表面构建出均匀涂层，并且也不会对复合涂层成分造成影响。在成功构建涂层后，以其为药物承载平台进一步构建了局部药物缓释体系，并对涂层药物缓释性能进行研究，同时对构建的复合载药涂层的生物毒性进行评价。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察性实验。
1.2 时间及地点于2018年10月至2019年12月在东北大学材料与冶金实验室和中国医科大学中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 材料及细胞准备将纯度为99.9%的钛金属(江苏)切割成直径32 mm、厚度1 mm的金属圆片，以100，600， 2 000 Cw的碳化硅砂纸打磨抛光金属表面，去离子水冲洗后置于5%的氢氟酸溶液中除去表面氧化层，取出后以离子水清洗吹干备用；羟基磷灰石、人成骨细胞(中国医科大学中心实验室)；铂片(纯度>99.90%，沈阳)。
1.3.2 主要仪器扫描电镜(TESCANS，捷克)；X射线衍射仪(MPDDY2094，荷兰)；直流恒压电源(SKD-1105A，上海)；快速智能一体马弗炉(XL-100，中国)；CO2恒温培养箱(THERMO SCIENTIFIC公司)；倒置荧光显微镜、倒置显微镜(Olympus公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)。
1.3.3 主要试剂四水硝酸钙、磷酸氢二铵、十六烷基三甲基溴化铵(分析纯，国药)；SBF模拟体液(×1，Coolaber公司)；盐酸万古霉素、罗丹明-鬼笔环肽染色剂、DAPI染色剂、MTT噻唑蓝、胰蛋白酶(北京索莱宝公司)；DMEM/F12培养基(Sigma Aldrich公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 钛表面二氧化钛纳米管的制备将钛片固定在做好的聚四氟乙烯模具上，金属铂为阴极，钛为阳极，阴阳极相距5 cm，以乙二醇加上0.5%NH4F为第一步电解液，阳极氧化4 h，用稀氢氟酸溶液将第一步制备的涂层洗掉后，进行第二步阳极氧化，第一步电解液添加0.75%氢氟酸作为第二步电解液，60 V恒定电压阳极氧化4 h，将得到涂层在500 ℃马弗炉中烧结1 h，制备纳米管留置待用。
1.4.2 纳米羟基磷灰石的制备将十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基三甲基溴化铵与最终制得的羟基磷灰石摩尔比为1∶2)溶于去离子水，完全溶解后加入磷酸氢二铵；取另外一干净烧杯，将硝酸钙完全溶解溶于去离子水，将硝酸钙溶液缓慢滴加到磷酸二氢铵溶液中，以氨水调节溶液的pH值≥10，之后将其置于120 ℃水热反应釜中反应3 h，离心干燥得到的粉体700 ℃烧结5 h，得到羟基磷灰石粉体备用[23]。
1.4.3 制备纳米管表面羟基磷灰石涂层
电泳沉积液的准备：将羟基磷灰石粉体加入无水乙醇中制备质量浓度为5 g/L的悬浊液，以盐酸调节溶液pH值为6，磁力搅拌器搅拌，超声波震荡分散。保鲜膜封口后于室温下陈化48 h，得到稳定乳白色的悬浊液待用。
电泳沉积纳米管表面羟基磷灰石涂层：直流稳压电源对陈化稳定后的悬浮液进行电泳沉积，以二氧化钛纳米管为阴极，铂为阳极插入电解液中，阴阳极之间距离为20 mm，以30 V恒定电压室温下电泳沉积3 min，得到涂层用去离子水浸泡30 min，除去表面残留的乙醇和离子；取出后置于120 ℃的烘箱中干燥2 h，再将得到的复合涂层于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后，置于无菌6孔板备用。
1.4.4 复合涂层装载盐酸万古霉素无菌PBS溶解制备 10 g/L的盐酸万古霉素溶液，将400 µL盐酸万古霉素溶液逐次滴加到样品表面，使盐酸万古霉素液体均匀铺展样品表面，最终复合涂层表面药物达到500 µg/cm2。同理制备载药羟基磷灰石涂层(单纯羟基磷灰石涂层)、载药二氧化钛纳米管涂层。
1.4.5 材料的表征检测及成分分析以扫描电镜对制备纳米管、复合涂层、载药复合涂层形貌进行检测，能谱测定涂层元素构成；以X射线衍射仪对制备二氧化钛纳米管、羟基磷灰石粉体、复合涂层及载药复合涂层的表面成分进行检测，扫描范围为20°-90°，扫描时间为10 min。
1.4.6 复合涂层的体外释药性能检测
构建药物的标准曲线：配置不同浓度万古霉素的模拟体液溶液，在281 nm波长下测定不同浓度盐酸万古霉素溶液的吸光度值，绘制万古霉素吸光度-浓度标准曲线。
载药涂层体外缓释检测：分别将载药羟基磷灰石涂层、载药二氧化钛纳米管涂层和载药复合涂层置于6孔板中，每孔加入5 mL的模拟体液，室温下分别于1，2，3，4，5，6，12，24 h取出部分溶液，测定溶液的吸光光度，之后每天在相同时间测定溶液吸光度，根据万古霉素的标准曲线确定溶液的药物浓度，绘制体外药物释药量及药物释放百分比随时间变化的曲线。
1.4.7 载药涂层的体外细胞毒性检测
载药涂层浸提液的制备：将载药复合涂层置于6孔板中，以含体积分数10%胎牛血清的F12/DMEM细胞培养液作为浸提液介质，在无菌密闭环境中按照浸提液体积与材料表面积比为3 cm2/1 mL的比例加入浸提介质[24]，37 ℃浸泡24 h进行萃取得到材料浸提原液。然后用含血清的F12/DMEM培养液进行稀释得到100%，50%，10%浓度的浸提液，放入 4 ℃冰箱备用。
细胞的准备：将人成骨细胞培养在含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的F12/DMEM培养液中，置于37 ℃体积分数5%CO2培养箱中进行培养。当细胞融合至80%-90%用胰酶消化，按1∶3比例进行传代，选择生长状态良好的细胞待用。
MTT法检测细胞毒性：将生长状态良好的贴壁人成骨细胞用胰蛋白酶消化，细胞浓度稀释成为5×107 L-1，加入96孔板，每孔加入100 µL，每个浓度组重复3次，每次3复孔，置于37 ℃细胞培养箱培养过夜。次日弃去原培养液，分别加入各浓度的载药涂层浸提液100 µL进行培养，阴性对照组加入100 µL含血清的F12/DMEM细胞培养液，阳性对照组加入100 µL含1.5 g/L盐酸万古霉素的F12/DMEM培养液，在 37 ℃体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。培养1，3，5 d时，在倒置显微镜下观测细胞生长状态。培养1，3，5 d时(培养3，5 d，实验组每24 h更换培养介质)，每孔吸弃原液后加入100 µL MTT，避光共培养4 h后加入三联液[25]，过夜溶解结晶，次日以酶标仪在波长570 nm处测定并记录其吸光度值。并按以下计算各组细胞相对活力[细胞相对活力(%)=100%×A570e/A570b，A570e为测定样品100%浸提液在570 nm波长下吸光度平均值，A570b为570 nm波长下阴性对照组吸光度平均值]，当细胞相对活力低于70%时认为存在潜在细胞毒性[26]。
细胞形态学检测：将经过灭菌后的二氧化钛纳米管涂层、羟基磷灰石涂层、载药复合涂层置于6孔板中，加入3 mL人成骨细胞悬液并完全淹没金属材料表面，留置一个空白细胞孔。37 ℃细胞培养箱中培养24 h后，吸弃原培养液，加入4%的组织细胞固定液固定成骨细胞，PBS洗涤，加入罗丹明-鬼笔环肽工作液，室温下避光孵育30 min对细胞骨架进行染色，再以DAPI对细胞核复染30 s，PBS冲洗，倒置荧光显微镜下观察涂层表面细胞的形态及生长黏附情况。
1.5 主要观察指标载药复合涂层体外的药物释放效能及细胞毒性。
1.6 统计学分析实验一式3份，每个实验分组重复3次。各组实验数据以x±s表示，以 SPSS 25软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，以SNK事后检验确定显著性水平，在所有统计分析中，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

感染是引起假体植入失败的一个重要原因，长期大剂量应用抗生素存在潜在的组织毒副作用，而二次手术在对患者造成损伤的同时又会给患者带来沉重的经济负担，相比而言，构建具有局部缓释功能的载药涂层，使药物在局部保持足够的浓度，无疑是一个有效预防感染的策略，一项基于临床数据的分析证明了局部释药抗菌涂层的优势[27]。
二氧化钛纳米管是钛金属表面改性的一种常见方式，其具备独特的管状亚微米结构，表现出良好的骨整合能力[28-29]，此外二氧化钛纳米管通过表面电荷排斥、表层拉力、疏水效能等作用也有一定的抗菌效能[30-31]。从形态学上来讲，纳米管是一种管状自组织纳米结构，具有良好的传输性能和较高的比表面积，其结构的容纳属性能够为药物装载提供潜在的作用[8，32]。羟基磷灰石是人体骨骼无机成分的主要组成部分，具有优异的生物相容性。植入的羟基磷灰石涂层可以通过表面固溶离子交换方式在局部形成富钙磷微环境，促进植入物的骨骼整合[33]。整合两种材料的优势，构建纳米管羟基磷灰石复合涂层，以其作为药物承载平台组建局部药物缓释系统无疑具备广阔的应用前景。
目前临床上多采用等离子喷涂法在植入假体表面制备羟基磷灰石涂层，但等离子喷涂是一种非线性工艺，涂层受到植入假体形状的限制，制备涂层过程中往往会产生高温，对复合涂层的制备有一定局限性；而纳米管在过高温下可能会发生塌陷，因而以更加温和的方式整合纳米管羟基磷灰石显得尤为重要。电沉积以其工艺简单、能够快速制备复合涂层且不受基材形貌限制的优势在构建复合涂层领域得到了广泛的应用[34-35]。有研究通过电泳联合阳极氧化原位合成了纳米管羟基磷灰石复合涂层[36-37]；也有研究通过电泳沉积在二氧化钛表面构建壳聚糖-羟基磷灰石复合涂层；IONITA等[38]则通过电化学方式共沉积抗生素和羟基磷灰石的方式构建了复合涂层，而且有研究进一步证实了以电泳沉积制备二氧化钛表面羟基磷灰石，在不负载抗生素情况下涂层也有一定的抑制细菌黏附效果[39-40]。该实验采用电泳化学沉积方式来构建二氧化钛纳米管/羟基磷灰石复合涂层，这种涂层构建方法不会对两种材料本身产生影响，且制备过程比较温和，能够满足实验需求。在研究中如何整合两种材料及抗生素来得到具有药物缓释、无细胞毒性的复合涂层，是研究的关键之处，预期的目标是构建出具备药物缓释和无细胞毒性的载药复合涂层。国内外研究学者采用多种方式来达到这一目的。张杭州等[22]通过仿生沉积法在二氧化钛纳米管表面构建羟基磷灰石涂层，然后滴加装载万古霉素，虽然存在药物早期的爆发性释放，但随后的缓释研究结果表明，复合涂层达到了预期的药物缓释效果，其药物释放时间明显长于单纯的二氧化钛纳米管。SADRNEZHAAD等[41]以电化学法构建了纳米管/羟基磷灰石复合涂层，将其浸泡在乙酰氨基酚溶液中，并和单纯纳米管及钛进行了释药性的对比，结果也证实了羟基磷灰石可以充当屏障作用延缓药物的爆发性释放。此外，ZHANG等[42]通过电化学法在纳米管表面负载羟基磷灰石并装载链霉素，并对其释药情况进行了研究，结果同样表明复合涂层比裸钛装载药物有更好的缓释效能。结合相关研究，构建涂层的方式及药物装载方案都会对药物释放效果产生一定的影响。但因为二氧化钛纳米管及羟基磷灰石均为无机材料，而抗生素多为有机小分子，在制备涂层过程中将药物整合进涂层中往往会受到诸多限制，而且在不引入其他有机溶剂的情况下，将抗生素引入羟基磷灰石涂层的药物缓释效能并不显著，此外也不能确定在涂层制备过程中溶液理化性质的变化会不会对抗生素产生影响，而且很难对药物定量分析。而采取物理吸附方式进行药物负载也存在一定的问题，虽然这种方法能够确保药物的有效装载且能够准确确定药物装载量，但是装载过程中药物很难完全渗入涂层内部，部分药物会黏附在涂层表面，这部分药物会在早期迅速释放，而在涂层内部的药物则会通过渗透压及药物浓度梯度进行缓慢释放。由于考虑到需要进行定量分析药物的缓释效能，也是为了避免药物的变性，实验首先构建了复合涂层，通过物理吸附方式进行药物的装载，药物释放结果同样证实了以上结论：早期存在一定程度的药物爆发性释放，但随后药物达到了缓释。此外，对于需植入体内的体系，载药涂层不仅要对细菌具备杀灭作用，还要确保其对正常细胞无毒副作用。有研究表明持续暴露于浓度≥1 mg/cm2的盐酸万古霉素时，成骨细胞和成肌细胞表现出显著的细胞毒性，而短时间和低剂量的暴露不会显著降低细胞迁移和细胞存活[43]。实验通过载药涂层浸提液与成骨细胞共培养，以及细胞在材料表面的黏附生长状况来评价该载药涂层的毒副作用，结果证实了该载药涂层无明显细胞毒作用，但是100%浸提液组细胞相对活力趋近于70%，这样的结果表明，参照国际标准载药复合涂层无明显细胞毒作用，但是仍存在一定的细胞抑制作用，这种结果可能是由于高浓度盐酸万古霉素所引起。
综上，实验通过电泳化学沉积的方式成功构建了以二氧化钛纳米管为基底的纳米羟基磷灰石复合涂层，以滴加的方式成功将盐酸万古霉素装载在复合涂层表面，得到的载药复合涂层具有良好的体外药物缓释性能，与成骨细胞共培养后证实复合涂层无明显细胞毒作用。以金属为基底构建局部药物释放体系是目前一个重要的研究方向，但载药涂层体外的药物缓释情况并不能完全代表其在体内的药物释放情况，植入体内后涂层会受到各种细胞蛋白作用[44]，体内的药物代谢也会对药物的局部效能产生影响。实验仅对体外载药复合涂层的药物缓释效能进行了检测，而未进行体内研究，此外复合涂层的稳定性也是一个不可忽视的问题，确保植入涂层稳定不脱落，并在体内也能够达到局部药缓释，将值得进一步研究和探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性

Drug-release characteristic and biological toxicity of TiO₂ nanotube/hydroxyapatite loaded vancomycin coating

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