影响大鼠自体脂肪组织移植后留存体积的变量因素

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1486

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (35): 5652-5657.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1486

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影响大鼠自体脂肪组织移植后留存体积的变量因素

贾大平，马莉，吴亮亮，赵宇

(安徽医科大学第一附属医院整形外科，安徽省合肥市 230022)

收稿日期:2019-05-21 出版日期:2019-12-18 发布日期:2019-12-18
通讯作者: 赵宇，博士，教授，安徽医科大学第一附属医院整形外科，安徽省合肥市 230022
作者简介:贾大平，男，1992年生，安徽省含山县人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事脂肪组织移植及氧化应激凋亡的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81171829)，项目负责人：赵宇

Variables affecting the retained volume of adipose tissue after transplantation in rats

Jia Daping, Ma Li, Wu Liangliang, Zhao Yu

(Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China)

Received:2019-05-21 Online:2019-12-18 Published:2019-12-18
Contact: Zhao Yu, MD, Professor, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China
About author:Jia Daping, Master candidate, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China
Supported by:
Funding: the National Natural Science Foundation, No. 81171829 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
自体脂肪组织移植：选取腹部、大腿、臀部等脂肪富余部位评估后标记为供区，对供区肿胀麻醉处理后运用负压抽吸或者手术剪切获取脂肪，将获得脂肪进行纯化处理后移植到相应受区，从而完成患者体积扩充或年轻化要求的一种治疗技术。
依达拉奉：是一种脑保护剂(自由基清除剂)。临床研究提示N-乙酰门冬氨酸(NAA)是特异性的存活神经细胞的标志，脑梗死发病初期含量急剧减少。研究表明依达拉奉对缺血或再灌注脑损伤神经细胞的保护作用是通过Bax/Bcl-2依赖性抗细胞凋亡机制实现的。

摘要
背景：自体颗粒脂肪组织移植后高且不稳定的吸收率限制了其临床运用，除早期建立血供的方法外，寻找新的提升存活率的途径尤为重要。
目的：从细胞凋亡角度探究机械剪切及抗凋亡药物依达拉奉对自体脂肪组织移植后体积留存的影响。
方法：实验方案经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准。取42只SD雄性大鼠随机分成A、B、C 3组，模拟临床自体脂肪组织移植行大鼠脂肪组织移植。A组为对照组，6只大鼠，移植中给予脂肪组织130次基础剪切次数；B组又细分为B1、B2和B3组，分别给予脂肪组织230，330,及430次机械剪切；C组细分为C1、C2和C3亚组，分别注射给予脂肪0.1%、0.2%及1%浓度依达拉奉1 mL处理5 min后，再给予脂肪组织130次剪切次数。于脂肪组织移植后即时(术中收获脂肪时留取)及1，4，8周取标本，对标本形态学特征及体积观察记录、苏木精-伊红染色后光镜下观察组织学改变、应用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测比较各组脂肪细胞凋亡比例。
结果与结论：①与对照组比较：B组移植后即时和1周时标本细胞凋亡比例明显增多，移植物吸收速率快；移植后4，8周时苏木精-伊红染色显示脂肪细胞体积大小不一、排列紊乱，移植物留存体积减少(P < 0.05)；C1和C2组移植后即时和1周时标本的细胞凋亡比例明显降低，移植后4，8周时脂肪细胞形态较规则、体积较一致、可见较多血管增生、移植物留存体积明显增多(P < 0.05)；②C3组移植后脂肪吸收率与同期对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③由此得出结论，自体脂肪组织移植中，机械剪切会减少移植后脂肪组织的留存体积，一定浓度的抗凋亡药物依达拉奉能增加移植后脂肪组织的留存体积。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0742-2188(贾大平)

关键词: 脂肪细胞, 移植, 细胞凋亡, 依达拉奉, 脂肪组织, 移植物吸收

Abstract:

BACKGROUND: The high and unstable absorption rate after autologous granule fat transplantation limits its clinical application. In addition to the early establishment of blood supply, it is particularly important to find new ways to improve survival rate.
OBJECTIVE: To investigate the effect of mechanical shearing and anti-apoptotic drug edaravone on the volume retention after autologous fat transplantation from the perspective of apoptosis.
METHODS: The study was approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of Anhui Medical University. Forty-two Sprague-Dawley male rats were randomly divided into three groups: A, B, and C. The rats were transplanted with fat by clinical autologous fat transplantation. Group A was the control group (n=6): the adipose tissue was given 130 times of basic shearing during operation; the B and C groups were given different variables of adipose tissue on the basis of group A. Group B was a mechanical shearing group with a total of 18 rats subdivided into subgroups B1, B2 and B3, which were given 230 times, 330 times and 430 mechanical shears, respectively. Group C was the edaravone group (n=18), subdivided into C1, C2 and C3 subgroups, respectively, given 0.1%, 0.2% and 1% concentration of edaravone, and then the adipose tissue was given 130 times of basic shearing. Graft specimens were taken immediately after operation and at 1, 4 and 8 weeks after transplantation, to observe and record the morphological features and volume of the specimens. The histological changes were observed under a light microscope after hematoxylin-eosin staining. The apoptosis ratio of fat cells in each group was detected by flow cytometry Annexin V/PI double staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the group B: the proportion of apoptosis was increased significantly at immediately and 1 week after surgery, and the graft absorption rate was fast; at 4 and 8 weeks after operation, the volume of hematoxylin- eosin-stained adipocytes was different, the arrangement was disordered, and the graft retention volume was reduced. The graft retention volume was reduced (P < 0.05). C1 and C2 subgroups: the proportion of apoptosis in specimens was significantly decreased at immediately and 1 week after surgery. At 4 and 8 weeks after operation, the morphology of hematoxylin-eosin-stained adipocytes was more regular and volume was more consistent, more blood vessels were visible. The graft retention volume was significantly increased (P < 0.05). (2) There was no significant difference in the fat absorption rate between C3 subgroup and control group (P > 0.05). (3) To conclude, in autologous fat transplantation, mechanical shearing reduces the volume of fat retained after transplantation, and a certain concentration of anti-apoptotic drug edaravone can increase the retained volume of adipose tissue after transplantation.

Key words: fat cells, autograft, apoptosis, edaravone, adipose tissue, absorption of autograft

中图分类号:

贾大平，马莉，吴亮亮，赵宇. 影响大鼠自体脂肪组织移植后留存体积的变量因素[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(35): 5652-5657.

Jia Daping, Ma Li, Wu Liangliang, Zhao Yu. Variables affecting the retained volume of adipose tissue after transplantation in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(35): 5652-5657.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选择大鼠42只，分为7组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 移植物大体形态观察所有大鼠术区未见切口感染，移植标本无脓肿、液化、坏死形成，标本无丢失。术后1，4，8周随时间推移，各组移植物体积不断减小。B组、C组典型图片见图1。

术后1周时，各组移植物观察未见明显差异，移植物呈细颗粒状，表面偶见血性渗液，质地柔软，受区皮肤可见血管增生。术后4周，各组脂肪组织表面皆有新生血管形成，可见纤维组织包膜包裹，移植物质韧，B组偶可触及块状组织，脂肪组织留存体积较对照组下降明显，C1和C2组体积留存较对照组提升明显。术后8周，各组移植脂肪组织体积进一步缩小，但缩小幅度相比4周时小，各组体积留存比较结果与4周时相同，可见血管穿入脂肪团内，B3组标本表面纤维组织包膜厚实，脂肪色黄白，质韧，C1和C2组脂肪组织移植物表面可见明显血管出入，触之质地柔软，C2组最接近正常脂肪组织。

2.3 不同时间各组术后移植物留存体积情况各组术后脂肪组织平均体积留存记录见表2。各组不同时间各亚组移植物体积吸收率见表3。

表2结果表明，随时间延长，大鼠移植后脂肪体积不断缩小，对同期所有实验亚组与对照组比较，7个亚组间数据具有方差齐性，行单因素方差分析，7个组间移植物留存体积不完全相等(F_1周=45.768、F_4周=122.049、F_8周=59.245，P < 0.05)，其中B组移植物留存体积较对照组小，C1和C2移植物留存体积显著大于对照组(P < 0.05)。对同一时期B组、C组内亚组间两两对比留存体积，行SNK检验，1周时，B3对比B1、B2组移植物留存体积明显较小(F_B组组间= 16.422，P < 0.05)，C组各亚组移植物留存体积差异无显著性意义(F_C组组间=3.256，P > 0.05)；4周时，B组各亚组移植物留存体积成梯度下降，B3<B2<B1，C1、C2对比C3组移植物留存体积显著增加(F_B组组间=18.514，F_C组组间= 35.975，P < 0.05)；8周时B3与B1留存体积比较明显缩小(F_B组组间=4.339，P < 0.05)，C组各亚组移植物留存体积从大到小排序为C2>C1>C3，差异有显著性意义(F_C组组间= 44.322，P < 0.05)。以上统计结果表明，大鼠自体脂肪组织移植中给予获取的脂肪浓度不超过0.2%的依达拉奉注射能明显提高移植后脂肪组织体积留存率，机械剪切会显著降低脂肪组织移植后体积留存。

表3结果显示，8周时，相比对照组，B3组脂肪组织体积吸收率增加了约14%，C2组脂肪组织体积吸收率降低约16%，C3组移植后脂肪吸收率与同期对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 组织学比较苏木精-伊红染色结果观察分析发现：术后1，4周时，各组脂肪细胞形态均维持较好，呈圆形或规则多边形，细胞壁完整，细胞核偏向一侧，细胞间间隙稳定，可见明显炎症细胞浸润；术后8周，对照组可见脂肪细胞体积不一，结构紊乱、毛细血管增生，纤维组织包饶脂肪细胞，B3组脂肪细胞排列紊乱，间质有纤维组织增生、炎性细胞浸润，可见脂肪细胞形态明显不规则，见较多脂肪空泡形成，C2组脂肪细胞轮廓清晰，细胞形态较规则，细胞体积较一致，可见丰富毛细血管增生，仅有少量脂肪空泡形成。B组、C组典型图片见图2。

2.5 流式细胞仪细胞凋亡检测术后即时、1周、4周取标本行流式细胞仪凋亡检测结果见图3。对同一取材时间各标本流式图取第二及第四象限凋亡细胞和作为总凋亡细胞，结果表明，相比对照组，术后即时、术后1周时，B3组凋亡细胞比例增加，C2组比例降低明显；术后4周各组脂肪细胞凋亡比例大幅度减少。

参考文献

[1]Sarkarat F.Fat Graft with Growth Factors. Atlas Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 2018;26(1):33-39.

[2]Leuchter I,Schweizer V,Hohlfeld J.Treatment of velopharyngeal insufficiency by autologous fat injection. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2010;267(6):977-983.

[3]Coleman SR.Structural fat grafts: the ideal filler?. Clin Plast Surg. 2001;28(1):111-119.

[4]Karaçal N,Cobano?lu U,Ambarcio?lu O.The effect of fibrin glue on fat graft survival. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2007;60(3): 300-303.

[5]Yu Q,Cai Y,Huang H,et al.Co-Transplantation of Nanofat Enhances Neovascularization and Fat Graft Survival in Nude Mice. Aesthet Surg J. 2018;38(6):667-675.

[6]Coleman SR.Hand rejuvenation with structural fat grafting. Plast Reconstr Surg. 2002;110(7):1731-1744; discussion 1745-1747.

[7]Coleman SR.Long-term survival of fat transplants: controlled demonstrations. Aesthetic Plast Surg. 1995;19(5):421-425.

[8]Coleman SR.Facial recontouring with lipostructure. Clin Plast Surg. 1997;24(2):347-367.

[9]Por YC,Yeow VK,Louri N,et al.Platelet-rich plasma has no effect on increasing free fat graft survival in the nude mouse. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2009;62(8):1030-1034.

[10]Pires Fraga MF,Nishio RT,Ishikawa RS,et al.Increased survival of free fat grafts with platelet-rich plasma in rabbits. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010;63(12):e818-22.

[11]Ding SL, Zhang MY, Tang SJ,et al. Effect of Calcium Alginate Microsphere Loaded With Vascular Endothelial Growth Factor on Adipose Tissue Transplantation.Ann Plast Surg.2015; 75(6): 644-651.

[12]Raposio E.How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(18):4252-4260.

[13]von Heimburg D,Hemmrich K,Haydarlioglu S,et al.Comparison of viable cell yield from excised versus aspirated adipose tissue. Cells Tissues Organs. 2004;178(2):87-92.

[14]Wolter TP,von Heimburg D,Stoffels I,et al.Cryopreservation of mature human adipocytes: in vitro measurement of viability. Ann Plast Surg. 2005;55(4):408-413.

[15]Lee JH,Kirkham JC,McCormack MC,et al.The effect of pressure and shear on autologous fat grafting. Plast Reconstr Surg. 2013; 131(5):1125-1136.

[16]Lapchak PA.A critical assessment of edaravone acute ischemic stroke efficacy trials: is edaravone an effective neuroprotective therapy?. Expert Opin Pharmacother. 2010;11(10):1753-1763.

[17]Inokuchi Y,Imai S,Nakajima Y,et al.Edaravone, a free radical scavenger, protects against retinal damage in vitro and in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 2009;329(2):687-698.

[18]Qin T,Lei LY,Li N,et al.Edaravone improves survival and neurological outcomes after CPR in a ventricular fibrillation model of rats. Am J Emerg Med. 2016;34(10):1944-1949.

[19]Amemiya S,Kamiya T,Nito C,et al.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of edaravone following transient focal ischemia in rats. Eur J Pharmacol. 2005;516(2):125-130.

[20]赵贤忠,孙纪燕,项铁,等.三种获取方法对脂肪细胞损伤程度的比较[J].中国临床康复,2006,10(21):103-105.

[21]Hong KY,Yim S,Kim HJ,et al.The Fate of the Adipose-Derived Stromal Cells during Angiogenesis and Adipogenesis after Cell-Assisted Lipotransfer. Plast Reconstr Surg. 2018;141(2): 365-375.

[22]Neuber GA.Fetttran splantation.Vehr Dtsch Ges Chir.1893;22:66.

[23]Brunning P.Contribution à l’étude des greffes adipeuses.Bull Mem Acad R Med Belg.1919;28:440.

[24]Kling RE, Mehrara BJ, Pusic AL, et al.Trends in Autologous Fat Grafting to the Breast. Plast Reconstr Surg. 2013;132(1):35-46.

[25]Ozkaya O,Egemen O,Barutça SA.Long-term clinical outcomes of fat grafting by low-pressure aspiration and slow centrifugation (Lopasce technique) for different indications. J Plast Surg Hand Surg. 2013;47(5):394-398.

[26]Yi C,Pan Y,Zhen Y,et al.Enhancement of viability of fat grafts in nude mice by endothelial progenitor cells. Dermatol Surg. 2006; 32(12):1437-1443.

[27]Eto H,Kato H,Suga H,et al.The fate of adipocytes after nonvascularized fat grafting: evidence of early death and replacement of adipocytes. Plast Reconstr Surg. 2012;129(5): 1081-1092.

[28]Coleman SR. Long-term survival of fat transplants: controlled demonstrations. Aesthetic Plast Surg. 1995;19(5):421-425.

[29]Kanchwala SK.Facial fat grafting: the search for predictable results. Facial Plast Surg. 2003;19(1):137-146.

[30]Mikus JL,Koufman JA.Fate of liposuctioned and purified autologous fat injections in the canine vocal fold. Laryngoscope. 1995;105(1):17-22.

[31]Gillis J,Gebremeskel S,Phipps KD,et al.Effect of N-Acetylcysteine on Adipose-Derived Stem Cell and Autologous Fat Graft Survival in a Mouse Model. Plast Reconstr Surg. 2015;136(2):179e-188e.

[32]Wang WZ,Fang XH,Williams SJ,et al.Analysis for apoptosis and necrosis on adipocytes, stromal vascular fraction, and adipose-derived stem cells in human lipoaspirates after liposuction. Plast Reconstr Surg. 2013;131(1):77e-85e.

[33]Witort EJ,Pattarino J,Papucci L,et al.Autologous lipofilling: coenzyme Q10 can rescue adipocytes from stress-induced apoptotic death. Plast Reconstr Surg. 2007;119(4):1191-1199.

[34]雷华,李青峰.抽吸负压对所抽吸脂肪颗粒活性影响的研究[J].中国美容医学,2005,14(1):27-30.

[35]柳丛,李云霞,叶媛,邹敬江,胡葵葵.提高脂肪移植存活成功率的研究进展[J].中国美容医学,2018,27(10):155-159.

[36]Toledo LS,Mauad R. Fat injection:a 20-year revision.Clin Plast Surg.2006;33:47-53.

[37]Rose JG,Lucarelli MJ,Lemke BN,et al.Histologic comparison of autologous fat processing methods. Ophthalmic Plast Reconstr Surg. 2006;22(3):195-200.

引言

自体脂肪组织移植是整形美容医生治疗软组织轮廓畸形的常用方法^[1]，广泛用于矫正先天性或后天性面部软组织缺损及隆乳、隆颜和隆鼻等美容手术。除了具有良好的生物相容性、非免疫原性、丰富性、取材方便等优点，自体脂肪组织移植后受区外观自然、具有良好的物理特性^[2-4]，同时还可以解决供区局部脂肪堆积问题，可谓一举两得。临床实践观察显示，脂肪组织自体移植后随时间出现的移植物平均体积减少量占总体积的20%-80%^[5]，为了降低脂肪组织吸收率，外科医生们致力于完善移植技术和早期重建血供，Coleman^[3，6-8]对自体脂肪组织移植的研究认为，脂肪组织移植成功的关键在于改进移植技术。目前对脂肪组织移植进一步探索认为，自体脂肪组织移植后影响移植物存活的重要因素包括移植物是否固定、受体部位是否具体良好的血管分布、移植物采集方法及后期处理是否合适等^[9-10]。研究表明，移植后脂肪组织中央血管出现最早在术后第4天^[11]，在此之前，中央位置的脂肪细胞是无法通过渗透作用获得营养供应的，而对脂肪细胞的生理特性研究表明，成熟脂肪细胞十分脆弱，对创伤和缺血刺激敏感且不耐受^[12-14]。因此，了解移植操作中的致凋亡因素，探究术后脂肪细胞凋亡状况，寻找合适的抗凋亡药物，对减少手术操作带来的移植细胞凋亡、坏死从而提高脂肪组织长期留存体积很有必要。

临床自体脂肪组织移植常用的技术为Coleman^[8]负压抽吸法，即运用侧壁带有多个孔隙的金属套管负压抽吸获得脂肪组织，再以3 000 r/min离心3 min得到Coleman颗粒脂肪。在此过程中，金属管壁来回抽吸及3 000 r/min离心时的剪切力对脂肪细胞都会造成机械损伤^[15]。

依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，edaravone，EDA)是一种临床治疗帕金森病和急性脑梗死的常用药物^[16]，研究发现依达拉奉不仅能清除细胞内的羟基自由基(?OH)，还清除了超氧阴离子(O₂^-?)和过氧化氢(H₂O₂)^[17]。此外，研究表明依达拉奉出对缺血或再灌注脑损伤神经细胞的保护作用是通过Bax/Bcl-2依赖性抗细胞凋亡机制实现的^[18-19]。实验通过给予脂肪组织不同剪切次数模拟Coleman技术套管带来的不同剪切力，探究了抽吸过程中剪切力对脂肪细胞凋亡的影响程度，并研究了依达拉奉对脂肪细胞的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组动物实验。

1.2 时间及地点于2017年5月至2018年5月在安徽医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料健康、清洁级雄性SD大鼠42只，体质量190-250 g，由安徽医科大学动物实验中心提供。PBS、DMEM培养基、0.25%胰酶细胞消化液、依达拉奉购自Hyclone公司；Annexin V/PI Apoptosis DetectionKit I细胞凋亡双染试剂盒购自上海BD公司；苏木紫染色液及尹红染色液购自Baso公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组将42只雄性SD大鼠适应性饲养1周后随机分成A、B、C 3组：A组为对照组，共6只大鼠，收获双侧腹股沟脂肪后，最小剪切次数^[20](大小约1 mm×1 mm× 1 mm，剪切次数约130次)下获得脂肪颗粒模拟临床抽吸法脂肪组织移植术，行背部皮下腔隙移植；B、C组手术过程在A组基础上给予脂肪组织不同变量，B组为机械剪切组，共18只大鼠，细分为B1、B2和B3亚组，分别给予脂肪组织230，330及430次机械剪切次数形成移植颗粒；C组为依达拉奉组，细分为C1、C2和C3亚组，术中分别给予脂肪组织0.1%、0.2%及1%浓度的依达拉奉处理。处理方法见表1。

1.4.2 自体脂肪组织移植动物实验健康雄性SD大鼠，尾部标记编号后，3.5%水合氯醛按0.01 mL/g行腹腔注射，麻醉完全后备皮、碘伏常规消毒大鼠腹股沟脂肪供区，无菌条件下切开大鼠皮肤，暴露腹股沟脂肪垫，完整切取双侧腹股沟脂肪垫，去除脂肪垫表面筋膜组织后，按分组不同给予下列处理：A组眼科剪130次剪切(剪切形成1 mL注射器去除针头后的可吸取脂肪颗粒所需最少剪切次数)；B组使用眼科剪分别给予脂肪组织230，330及430次机械剪切；C组分别注射给予脂肪组织0.1%、0.2%及1%浓度依达拉奉 1 mL处理5 min后，使用眼科剪行130次最小剪切次数。2支1 mL注射器抽取体积为2 mL的脂肪颗粒备用。切取脂肪垫过程中注意保存附近血管、神经，以整体方式收获脂肪垫后，对出血区域进行缝扎止血，碘仿消毒术区，间断缝合切口。改变大鼠体位，备皮、常规消毒大鼠背部受区，取背部标记上、中、下位点，手术尖刀切开长约0.3 cm的小口，无菌止血钳于皮下行局部游离，形成脂肪组织移植皮下腔隙口袋，将准备好的颗粒脂肪分别注射于腔隙口袋中，注射量为0.5 mL(剩余0.5 mL颗粒脂肪做术后即时取材标本行细胞凋亡检测)，术后荷包缝合关闭切口，切口局部涂红霉素软膏，肌肉注射青霉素预防术后感染，将大鼠置于加温垫上麻醉复苏。复苏后称质量记录，送回鼠笼饲养，饮水、食料和饲养条件均与前相同，移植后每周记录观察手术移植区状况。

1.4.3 取材每组大鼠术后即时(术中收获脂肪组织时留取)取材行流式细胞学检测脂肪细胞凋亡情况，术后1，4，8周分别随机选择同一变量条件分组下的2只大鼠，麻醉下行颈椎脱臼法处死后取标本。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察观察移植物大小、颜色、质地、血管生长情况、周围组织反应等。

1.5.2 体积测定及体积留存率计算完整剥离出移植物，尽量剥除纤维组织包膜后，置入装有读数为2 mL磷酸盐缓冲液的5 mL量筒中，确保磷酸盐缓冲液完全淹没移植物，读取液平面刻度X，排水法计算脂肪组织标本留存体积等于X减去2 mL，结果精确到0.1 mL，计算并记录脂肪组织移植不同时间标本体积吸收率=[0.5-(X-2)]/0.5×100%。体积测定后，每一样本组织平均分成2份，一份用体积分数4%甲醛溶液固定留作后续组织学检测，一份立即制备成脂肪细胞单悬液进行细胞凋亡率检测。

1.5.3 苏木精-伊红染色取各组大鼠移植物标本组织，40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，浓度梯度乙醇脱水，石蜡包埋固定后制备厚度为4 μm的组织切片，常规苏木精-伊红染色后，在倒置显微镜100倍视野下双盲观察移植物新生血管生成及脂肪细胞结构和形态改变并拍照。

1.5.4 流式细胞仪凋亡检测取标本脂肪组织生理盐水冲洗干净，剔除大体可见的血管及结缔组织，稍处理剪碎后Ⅰ型胶原酶消化后制备成脂肪细胞单悬液，使用Annexin V/PI染剂进行双染，流式细胞仪检测，激发光波长为488 nm，FITC荧光检测波长515 nm，PI荧光检测波长大于560 nm。根据四象限散点图，观察并分析计算脂肪凋亡情况。

1.6 统计学分析由第一作者用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量数据用x(_)±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(Dunnett-t 检验进行两两间比较)，亚组间比较采用SNK检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

为了治疗体积和轮廓异常，自体脂肪移植是常用的整形美容和治疗重建手术方法^[21]，该方法首先由Neuer^[22]在1893年发明并随后由Bruning^[23]在1911年中修改以用于可注射形式，已经成为用于美容和重建目的的软组织增强的完善技术。有研究表明，大约80%的整形外科医生在职业生涯中进行过脂肪移植手术^[24]，包括面部轮廓填充、隆胸以及辐射损伤、乳房包膜挛缩、先天或创伤后畸形及烧伤的治疗^[25]。自体脂肪移植术临床使用如此之频繁，使得整形外科医生们对其要求也越发精益求精，其术后低而不稳定的体积留存问题亟待解决。

最流行解决方法之一是在初次手术期间的过度矫正，有时还会进行多次重复手术以进行移植区脂肪容量矫正^[26]。然而除了患者需要承担多次手术带来的经济负担，这些额外的手术还有进一步增加移植物感染和移植失败的风险，Eto 等^[27]及其同事发现，移植后的脂肪组织成活机制可按所处区域位置分为3种：①外部300 μm形成的周边区域脂肪细胞通过血浆渗透吸收营养存活；②最中心的位置脂肪细胞和祖细胞大概率死亡；③在上述区域中间，脂肪细胞仍然死亡，但脂肪来源的干细胞能够存活和再生。过度矫正会增加脂肪移植物的中心坏死量。此外，重复的手术与周围血液供应的损害和随后的移植物坏死有关。其他更具体的解决办法，如采用低压抽吸无创收获脂肪移植物^[28]、避免与室内空气接触增加移植物存活机会^[29]、清洗移植物去除炎症介质来降低再吸收率等^[30]，都是通过完善移植技术增加移植物体积留存。

最近的研究发现，在游离的脂肪移植物中，细胞凋亡伴随坏死是造成长期体积减少的原因^[31]。在抽吸法获得的脂肪移植物中，大约有1%的细胞显示坏死迹象，20%的细胞显示凋亡^[32]。在一项脂肪收获技术的研究中，运用自由基清除剂辅酶Q10处理可降低甚至抑制脂肪细胞凋亡从而增加长期移植物留存体积^[33]。

以上不同实验研究结论表明，脂肪移植收获技术将直接影响移植物细胞凋亡率，参与决定移植脂肪体积留存。

运用Coleman技术时，脂肪细胞在各个环节中均会受到机械力的作用，例如收获脂肪时的抽吸负压和套针侧壁剪切力、脂肪加工时的离心力、脂肪注射过程的针管正压等。临床在运用Coleman技术时的一些争论观点，某种程度上说，即是在探究不同外力对脂肪移植物的影响，如吸脂机负压抽吸还是注射器负压抽吸^[34]？离心转速选择3 000 r/min^[35]？ 1 500 r/min^[36]？亦或是不离心采用静置悬浮法处理^[37]？注射时使用多大直径的注射器以多快的速度推注？

实验针对抽吸时套针侧壁对脂肪细胞的剪切力进行模拟研究，给予脂肪组织不同的机械剪切次数模拟抽吸过程中的套管侧壁的不同剪切力，观察移植后脂肪细胞凋亡情况变化，探究了剪切力这一变量因素对术后脂肪移植物留存体积的影响，同时探究了移植术后早期，抗凋亡药物的运用对长期脂肪体积留存的作用。

实验方法上，通过Ⅰ型胶原酶消化脂肪标本获得脂肪细胞单悬液，行流式细胞仪凋亡检测，研究表明，使用的胶原酶不会破坏细胞膜从而产生脂肪凋亡的假阳性结果^[32]。

大鼠自体脂肪组织移植后，实验记录和分析了相应各时间段标本脂肪细胞凋亡状况及相应的留存体积，结果表明，在移植后即时、1周时，各亚组细胞凋亡比例差异较明显，其中按凋亡细胞比例从大到小排列各组依次：机械剪切组>对照组>依达拉奉组(0.2%或0.1%浓度)，这与移植后4周时各亚组脂肪组织标本体积留存的结果、苏木精-伊红染色结果是一致的。相同时间节点，机械剪切组标本留存体积与剪切次数成反相关；一定浓度范围内(≤0.2%浓度)，留存体积与依达拉奉浓度成正相关。

在术后4，8周时，流式测试结果显示脂肪细胞凋亡比例几乎无变化且很低几乎可忽略不计，这表明手术操作创伤及血管未建立时的氧化应激状态引起的脂肪移植物凋亡的作用时间窗在术后即时到4周内，提示通过抗凋亡作用提高脂肪细胞体积留存应在术后4周内。该实验中，使用不同浓度抗凋亡药物依达拉奉1 mL在脂肪组织收获注射浸泡 5 min，旨在机械力损伤前能预防性保护脂肪细胞，术后8周时，0.2%依达拉奉组相比对照组留存体积增加了约16%，这与Wang等^[32]得出的脂肪移植后约20%的细胞显示凋亡这一结果是一致的，对临床使用依达拉奉进行抗凋亡具有一定的指导作用。

以上实验结果对临床规范手术操作及术前供区脂肪局部使用依达拉奉预防性治疗细胞凋亡具有一定的指导作用，但是另一方面，实验尚有局限性，第一，实验中对移植物标本体积的测量未能使用更精确更有说服力的方法和仪器；第二，术后4周时，细胞凋亡检测可见凋亡比例大幅度减少至可忽略不计，故未能解释术后4，8周时体积变化原因；第三，对实验组的变量设计时，未能排除变量存在时间的影响影响。

对自体脂肪组织移植后抗凋亡治疗从而提高移植后脂肪组织体积留存率尚且处于实验探索阶段，进一步实验将定量测定凋亡脂肪细胞体积及抗凋亡药物的作用大小，对探索和提供一条新的提升术后移植物体积存活率的途径十分必要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

影响大鼠自体脂肪组织移植后留存体积的变量因素

Variables affecting the retained volume of adipose tissue after transplantation in rats

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[1]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[2]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[3]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[4]	刘立华, 孙伟, 王云亭, 高福强, 程立明, 李子荣, 王江宁. 头颈部开窗减压治疗L1型激素性股骨头坏死：单中心前瞻性临床研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 906-911.
[5]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[6]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[7]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[8]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[9]	蒋欣, 乔良伟, 孙东, 李明, 房军, 曲青山. 肾移植患者血清中长链非编码RNA PGM5-AS1表达及调控人肾小球内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 741-745.
[10]	杨鑫, 金喆, 冯旭, 卢兵. 沈阳市居民对器官、眼组织及遗体捐献的认知及意愿调查[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 779-784.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	曾祥洪, 梁博伟. 股骨头坏死保髋治疗的新策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 431-437.
[13]	阮光萍, 姚翔, 刘高米洋, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 王金祥, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗树鼩创伤性全身炎症反应综合征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3994-4000.
[14]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[15]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.