2.1  不同兔龄软骨细胞的线粒体染色结果  不同兔龄软骨细胞的线粒体染色结果见图1。出生1 d的兔软骨细胞中线粒体呈点状分布，胞膜胞核完整，核膜清晰，细胞骨架的微丝结构比较明显。出生1个月的兔软骨细胞骨架的微丝贯穿整个细胞，胞核胞膜也完整，但线粒体数目较刚出生的少。出生18个月的兔软骨细胞胞膜断断续续，界限不清，细胞骨架的微丝失去正常结构，细胞核变形严重，胞内线粒体数目在3组中最少。

由图2实验结果得出，幼年关节软骨细胞的线粒体数目最多，随着兔龄的增长，软骨细胞线粒体数目减少，软骨细胞中线粒体数量与细胞发育衰老有关。

2.2  幼兔骨髓间充质干细胞和幼兔软骨细胞的线粒体染色结果  幼兔骨髓间充质干细胞和幼兔软骨细胞的线粒体染色结果见图3。从图中可以看出，软骨细胞线粒体网络结构被分裂，大部分呈碎片状，成堆聚集，形成自噬小体，细胞形态呈圆形或椭圆形，骨架边界模糊。骨髓间充质干细胞形态呈梭形，细胞骨架边界清晰，线粒体网络结构显著。软骨细胞中线粒体的形态与骨髓间充质干细胞的线粒体形态存在明显差异。

2.3  骨髓间充质干细胞分化过程中的线粒体染色结果  在观察正常骨髓间充质干细胞和软骨细胞线粒体形态的基础上，探究骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中线粒体形态变化。骨髓间充质干细胞分化过程中的线粒体染色结果见图4。第1天时，与对照组线粒体形态相比，实验组线粒体网络结构开始破坏，线粒体开始分裂，但大部分线粒体仍通过管状连接；第3天时，对照组线粒体仍保持基础状态的网络管状结构，而实验组线粒体网络结构大面积破坏；第7天时，对照组线粒体仍处于基础状态，而实验组线粒体状态发生显著变化。线粒体网状结构明显破坏，碎片化程度加深，点状线粒体增多，受损的线粒体已被包裹形成自噬小体，并进一步降解其所包裹的内容物，完成受损线粒体的清除。骨架的微丝结构也较诱导前期减少。细胞肌动蛋白丝是自噬发生发展的动力基础^[13]，促进自噬体与溶酶体融合，完成自噬过程。因此，对照组、实验组的线粒体标记染色结果说明线粒体自噬存在于骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中。

2.4  线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响  前期线粒体染色结果表明线粒体自噬发生在骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中，但线粒体自噬的变化是否直接影响到骨髓间充质干细胞的成软骨分化尚不清楚。故该实验通过加入自噬抑制剂氯喹和自噬诱导剂雷帕霉素，考察抑制或增强线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响，结果见图5，从图中可以看出，随诱导天数的增加，自噬诱导组的自噬溶酶体数量显著增加，骨髓间充质干细胞形态发生明显变化，由最初的长梭形变为圆形或椭圆形；正常组在培养过程中仅有部分自噬溶酶体出现，骨髓间充质干细胞形态变化不明显；应用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合后，随培养天数的增加，自噬溶酶体较雷帕霉素组少，骨髓间充质干细胞形态一直保持长梭形，未向软骨方向分化。该结果初步说明雷帕霉素促进了线粒体自噬，进而影响骨髓间充质干细胞向软骨分化的过程。

随着社会老龄化和经济快速发展，退行性骨关节炎、创伤等原因导致的软骨缺损呈现日益增长的趋势。由于软骨是一种特殊的结缔组织，没有血管，损伤部位的软骨细胞很难进入增殖期而达到修复软骨的目的。因此，与软骨缺损修复相关的材料和方法受到广泛研究和关注，研发诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的生物材料也是其中重要内容。课题组前期研究表明，Ⅰ型胶原水凝胶可以为细胞提供一个类似于透明软骨的三维环境^[1]，并在体外无外源性生长因子的情况下诱导骨髓间充质干细胞产生类软骨组织^[2]，成为临床上治疗关节软骨缺损的关键方法。研究还发现，胶原的材料学因素参与调控成软骨分化，例如材料的结构、浓度、黏弹性、降解性能、力学性能以及材料表面官能团都会与细胞相互作用，共同调控骨髓间充质干细胞分化过程，但材料因素如何引起不同的生物学响应并进而影响成软骨分化的分子机制以及亚细胞水平变化对诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞的作用尚不明确，还有待进一步研究。

有文献指出Ⅰ型胶原水凝胶为细胞提供了低氧微环 境^[3]，低氧条件更有利于骨髓间充质干细胞成软骨分化^[4]，同时低氧环境会影响细胞的生理变化^[5]。线粒体作为细胞有氧呼吸供能的主要场所，在缺氧时极易受损，受损的线粒体被双层膜结构包裹形成自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解包裹的内容物，从而完成损伤线粒体的降解，维持细胞内环境稳定，这一过程称为线粒体自噬^[6]。

近年研究表明，干细胞行为(自我更新、增殖、分化)可以通过调节线粒体分裂、融合、自噬而改变^[7-8]。2018年有研究者报道线粒体自噬促进了成骨钙化^[6]。同年，研究者指出自噬底物p62缺失，可通过增强线粒体自噬进而促进人脂肪来源干细胞向成脂方向分化^[9]。2019年，研究者报道软骨细胞自噬增强可以通过影响细胞内代谢活性，即通过调节营养物质的代谢，延缓细胞衰老和死亡，从而延缓骨关节炎^[10]。同时，线粒体自噬也参与软骨细胞外基质的降解，在脂肪干细胞成软骨分化的早期阶段，通过线粒体网络结构(融合、分裂)的变化刺激脂肪干细胞向成软骨方向分化^[11]。调节胞内线粒体含量，可能是自噬调控干细胞早期定向分化的一种方式。但目前很少有研究关注线粒体自噬与骨髓间充质干细胞成软骨分化的关联，揭示细胞内线粒体自噬的过程对于了解骨髓间充质干细胞成软骨分化的机制具有重要意义。因此，该研究进行骨髓间充质干细胞、不同兔龄软骨细胞以及骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中的线粒体定位染色，确定线粒体自噬与成软骨分化之间存在的关联；进一步通过外加自噬抑制剂氯喹和自噬诱导剂雷帕霉素影响线粒体自噬的进程，探讨线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3月至2019年12月在四川大学生物材料工程技术研究中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  新生乳兔1只(250 g)、1月龄兔1只    (2 kg)、18月龄兔1只(2.5 kg)，雌雄不限，由邳州东方养殖有限公司提供，均为新西兰兔，动物许可证号为SCXK(苏) 2017-0002。

1.3.2  实验试剂  Mito Tracker Red试剂盒、Alexa Fluor 488-鬼笔环肽、DAPI染液(赛默飞)；多聚甲醛、Triton X-100(科隆，中国)，Ⅱ型胶原酶(美仑，中国)；PBS (北京博奥森生物科技，中国)；α-MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗、维生素C、ITS、非必需氨基酸、L-脯氨酸、地塞米松、转化生长因子β(Hyclone，美国)；氯喹、雷帕霉素(上海吉凯基因，中国)；线粒体自噬染色试剂盒(同仁化学，中国)。

1.4  实验方法

1.4.1  不同兔龄段软骨细胞的分离与培养  新生乳兔采取溺亡处理，1月龄及18月龄兔采取空气注射法处理。无菌条件分离得到兔膝关节，用无菌剪刀剪下透明软骨，浸泡在含10%双抗的PBS中备用；弃去PBS，向培养皿中加入0.02%Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化6 h，每隔2 h用无菌剪刀调整软骨组织的大小。在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，用200目滤网过滤消化液，收集滤液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入α-MEM培养基(内含体积分数为10%的胎牛血清、1%双抗和2‰维生素C)进行原代培养；大约5 d后，细胞可铺满皿80%-90%，随后进行传代培养，弃去培养基，每皿用无菌PBS清洗后加入1 mL不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞变圆后，吸掉胰蛋白酶，加入3 mL含胎牛血清的α-MEM培养基中和胰蛋白酶，停止消化，用5 mL移液枪反复吹打培养皿底部的细胞，使其脱落形成细胞悬液，按照1∶3的原则，分散在3个培养皿中培养。第2代软骨细胞用于细胞实验。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的分离与培养  骨髓间充质干细胞的分离按照文献所述方法进行^[12]，具体流程如下：新生乳兔浸没于0.2%的新洁尔溶液中，使其溺亡，然后将兔转移至体积分数为75%乙醇中浸泡3-5 min，使兔表皮充分杀菌。将兔转移至超净台，无菌条件下剪开四肢皮肤，再用新的镊子和剪刀在兔肩关节和髋关节处剪下四肢，浸没于含10%双抗的PBS中备用。剥离四肢肌肉，用无菌剪刀剪去骨干两端的骨骺，用含DMEM培养基的注射器冲洗骨髓腔至透明。将含有细胞悬浮液的培养基充分混匀，均匀分散至单个培养皿中，放入培养箱中培养(37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度)，24 h后弃去培养基表面的杂细胞，换为含体积分数为20%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基进行原代培养，大约5 d后，细胞可铺满皿80%-90%，随后进行传代。第2代骨髓间充质干细胞用于细胞实验。传代方法如1.4.1所述，但需用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化。

1.4.3  骨髓间充质干细胞和软骨细胞线粒体染色  收集骨髓间充质干细胞以及新生乳兔、1月龄兔、18月龄兔的软骨细胞，按照试剂盒说明方法进行线粒体标记Mito Tracker Red染色。吸掉激光共聚焦专用培养皿中的培养基，用无菌PBS清洗培养皿，加入Mito Tracker Red(1∶500)染液，置于培养箱中孵育2 h，用40 g/L多聚甲醛固定    10 min，用0.1% Triton X-100透膜10 min，加入Alexa Fluor 488-鬼笔环肽(1∶500)在37 ℃孵育2 h，PBS清洗2次，然后加入DAPI(1∶1 000)染液孵育2 min，PBS清洗(2×     5 min)，置于激光共聚焦显微镜下观察线粒体变化。荧光图片用Image J软件进行线粒体数目量化。

1.4.4  骨髓间充质干细胞分化过程中线粒体染色  取第2代骨髓间充质干细胞，以5×10⁷ L^-1接种至激光共聚焦专用培养皿中。对照组采用基础培养基培养(含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基)；实验组用完全软骨诱导培养基培养(完全诱导培养基含基础培养基、1% ITS、1%非必需氨基酸、2‰ L-脯氨酸、2‰地塞米松、2‰维生素C、10 μg/L转化生长因子β)，每2 d换液1次。实验组和对照组分别在培养第1，3，7天按照试剂盒说明方法进行线粒体标记Mito Tracker Red染色。染色方法同1.4.3所述。

1.4.5  线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响  取第2代骨髓间充质干细胞，以5×10⁷ L^-1接种至激光共聚焦专用培养皿中，分为3组：正常组、诱导组、抑制组，正常组用基础培养基培养，诱导组和抑制组用完全软骨诱导培养基培养24 h后，诱导组加入浓度为10 μmol/L自噬诱导剂雷帕霉素干预10 h，抑制组加入浓度为5 μmol/L自噬抑制剂氯喹干预10 h，此后诱导组和抑制组换用完全软骨培养基培养，每2 d换液1次。正常组、诱导组和抑制组分别在培养第1，3，7天用线粒体自噬试剂盒Mitophagy Detection Kit染色并观察线粒体自噬。根据线粒体自噬试剂盒的说明，吸掉激光共聚焦专用培养皿的培养基，用无菌PBS清洗培养皿，先加入Mtphagy Dye工作液(1∶250)孵育过夜，再加入含线粒体自噬诱导剂或抑制剂的完全软骨培养基(不含血清)，置于培养箱中孵育过夜，最后加入Lyso Dye工作液(1∶250)孵育1 h，PBS清洗1次，置于激光共聚焦显微镜下观察线粒体自噬情况。Mtphagy Dye用于检测线粒体自噬，Lyso Dye是溶酶体染料。正常情况下，线粒体自噬染料Mtphagy Dye结合于线粒体上，并发出微弱的红色荧光。Lyso Dye染料用于标记溶酶体，使溶酶体激发出绿色荧光。当用自噬诱导剂雷帕霉素诱导线粒体发生自噬后，线粒体自噬Mtphagy Dye染料产生较强的荧光，与溶酶体染料共定位形成黄色的自噬溶酶体。

1.5  主要观察指标  ①不同兔龄段软骨细胞线粒体染色结果；②幼兔骨髓间充质干细胞和幼兔软骨细胞线粒体染色结果；③骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中线粒体染色结果。

1.6  统计学分析  实验数据用x(_)±s表示，采用Origin 8.5软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

实验发现低兔龄软骨细胞中线粒体数目较高兔龄软骨细胞多；并且低兔龄软骨细胞的线粒体形态呈点状，而骨髓间充质干细胞的线粒体形态呈线状。软骨细胞发育过程中增殖、迁移、功能表达较为旺盛的幼兔软骨细胞与高龄兔软骨细胞之间存在线粒体自噬的差异，并且线粒体形态在软骨细胞和骨髓间充质干细胞中存在明显差异。在体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中，随诱导培养天数的增加，线粒体的形态由最初的网状变为点状，细胞骨架中促进自噬形成的微丝结构也逐渐减少；这些结果提示骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中，线粒体形态的变化过程与软骨细胞发育过程中线粒体自噬程度相似，线粒体自噬可能参与了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。基于此，该研究进一步设计并观察线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化的作用。结果显示，随着自噬药物的加入，自噬诱导剂雷帕霉素组自噬溶酶体数量增多，与文献结果一致^[14]，骨髓间充质干细胞形态发生变化，自噬抑制剂氯喹组阻断了线粒体自噬小体与溶酶体的结合，使自噬溶酶体数量减少，骨髓间充质干细胞一直保持长梭形。以上结果提示线粒体自噬可能促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。

软骨细胞在正常生理环境下处于低氧状态^[15]，通过线粒体呼吸链清除过多的活性氧，维持软骨细胞的正常生命活动。细胞自我更新过程中，线粒体作为细胞的能量加工厂，是真核生物进行氧化代谢的重要细胞器。研究发现，随着年龄的增长，一方面老年软骨细胞较生长发育期的软骨细胞骨密度下降，自身活性越低，对外界环境的抵抗力越弱，这也正是老年人容易发生关节病变的原因^[16-17]；另一方面，软骨细胞的超微结构发生了变化，软骨细胞的功能也逐渐衰退，胞内内容物发生明显变化，细胞器越来越少^[18]，细胞会发生多种应激反应，使线粒体DNA突变，影响线粒体的质量，进而导致细胞损伤或衰老。自噬作为细胞消化体内损伤物质的一种途径，能够选择性去除突变的线粒体DNA，逆转细胞衰老，使细胞再生^[19]。此外，线粒体通过分裂和融合来调节细胞的大小、数量、形态和分布，并且调控制线粒体自噬的降解，以维持机体稳态^[20]。该研究发现，随着兔龄的增长，软骨细胞中线粒体数目逐渐减少，为自噬提供动力的细胞骨架的微丝结构也逐渐减少，说明线粒体形态结构、数量的变化与软骨细胞衰老密切相关，自噬的丧失促进了软骨细胞的衰老，促使老年关节软骨的衰退。同时，也表明线粒体自噬染色方法对于考察评价软骨细胞中线粒体状态和自噬程度的有效性。

最近研究报道，骨髓间充质干细胞的发育分化过程与线粒体的融合分裂密切相关，微环境可影响骨髓间充质干细胞自噬水平^[21]，其中缺氧环境可提高骨髓间充质干细胞的自噬水平，避免发生凋亡^[22]。缺氧微环境下，线粒体结构发生改变，其中BH3蛋白家族中BNIP3L对线粒体自噬有重要意义^[23]，BNIP3L使线粒体发生去极化，调控损伤线粒体的清除^[24]，以保持干细胞的活力，延缓干细胞衰老^[25]。线粒体自噬的评价标准与线粒体形态的融合分裂有关，线粒体分裂促进了点状线粒体的形成，并与线粒体自噬呈正相关^[20]。相关研究证实了线粒体自噬受到线粒体分裂的影响，线粒体分裂促进了点状线粒体的形成，受损的线粒体通过线粒体自噬途径维持机体稳态^[26-28]。在干细胞诱导成软骨分化过程中，利用自噬诱导剂雷帕霉素提高线粒体自噬，使线粒体形态发生变化，并且研究报道线粒体分裂与线粒体自噬成正比^[19]，雷帕霉素促进了线粒体自噬途径，进而促进干细胞的成软骨分化。

此次实验所用的氯喹是一种抑制自噬后期阶段的药 物^[29-31]，主要在自噬体与溶酶体融合阶段发挥作用，通过阻断自噬体和溶酶体的融合抑制自噬通量，使细胞自噬一直停留在自噬溶酶体阶段，达到抑制线粒体自噬的目的，进而抑制骨髓间充质干细胞的成软骨分化。雷帕霉素是抑制自噬信号通路mTOR的抑制剂^[32]，促进自噬体与溶酶体的融合^[14]，增加自噬小体的数量，降解细胞内容物，促进细胞代谢与自我更新，进而促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化。适度的雷帕霉素可促进细胞自噬，抑制凋亡；雷帕霉素还具有软骨保护作用，可通过促进自噬来改善骨关节炎^[10]。辐射可激活骨髓间充质干细胞的自噬^[33]，而自噬水平的提高对骨髓间充质干细胞具有放射性保护作用。课题组前期对骨髓间充质干细胞增殖、分化等细胞行为有较多研究的基础上开展实施^[34-35]，并未进行软骨细胞的鉴定；在骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中，利用自噬诱导剂雷帕霉素诱导线粒体自噬^[14]，自噬抑制剂氯喹抑制线粒体自噬^[36]，以线粒体形态学研究线粒体自噬对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响，后续将进一步采用RT-PCR、Western blot等手段进行细胞功能表达的鉴定。

综上所述，该研究对二维平面中骨髓间充质干细胞、不同兔龄软骨细胞以及骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化过程进行线粒体染色，一方面建立了线粒体自噬染色评价细胞状态的方法，观察并明确了软骨细胞老化程度与线粒体自噬相关；另一方面骨髓间充质干细胞成软骨分化程度越高，其线粒体自噬越接近于软骨细胞，同时线粒体自噬更有利于骨髓间充质干细胞成软骨分化。但是要证明线粒体自噬在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用需要进一步的实验和更深入研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

线粒体自噬：在细胞生长发育过程中，缺氧等应激反应使线粒体受损，受损线粒体被双层膜结构包裹，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，降解所包裹的细胞器，完成细胞器的更新。

骨髓间充质干细胞：是一类间充质来源的具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞，在特定的微环境中可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等，广泛应用于临床研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

随着社会老龄化和经济快速发展带来快节奏、高压力的生活方式，退行性骨关节炎、创伤等原因导致的软骨缺损呈现日益增长的趋势。软骨没有血管，损伤部位难以自愈。随着组织工程的不断发展和深入认识，软骨缺损修复的策略和技术也得到创新性发展，基于组织诱导理论的组织诱导性生物材料受到科研人员和临床医生的广泛关注。目前，具有诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的生物材料的研发已取得一定的成果。该研究立足于当前的研究热点线粒体自噬，通过体外模拟软骨细胞的发育微环境，探讨线粒体自噬在骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中的影响，为进一步软骨诱导性基质的研发提供指导，也为进一步阐明胶原水凝胶的软骨诱导机制提供研究基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程