1.4.2  小鼠骨关节炎模型建立  实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板胫骨韧带切除，游离内侧半月板。术前小鼠自由摄取食水，每周更换垫料，造模时间在小鼠10周龄、骨骼肌肉发育成熟后进行。体积分数1%戊巴比妥钠(8 μL/g)进行腹腔麻醉，麻醉起效后将小鼠右膝关节周围的鼠毛剔除，并用棉球蘸取碘伏进行消毒。随后在解剖显微镜下将小鼠右膝关节处皮肤切开，沿髌骨韧带内侧纵行切开肌肉，将其外翻后钝性分离肌肉等组织，暴露胫骨平台与内侧半月板胫骨韧带。将内侧半月板胫骨韧带切断，游离内侧半月板，造成膝关节不稳定以诱导骨关节炎^[14]，最后生理盐水冲洗，并将外翻的髌骨韧带复位，缝合切口^[14-15]。麻醉苏醒后，将小鼠放回原笼中继续饲养，勤换垫料与观察伤口情况，小鼠自由摄取食水、可自由活动。假手术组仅切开关节囊。

1.4.3  组织取材  实验组分别在术后4周与8周进行取材，假手术组在第8周取材，将小鼠断颈处死后取其右侧膝关节，将皮肤肌肉大致剔除，用40 g/L多聚甲醛固定组织标本，放于4 ℃冰箱。第2天用去离子水冲洗后置于摇床上进行脱钙，持续4周左右，脱钙液隔天更换一次。脱钙完成后将标本放入包埋盒并标记分组，用流水冲洗过夜，洗净脱钙液。第2天进行脱水，脱水完成后取出标本，将关节的内侧面朝金属模具底下进行包埋，期间注意保持关节面的平整，包埋完成后将蜡块放入冰箱冻存。

1.4.4  组织切片与脱蜡水化  蜡块切片厚度均为4 μm，切片之后将其置于37 ℃恒温箱干燥过夜。脱蜡水化前，先将组织切片置于60 ℃风箱中烤片1.0-2.0 h，随后在二甲苯(2次)和梯度乙醇(体积分数100%，100%，90%，80%，70%，50%)中按顺序进行脱蜡水化，2次二甲苯和2次无水乙醇每次10 min，其余每次5 min。

1.4.5  番红O快速绿染色与骨关节炎OARSI评分  切片脱蜡水化后铁苏木精染色15 s，水洗后吹干。体积分数1%固绿溶液染色1 min，冰醋酸浸泡数秒后吹干，体积分数0.5%番红O染液染色3 min，吹去多余染料，于显微镜下观察颜色深浅是否合适。随后二甲苯透明，过夜风干，隔天用中性树胶封固，显微镜下观察。切片关节组织的结构改变情况参照国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分标准，其可反映骨关节炎严重程度，评分越高，骨关节炎软骨损伤越严重。

1.4.6  苏木精-伊红染色  切片脱蜡水化后铁苏木精染色15 s，水洗后吹干切片。伊红染液染色30 s，流水洗去多余染液，二甲苯透明后风干过夜，次日用中性树胶封固定，显微镜观察。

1.4.7  免疫荧光  组织切片脱蜡水化后浸泡于枸橼酸，在60 ℃水浴箱中过夜修复，次日PBS洗3次，每次5 min。用山羊血清在室温下封闭1 h后加入RB1CC1(1∶100)与BSP2(1∶100)混合—抗工作液，在4 ℃条件下过夜孵育14-16 h，次日PBS洗3次，每次5 min。避光滴加兔抗羊(594)(1∶500)与鼠抗羊(488)(1∶500)混合荧光二抗，孵育1 h后PBS洗3次，每次5 min，注意避光。最后用DAPI染核封固。在荧光显微镜下，观察切片组织中RB1CC1及BSP2的表达情况。

1.4.8  免疫组化  脱蜡水化与枸橼酸修复步骤同上。加体积分数3%过氧化物酶抑制剂，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。用山羊血清在室温条件下封闭1 h。加入Ⅱ型胶原(1∶100)—抗液在4 ℃条件下过夜孵育14-16 h，次日PBS洗3次，每次5 min。室温下滴加兔抗羊(1∶200)二抗，孵育1 h后PBS洗3次，每次5 min。DAB避光显色，苏木素染核，脱水透明后中性树胶封固，显微镜下观察拍照。

1.5  主要观察指标  ①切片组织学改变与骨关节炎OARSI 评分；②组织中Ⅱ型胶原、RB1CC1及BSP2的表达水平。

1.6  统计学分析  用EXCEL2013(美国微软公司)整理汇总资料，Photoshop CS6软件(美国Adobe Systems公司)处理图片，Graph Pad Prism8软件做图分析(美国Graph Pad公司)，SPSS 23.0软件(美国IBM公司)进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较检测评估假手术组与4周及8周实验组的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.2.2  苏木精-伊红染色  实验组的软骨下骨结构可见重塑增多，见图2。

2.3  骨关节炎小鼠关节Ⅱ型胶原的表达情况  免疫组化结果显示，术后4周与8周，实验组关节软骨面Ⅱ型胶原的表达逐渐降低，见图3。

2.4  骨关节炎小鼠关节软骨下骨RB1CC1及BSP2的表达情况  免疫荧光结果显示，假手术组RB1CC1表达多位于髓腔，术后4周与8周实验组RB1CC1在软骨下骨的表达上升(P < 0.05)，见图4。RB1CC1与BSP2双染结果显示，RB1CC1的表达与成骨相关指标BSP2的表达有一致性，见图5。

骨关节炎是一种普遍的慢性疾病，主要影响膝关节和髋关节等负重关节，是全球人口致残的重要原因之一，对个人和社会都造成巨大的经济负担^[1-2]。骨关节炎以关节软骨的退行性变为主要特征，并可累及软骨下骨、半月板和滑膜等组织，病理表现以软骨退变、软骨下骨重建、骨赘形成和滑膜炎症为主^[3-4]。但骨关节炎的具体发病机制目前尚未明确，且在临床上缺乏能治疗骨关节炎的有效药物^[5]。一直以来对于骨关节炎发病机制与治疗靶点的研究多以关节软骨作为主要突破口，但近年来随着研究的不断深入，越来越多的研究将范围转向非软骨组织以寻求新的突破，软骨下骨在骨关节炎中的发病机制受到的关注日益增加^[6-8]。

视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白1(RB1-inducible coiled-coil 1，RB1CC1)是一种相对分子质量为200的FAK家族相互作用蛋白，可在肌肉骨骼以及小鼠胚胎中大量表达^[9-10]，对细胞的生长、分化、凋亡和自噬起到重要的调控作用^[10-11]，而骨关节炎的发生发展与细胞的代谢、凋亡及自噬直接相关^[12-13]。

因此，此次实验拟探索在骨关节炎进展中RB1CC1蛋白在软骨下骨的表达情况，这将有助于研究骨关节炎进程中软骨下骨的分子机制及相关信号传导通路，为疾病的诊断和治疗靶点提供新思路与理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  机对照动物实验。

1.2  时间与地点  于2018年7月至2019年8月在南方医科大学第三附属医院中心实验室完成。

1.3  材料　

1.3.1  实验动物  8周龄雄性清洁级C57小鼠，共24只，体质量为25-28 g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号为：No.44007200045971。实验方案于2017-12-13经南方医科大学第三附属医院动物实验伦理委员会批准，批准号为No.44007200038731。

1.3.2  实验使用的主要试剂和仪器  乙二胺四乙酸二钠、苏木精粉剂、DAPI染液、番红O快速绿购自Sigma；甘油、多聚甲醛、75%乙醇及二甲苯购自广州化学试剂厂；抗体：RB1CC1抗体(17250-1-AP)、Ⅱ型胶原抗体(15943-1-AP)购自Proteintech；骨涎蛋白(BSP2)抗体(SC-73630)购自Santa Cruz；兔抗羊、鼠抗羊二抗、荧光二抗购自北京锐抗；荧光显微镜、倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.4  方法

1.4.1  实验动物分组  将24只小鼠按随机数表法分为实验组和假手术组，各12只。实验组又随机分为4周和8周2个亚组，各6只。

1.4.2  小鼠骨关节炎模型建立  实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板胫骨韧带切除，游离内侧半月板。术前小鼠自由摄取食水，每周更换垫料，造模时间在小鼠10周龄、骨骼肌肉发育成熟后进行。体积分数1%戊巴比妥钠(8 μL/g)进行腹腔麻醉，麻醉起效后将小鼠右膝关节周围的鼠毛剔除，并用棉球蘸取碘伏进行消毒。随后在解剖显微镜下将小鼠右膝关节处皮肤切开，沿髌骨韧带内侧纵行切开肌肉，将其外翻后钝性分离肌肉等组织，暴露胫骨平台与内侧半月板胫骨韧带。将内侧半月板胫骨韧带切断，游离内侧半月板，造成膝关节不稳定以诱导骨关节炎^[14]，最后生理盐水冲洗，并将外翻的髌骨韧带复位，缝合切口^[14-15]。麻醉苏醒后，将小鼠放回原笼中继续饲养，勤换垫料与观察伤口情况，小鼠自由摄取食水、可自由活动。假手术组仅切开关节囊。

1.4.3  组织取材  实验组分别在术后4周与8周进行取材，假手术组在第8周取材，将小鼠断颈处死后取其右侧膝关节，将皮肤肌肉大致剔除，用40 g/L多聚甲醛固定组织标本，放于4 ℃冰箱。第2天用去离子水冲洗后置于摇床上进行脱钙，持续4周左右，脱钙液隔天更换一次。脱钙完成后将标本放入包埋盒并标记分组，用流水冲洗过夜，洗净脱钙液。第2天进行脱水，脱水完成后取出标本，将关节的内侧面朝金属模具底下进行包埋，期间注意保持关节面的平整，包埋完成后将蜡块放入冰箱冻存。

1.4.4  组织切片与脱蜡水化  蜡块切片厚度均为4 μm，切片之后将其置于37 ℃恒温箱干燥过夜。脱蜡水化前，先将组织切片置于60 ℃风箱中烤片1.0-2.0 h，随后在二甲苯(2次)和梯度乙醇(体积分数100%，100%，90%，80%，70%，50%)中按顺序进行脱蜡水化，2次二甲苯和2次无水乙醇每次10 min，其余每次5 min。

1.4.5  番红O快速绿染色与骨关节炎OARSI评分  切片脱蜡水化后铁苏木精染色15 s，水洗后吹干。体积分数1%固绿溶液染色1 min，冰醋酸浸泡数秒后吹干，体积分数0.5%番红O染液染色3 min，吹去多余染料，于显微镜下观察颜色深浅是否合适。随后二甲苯透明，过夜风干，隔天用中性树胶封固，显微镜下观察。切片关节组织的结构改变情况参照国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分标准，其可反映骨关节炎严重程度，评分越高，骨关节炎软骨损伤越严重。

1.4.6  苏木精-伊红染色  切片脱蜡水化后铁苏木精染色15 s，水洗后吹干切片。伊红染液染色30 s，流水洗去多余染液，二甲苯透明后风干过夜，次日用中性树胶封固定，显微镜观察。

1.4.7  免疫荧光  组织切片脱蜡水化后浸泡于枸橼酸，在60 ℃水浴箱中过夜修复，次日PBS洗3次，每次5 min。用山羊血清在室温下封闭1 h后加入RB1CC1(1∶100)与BSP2(1∶100)混合—抗工作液，在4 ℃条件下过夜孵育14-16 h，次日PBS洗3次，每次5 min。避光滴加兔抗羊(594)(1∶500)与鼠抗羊(488)(1∶500)混合荧光二抗，孵育1 h后PBS洗3次，每次5 min，注意避光。最后用DAPI染核封固。在荧光显微镜下，观察切片组织中RB1CC1及BSP2的表达情况。

1.4.8  免疫组化  脱蜡水化与枸橼酸修复步骤同上。加体积分数3%过氧化物酶抑制剂，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。用山羊血清在室温条件下封闭1 h。加入Ⅱ型胶原(1∶100)—抗液在4 ℃条件下过夜孵育14-16 h，次日PBS洗3次，每次5 min。室温下滴加兔抗羊(1∶200)二抗，孵育1 h后PBS洗3次，每次5 min。DAB避光显色，苏木素染核，脱水透明后中性树胶封固，显微镜下观察拍照。

1.5  主要观察指标  ①切片组织学改变与骨关节炎OARSI 评分；②组织中Ⅱ型胶原、RB1CC1及BSP2的表达水平。

1.6  统计学分析  用EXCEL2013(美国微软公司)整理汇总资料，Photoshop CS6软件(美国Adobe Systems公司)处理图片，Graph Pad Prism8软件做图分析(美国Graph Pad公司)，SPSS 23.0软件(美国IBM公司)进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较检测评估假手术组与4周及8周实验组的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

近年来，大多数研究以软骨退变作为探索骨关节炎分子机制和治疗手段的靶标，如软骨细胞的损伤与相关信号通路改变等^[16-18]。然而，通过骨关节炎动物模型的构建，在骨关节炎进展过程中都有显著的软骨下骨形态改变以及骨重建与骨吸收之间的代谢失衡^[19-20]，提示软骨下骨也和骨关节炎疾病密切相关。但目前关于软骨下骨的分子机制与病理作用在骨关节炎中的研究较少，且调控机制尚不清楚。

软骨下骨位于关节软骨之下，包括皮质骨软骨下骨板和骨小梁结构，主要起到维持关节力学形态和减轻应力负荷的作用。软骨下骨的弹性模量与关节软骨相比较低，能够在负荷刺激关节软骨时发挥缓冲作用，避免关节软骨过度损伤^[20]。在骨关节炎患者和小鼠骨关节炎模型中通过对组织切片的观察可发现，随着骨关节炎的进展软骨下骨发生了显著的形态改变，进一步的实验也显示骨关节炎中软骨下骨的骨量较正常可增加10%以上，并且出现明显的骨代谢失衡情况，早期破骨代谢活跃导致软骨下骨的骨吸收增强，中晚期成骨代谢加强使软骨下骨变硬，从而失去了对应力负荷的缓冲功能^[20-21]。相关研究早在1972年已有报道，实验以应力负荷为出发点，围绕软骨下骨的震荡吸收功能，提出软骨下骨可能是骨关节炎发生发展的始动因素这一观点^[22]。近年来，越来越多的实验也证实了骨关节炎进展中软骨下骨的异常变化，以早期重构与晚期矿化为主要特征，其中骨量与成骨矿化指标增加、H型血管形成等都在一定程度上改变了软骨下骨的力学形态，从而加剧了关节软骨的损伤^[23-25]。

RB1CC1最初通过酵母双杂交筛选鉴定为Pyk2相互作用蛋白，随后被鉴定为RB1基因的潜在调节因子，在心脏、睾丸、肌肉骨骼以及小鼠胚胎中大量表达^[9-11]，对细胞的生长分化、凋亡和自噬起到重要的调控作用^{[10-11, 26-27]}，与mTOR下游因子ULK1共同组成复合物^[28]，从而参与对自噬的调控，并且有研究证明了RB1CC1促分解代谢的作用，能够在软骨细胞中抑制Ⅱ型胶原的合成^[29]。因此基于RB1CC1的生理功能及对自噬的调控作用，实验通过构建骨关节炎动物模型拟探索骨关节炎进程中软骨下骨RB1CC1的表达情况，并与BSP2进行荧光双染。

此次实验从组织形态学上观察到骨关节炎小鼠的关节软骨退变明显，4周出现蛋白聚糖的丢失，8周程度加重并且可见部分软骨缺损，并且软骨下骨骨小梁紊乱，形态异常。免疫组化结果显示骨关节炎小鼠关节软骨面Ⅱ型胶原的表达降低，反映了骨关节炎进程中关节软骨细胞基质的降解变化。免疫荧光结果显示RB1CC1在软骨下骨的表达逐渐升高，提示RB1CC1的表达与骨关节炎的发生发展有关联。另外RB1CC1与成骨相关指标BSP2的表达趋势有一致性，BSP2是小整合素结合配体N端联结糖蛋白家族的成员之一,由分化成熟的成骨细胞表达，能够激活成骨并引导矿化^[30-32]，并且参与调控骨改建过程的多个环节,与破骨细胞分化和过度活跃的骨吸收密切相关，与RANKL、骨桥蛋白等基因均高表达于骨关节炎患者^[33-35]。此外，有研究报道BSP2的促血管生成作用，可能参与软骨下骨H型血管形成^[30]，从而加剧软骨下骨的增生与重塑^{[31, 36]}。实验通过将RB1CC1与BSP2荧光双染，观察到二者定位和表达趋势均有一致性，提示RB1CC1可能参与调控骨吸收与重建之间的代谢改变。

目前关于RB1CC1在骨关节炎中的研究较少，早期在发现RB1CC1对抑癌基因RB1有调控作用后^[37]，大多数实验重点倾向于研究RB1CC1对肿瘤和胚胎发育的作用，其中以研究细胞增殖和分化功能为主^[38-40]。随着研究的深入，RB1CC1在自噬中的调控作用受到越来越多的关注，可与mTOR下游因子ULK1形成共同复合物，参与mTOR信号通路从而调控自噬^[41-42]，它也可与抑癌基因P53结合，使自身活性降低从而影响自噬^[43-44]。在转基因小鼠中敲除RB1CC1基因后，可检测到自噬水平的降低^[45]，这更加验证了RB1CC1对自噬的调控作用。此外，相关文献报道了在骨关节炎临床标本和动物模型中，观察到ULK1表达下降与P53表达上升的现象^[46-48]，并且有关文献通过构建基因敲除小鼠证实了自噬在骨关节炎病理过程中的保护性作用^{[46-47, 49-51]}。

因此，作者以RB1CC1作为突破点，探索其在骨关节炎中是否具有表达差异性。通过动物模型的构建，最终从组织形态学上观察到RB1CC1有差异性表达，并且表达水平随着骨关节炎进展程度逐渐上升，这在一定程度上表明了RB1CC1与骨关节炎病程的关联性，为后续研究RB1CC1在骨关节炎中的作用和机制奠定了前期的理论基础。

实验尚有几处不足之处，包括未探讨RB1CC1对骨关节炎的直接作用，以及未涉及RB1CC1对骨关节炎相关信号通路的调控，因此后续实验有很大空间可以深入探索RB1CC1在骨关节炎软骨和软骨下骨中的功能作用，以及它通过调控自噬信号通路参与骨关节炎病理过程的分子机制。综上所述，实验结果可初步证实在骨关节炎发病进程中，RB1CC1的表达在软骨下骨存在差异性改变，并且可能促进软骨下骨的增生及重塑，为骨关节炎中软骨下骨的机制研究提供新的研究方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白1(RB1-inducible coiled-coil 1，RB1CC1)：是一种相对分子质量为200的FAK家族相互作用蛋白，最初通过酵母双杂交筛选鉴定为Pyk2相互作用蛋白，并可作为RB1基因的潜在调节因子，参与肿瘤细胞的周期调控。RB1CC1多在心脏、睾丸、肌肉骨骼以及小鼠胚胎等组织中大量表达，对细胞的生长、分化、凋亡和自噬起到重要的调控作用。

骨涎蛋白：是一种由成骨细胞、破骨细胞合成的磷酸化糖蛋白，相对分子质量为75，含有约300个氨基酸。在骨组织中大量表达，可特异性定位于矿化的骨组织内，参与成骨细胞和破骨细胞的骨代谢活动，是成骨细胞矿化成熟的标志。骨涎蛋白的RGD序列基因可与血管内皮细胞的整合素结合，从而引导软骨组织内血管形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

课题通过构建小鼠创伤性骨关节炎模型，在不同时间点观察目的蛋白视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白1（RB1-inducible coiled-coil 1，RB1CC1）的变化趋势，并通过免疫荧光实验，与成骨矿化指标骨涎蛋白共同定位染色，检测RB1CC1在软骨下骨的表达，验证了RB1CC1表达与骨关节炎进展及软骨下骨骨代谢活动的关联性，有助于后续相关分子机制和信号通路的深入研究。

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