1.4.4  RT-PCR检测白细胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)、雌激素受体相关受体α(Estrogen receptor related receptor alpha，ERRα)、SRY相关蛋白9(SRY-related high mobility group-box gene 9，SOX9)及Ⅱ型胶原的α1链(type II collagen α1，Col2α1) mRNA表达  取软骨组织约50 mg置于匀浆仪，加入1 mL Trizol Reagent进行匀浆；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清至无RNA酶的离心管中；加入250 μL三氯甲烷，混匀后静置3 min，4 ℃，      13 000 r/min，离心8 min；转移上清至新离心管，加入异丙醇，混匀后-20 ℃放置15 min，4 ℃，13 000 r/min，离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA；吸除液体后加入体积分数75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀，4 ℃，13 000 r/min，离心5 min；吸干离心管内液体，置于超净台风干3 min，加入20 μL无RNA酶水溶解RNA，进行反转录反应，设计引物见表1，进行RT-PCR 扩增。2^-??Ct法计算IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA的相对表达量。

2.3  大鼠膝关节软骨IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA表达比较  与空白对照组比较，模型组IL-1β mRNA表达量明显升高，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA表达量明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，实验组IL-1β mRNA表达量明显降低(P < 0.05)，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA表达量明显升高(P < 0.05)；与阳性对照组比较，实验组IL-1β，ERRα及Col2α1 mRNA表达量明显升高(P < 0.05)，SOX9 mRNA表达量明显降低(P < 0.05)，见表2。

2.4  大鼠膝关节软骨IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1蛋白表达比较  与空白对照组比较，模型组IL-1β蛋白表达量明显升高，ERRα，SOX9及Col2α1蛋白表达量明显降低，差异具有显著性意义(P < 0.05)；与模型组比较，实验组IL-1β蛋白表达量明显降低，ERRα，SOX9及Col2α1蛋白表达量明显升高(P < 0.05)；与阳性对照组比较，实验组IL-1β，ERRα及Col2α1蛋白表达量明显升高，SOX9蛋白表达量明显降低(P < 0.05)，见图1A-D。

膝骨关节炎是最常见的退行性关节疾病，其发病率和致残率高，已经严重影响患者的生活质量^[1]。膝骨关节炎多发生于绝经后妇女，体内雌激素降低，软骨代谢活跃，严重膝骨关节炎的发病率呈指数性增长^[2]。研究发现，补肾中药能够上调膝关节软骨中雌激素受体的水平，达到对关节软骨的保护作用^[3]。然而，补肾健脾活血中药治疗妇女绝经后膝关节软骨退变的机制目前尚不清楚。

因此，实验构建雌激素低下型膝骨关节炎大鼠模型，并采用补肾健脾活血中药治疗，比较模型大鼠软骨组织中软骨细胞IL-1β/ERRα/SOX9/Col2α1信号通路变化，从而探索补肾健脾活血中药治疗雌激素低下型膝骨关节炎的分子机制，为补肾健脾活血中药在膝骨关节炎中的临床应用提供新的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年10月至2019年10月在广州中医药大学动物实验中心和广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  动物实验  健康6月龄雌性SD大鼠48只，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证：SYXK(粤) 2013-0001，体质量400-500 g，所有动物在(25±1) ℃恒温、恒湿70%的清洁环境下统一饲养，每天12 h光明/黑暗，任意进食标准饲料和蒸馏水。

1.3.2  补肾健脾活血中药  由广州中医药大学附属骨伤科医院提供，由以下生药组成：补骨脂15 g、骨碎补15 g、牛膝15 g、黄芪30 g、白芍30 g、白术15 g、桃仁10 g、红花5 g和三七10 g、茯苓15 g、麻黄10 g、防风10 g、细辛5 g、甘草10 g，灌胃前采用蒸馏水浓缩至1.9 g/mL。塞来昔布胶囊(辉瑞制药有限公司，国药准字J20040072)。

1.4  实验方法

1.4.1  分组与造模  将48只SD雌性大鼠采用随机数字表法随机分为空白对照组、模型组、实验组和阳性对照组，每组12只。模型组、实验组和阳性对照组摘除卵巢建立去势膝关节炎模型，造模后2周，摘除交叉韧带及内侧半月板制作膝骨关节炎模型^[4]。

1.4.2  药物干预方法  大鼠-人等效给药剂量换算参照《实验动物学》^[5]，实验组以19 g/(kg•d)的剂量给予补肾健脾活血药液灌胃，阳性对照组以20.6 g/(kg•d)的剂量给予塞来昔布胶囊溶液灌胃，空白对照组及模型组给予等量体积生理盐水灌胃。连续灌药6周麻醉处死大鼠，抽取血清离心后置于-20 ℃保存，切取膝关节胫骨平台及股骨髁全部软骨组织，标本冻存于-80 ℃冰箱。

1.4.3  ELISA检测血清雌二醇(E2)水平  将血清置于离心机中3 000 r/min离心10 min，取上清液；设置标准品孔和待测样本孔，分别加标准品或待测样本100 μL，37 ℃温育2 h后弃去液体；每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃温育1 h后洗板3次，每孔加200 μL洗涤工作液，浸泡2 min后弃去液体；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37 ℃温育1 h后洗板5次；每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色30min后加终止液50 μL终止反应；反应终止后在紫外线450 nm波长的酶标仪上测量各孔吸光度值。

1.4.4  RT-PCR检测白细胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)、雌激素受体相关受体α(Estrogen receptor related receptor alpha，ERRα)、SRY相关蛋白9(SRY-related high mobility group-box gene 9，SOX9)及Ⅱ型胶原的α1链(type II collagen α1，Col2α1) mRNA表达  取软骨组织约50 mg置于匀浆仪，加入1 mL Trizol Reagent进行匀浆；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清至无RNA酶的离心管中；加入250 μL三氯甲烷，混匀后静置3 min，4 ℃，      13 000 r/min，离心8 min；转移上清至新离心管，加入异丙醇，混匀后-20 ℃放置15 min，4 ℃，13 000 r/min，离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA；吸除液体后加入体积分数75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀，4 ℃，13 000 r/min，离心5 min；吸干离心管内液体，置于超净台风干3 min，加入20 μL无RNA酶水溶解RNA，进行反转录反应，设计引物见表1，进行RT-PCR 扩增。2^-∆∆Ct法计算IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA的相对表达量。

1.4.5  Western blot检测IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1蛋白表达  用RIPA裂解液对研磨后的软骨组织进行充分匀浆后，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性制成上样液后，每组30 μL在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离约

1.5 h。采用湿转法将蛋白电转移到VDF膜上，用50 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗IL-1β(1∶1 000，ab9722，abcam，America)、ERRα(1∶5 000，ab76228，abcam，America)、SOX9(1∶1 000，ab185230，abcam，America)、Col2α1(1∶1 000，ab34712，abcam，America)，４℃冰箱孵育过夜后，使用TBST缓冲液洗膜3次，每次约10 min。洗膜后加入二抗Hrp-Goat Anti-Rabbit IgG(1∶10 000，111-035-003，Jackson，America)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST漂洗3次，每次约10 min。使用ECL工作液在X射线片上显影、定影，以β-actin(1∶1 000，3 700 S，CST，USA)为内参，采用Image J软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.5  主要观察指标  ①血清雌二醇水平；②大鼠膝关节软骨组织中IL-1β，ERRα，SOX9及Col2α1 mRNA和蛋白表达。

1.6  统计学分析  数据的统计与处理采用SPSS 18.0软件，对所得结果进行正态性及方差齐性检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析检验，有显著性差异时采用 Turkey检验，数据结果以x(_)±s表示，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异具有显著性意义。

膝骨关节炎是一种以膝关节软骨退变、破坏和骨质增生为主要特征的慢性关节病^[6]。绝经后妇女雌激素水平低下，膝骨关节炎发生率增高，说明雌激素与膝骨关节炎关系密切。雌激素主要由卵巢分泌，分泌的雌激素进入血液循环发挥生物学效应，妇女绝经后卵巢功能衰退，雌激素分泌减少从而诱发膝骨关节炎^[7]。血清雌二醇是体内雌激素活性代表物，具有雌激素类最强的生物活性，能与组织内特异性受体蛋白在雌激素反应组织中结合形成具有生物活性的复合体，从而发挥作用^[8]。实验将大鼠卵巢摘除以模拟绝经后妇女雌激素缺乏状态，大鼠去势2周后建立膝骨关节炎模型，6周后血清雌二醇含量降低，补肾健脾活血中药干预后血清雌二醇含量升高，改变了去势大鼠体内雌激素缺乏状态，进而保护膝关节软骨退变。

实验采用补肾健脾活血中药以骨碎补、补骨脂、黄芪为君药，白术、白芍、茯苓为臣药，桃仁、红花、三七、麻黄、防风、细辛为佐药，牛膝、甘草为使药。诸药合用体现因病选药、以证配伍，其中，骨碎补、补骨脂补脾肾、强筋骨；桃仁、红花、三七活血化瘀、消肿止痛，黄芪、白术补气健脾，白芍柔肝止痛，牛膝补肝肾、强筋骨、引血下行，麻黄、防风、细辛发汗解表，驱邪外出，甘草调和药性。诸药合用，具有补肾健脾、活血、驱邪外出之功效。前期研究发现，该处方能够降低绝经后膝骨关节炎妇女WOMAC及目测类比评分，提高JOA及Lysholm评分，临床疗效显著^[4]。马浩哲等^[9]研究补肾活血方对肾虚血瘀证膝骨关节炎患者的疗效及其对血清细胞因子的影响，结果发现补肾活血方治疗肾虚血瘀证膝骨关节炎患者疗效显著，可改善患者临床症状及体征，降低炎性反应因子水平，与我们前期临床研究相一致。实验进而观察补肾健脾活血中药对去势大鼠膝骨关节炎关节软骨细胞IL-1β/ERRα/ SOX9/Col2α1信号通路变化的影响，以探讨补肾健脾活血中药治疗膝骨关节炎的分子生物学机制。

实验结果发现，去势膝骨关节炎大鼠关节软骨中IL-1β/ERRα/ SOX9/ Col2α1信号通路表达异常，主要表现为IL-1β表达量升高，ERRα，SOX9及Col2α1表达量降低。研究发现，在关节炎软骨细胞中，IL-1β能够上调ERRα表达，SOX9是ERRα靶基因，ERRα敲除后Col2α1表达受到抑制，表明膝骨关节炎中存在IL-1β/ERRα/SOX9/Col2α1信号通路异常^[10-11]。ERRα具有维持软骨内稳态的特性，在炎症性小鼠动物模型关节和软骨下骨中表达降低，在增殖的软骨细胞中高表达^[12]。IL-1β为促炎性细胞因子，扰乱软骨代谢平衡^[13]，抑制软骨细胞增殖^[14]，诱导软骨细胞凋   亡^[15]，促进软骨基质降解^[16]，促进滑膜炎症发展^[17]，加速骨关节炎进程^[18]。SOX9是软骨细胞产生软骨基质所必须的转录因子，可以调节软骨细胞外基质基因的表达^[19]。Col2α1基因突变可导致软骨形成不足、骨性关节炎、先天性脊柱骨骺发育不良等疾病^[20-21]。实验采用补肾健脾活血中药干预膝骨关节炎模型大鼠后膝关节软骨细胞IL-1β表达量降低，ERRα，SOX9及Col2α1表达量升高，说明补肾健脾活血中药能够通过IL-1β/ERRα/SOX9/Col2α1信号通路发挥防治膝骨关节炎的作用。

以上研究表明，补肾健脾活血中药治疗雌激素低下型膝骨关节炎疗效显著，其可能的作用机制是通过调节IL-1β/ERRα/SOX9/Col2α1信号通路发挥治疗作用，这一研究成果将为补肾健脾活血中药在膝骨关节炎中的临床应用提供新的理论依据。然而，实验也有不足之处，如未对大鼠疼痛行为检测及病理组织形态观察，以及未体外验证补肾健脾活血中药对软骨细胞的影响，这些不足尚需要进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

膝骨关节炎：是一种以膝关节软骨退变、破坏和骨质增生为主要特征的慢性关节病，多患于中老年人群，主要表现为膝关节疼痛，上下楼梯时疼痛加重，休息后缓解，局部肿胀，活动受限，晚期膝关节畸形，严重影响患者的生活质量。

雌激素：主要由卵巢分泌，分泌的雌激素进入血液循环发挥生物学效应，妇女绝经后卵巢功能衰退，雌激素分泌减少从而诱发膝骨关节炎。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

实验采用摘除卵巢后切断交叉韧带及摘除内侧半月板建立去势大鼠膝骨关节炎模型，利用ELISA检测血清E2含量，RT-PCR和Western Blot检测IL-1β、ERRα、SOX9、Col2α1 mRNA和蛋白表达。结果显示IL-1β/ERRα/SOX9/Col2α1信号通路参与膝骨关节炎软骨病变，补肾健脾活血中药可通过该机制发挥治疗作用。以上研究为补肾健脾活血中药在膝骨关节炎中的临床应用提供新的理论依据。

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