整合素αvβ6与纤连蛋白相互作用的力调控机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1949

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (34): 5462-5467.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1949

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整合素α_vβ₆与纤连蛋白相互作用的力调控机制

杨碧珊，李娜，李趣欢

华南理工大学生命科学与工程学院，广东省广州市 510006

收稿日期:2019-06-19 出版日期:2019-12-08 发布日期:2019-12-08
通讯作者: 李趣欢，博士，副教授，华南理工大学生命科学与工程学院，广东省广州市 510006
作者简介:杨碧珊，女，1993年生，广东省罗定市人，汉族，华南理工大学在读硕士，主要从事生物力学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31870928，31200705)，项目负责人：李趣欢；国家自然科学基金(11432006)，项目参与者：李趣欢；华南理工大学中央高校基本科研业务费(2017MS098)，项目负责人：李趣欢；华南理工大学中央高校基本科研业务费(2017MS106)，项目参与者：李趣欢

Force-dependent mechanism of interaction between fibronectin and α_vβ₆

Yang Bishan, Li Na, Li Quhuan

School of Bioscience and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2019-06-19 Online:2019-12-08 Published:2019-12-08
Contact: Li Quhuan, MD, Associate professor, School of Bioscience and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Yang Bishan, Master candidate, School of Bioscience and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31870928, 31200705 (project manager: LQH); the National Natural Science Foundation of China, No.11432006 (project participant: LQH); the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2017MS098, 2017MS106 (both to LQH)

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

整合素α_vβ₆：是由α_v链和β₆链构成的异源二聚体跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞质区，能与纤连蛋白上的RGD环(由氨酸-甘氨酸-天冬氨酸3个氨基酸组成)结合，介导细胞的黏附迁移。整合素α_vβ₆在正常的上皮细胞上不表达或者表达量较低，但是在胚胎发育、组织修复和癌症恶性发展时，整合素α_vβ₆表达量上调。

纤连蛋白：是一种高分子质量约440 kD的细胞外基质糖蛋白，能与多种细胞外基质蛋白结合，与膜蛋白整合素α_vβ₆结合介导多种肿瘤细胞的黏附。

背景：整合素α_vβ₆在多种肿瘤细胞上高表达，能促进肿瘤细胞的异常增殖和恶性转移。整合素α_vβ₆通过与配体纤连蛋白的相互作用介导了肿瘤细胞的黏附与迁移，该过程不仅受到整合素α_vβ₆与纤维蛋白相互作用强弱的影响，也受到血流环境下剪应力的调节。因此，揭示整合素α_vβ₆和纤连蛋白相互作用的力-化学调控机制具有重要的理论意义和应用价值。

目的：通过定量化力条件下整合素α_vβ₆与纤连蛋白的相互作用，揭示蕴含在黏附现象背后的力调控机制。

方法：在不同剪切力下，驱使包被纤连蛋白RGD片段的微球在铺有整合素α_vβ₆的底板上黏附，观察和记录该黏附现象，获取黏附微球的瞬时速度和累积距离随时间变化的曲线，提取生存时间和解离速率参数。

结果与结论：整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段相互作用存在流动增强型现象，随着流体剪切力的增加，两者相互作用的键生存时间出现先增加后减少趋势。相反，随流体剪切力的增加，键解离速率出现先减小后增加趋势。该力依赖的生存时间和逆反应速率的双态性表明，整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段介导的流动增强型现象是由逆锁键所调控的。

ORCID: 0000-0002-5190-7724(杨碧珊)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 整合素α_vβ₆, 纤连蛋白, 平行平板流动腔, 流体剪切力, 生存时间, 解离速率, 逆锁键, 黏附

Abstract:

BACKGROUND: Integrin α_vβ₆ is highly expressed on cancer cells and promotes abnormal proliferation and malignant metastasis of cancer cells. Integrin α_vβ₆ mediates the adhesion and migration of tumor cells through interacting with its ligand, fibronectin. This process is not only regulated by the interaction between integrin α_vβ₆ and fibronectin, but also adjusted by shear stress under blood flow. Therefore, it is significant to study the force-chemical mechanism of integrin α_vβ₆-fibronectin interaction. It will further our understanding of the process of malignant metastasis, and benefit the design of novel α_vβ₆-targeted drugs.

OBJECTIVE: To reveal the force-regulated mechanism of cell adhesion, interaction between integrin α_vβ₆ and fibronectin was quantified under fluid shear stress.

METHODS: The adhesive behaviors of microspheres coated with RGD fibronectin fragment on the integrin α_vβ₆-coated substrate under different shear forces were observed and recorded. To study the mechanism of integrin α_vβ₆ interacting with fibronectin, the lifetime and dissociation rate of integrin αvβ6-fibronectin bond were extracted from the instantaneous velocity-time and cumulative distance-time graphs.

RESULTS AND CONCLUSION: Flow-enhanced phenomenon of integrin α_vβ₆ interacting with fibronectin fragments was observed. Bond lifetime of integrin α_vβ₆-fibronectin increased first and then decreased as fluid shear force increased, while the bond dissociation rate decreased first and then increased. As the fluid shear force increased, the bond dissociation rate decreased first and then increased. The force-dependent lifetime and dissociation rate of integrin α_vβ₆-fibronectin bond showed that the flow-enhanced adhesion phenomenon was regulated by catch-bond mechanism.

中图分类号:

R318.08','1');return false;" target="_blank">
R318.08

R459.9

R-331

引用本文

杨碧珊，李娜，李趣欢. 整合素α_vβ₆与纤连蛋白相互作用的力调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(34): 5462-5467.

Yang Bishan, Li Na, Li Quhuan. Force-dependent mechanism of interaction between fibronectin and α_vβ₆[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(34): 5462-5467.

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图/表（结果） 3

2.1 整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段相互作用的特异性  为了检测裹有纤连蛋白片段的微球在底板上的黏附是否为特异性黏附作用，控制剪切力为3 μN/cm²，使包被纤连蛋白片段的微球流经3种不同的流动腔底板，分别为：PBS、牛血清蛋白和牛血清蛋白+整合素α_vβ₆，其中牛血清蛋白浓度为2%，整合素α_vβ₆的质量浓度为10 mg/L。

用显微镜观察并使用高速摄像机以100帧的速度记录微球在底板上的黏附行为，离线用IPP进行图形回放分析，计算黏附微球数与流经相同视窗的总微球数的比率，即黏附比率。由图2可见，在只经过PBS处理的底板上，较多微球发生黏附，其黏附比率为(6.0±1.7)%。在经过2%牛血清蛋白处理的底板上，发生黏附的微球比率明显下降，下降至(1.2±0.4)%，说明2%牛血清蛋白阻断了微球在底板上的非特异性黏附。当包被纤连蛋白片段的微球在经过2%牛血清蛋白处理的整合素α_vβ₆铺展的基质上时，黏附事件数相较于牛血清蛋白对照组明显增加，其黏附比率为(6.7±0.8)%，表明在使用2%牛血清蛋白阻断非特异性黏附的条件下，微球在铺有整合素α_vβ₆的底板上黏附是由整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段的特异性相互作用。

2.2 整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段的键生存时间呈力依赖的双态性由以上实验可知，微球在底板上的黏附行为是由整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段所介导的。在特异相互作用下，将根据瞬时速度图和累积位移图通过t₂-t₁测定整合素α_vβ₆-纤连蛋白片段分子对的键生存时间。当底板上整合素α_vβ₆的密度足够低的情况下，微球在底板上的停留时间是由微球上的纤连蛋白片段与底板上的整合素α_vβ₆成单键所致，因此，计算微球在底板上的停留时间即能提取整合素α_vβ₆-纤连蛋白片段的键生存时间。

为了探究整合素α_vβ₆-纤连蛋白片段的键生存时间与剪切力的关系，控制剪切力大小为1，2，3，5，7 μN/cm²，将裹有纤连蛋白片段的微球灌注于铺有10 mg/L 整合素α_vβ₆的基质底板中，使微球在流动腔腔体中流动，观察和记录微球在底板上的黏附行为，见图3A。从瞬时速度-时间图和累积距离-时间图提取生存时间，见图3B，C。由图可见随着流体剪切力的增加，整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段相互作用的键生存时间先增加后减少，见图3D，其峰值为剪切力3 μN/cm²。

2.3 整合素αvβ6与纤连蛋白片段的键解离速率分析研究假设微球上纤连蛋白片段与底板上整合素α_vβ₆成键为单键，因此微球与底板解离服从一级解离动力学模型，由此模型可知，ln(C)=-k_offt，其中，C为复合物的个数，k_off为键解离速率，t为键生存时间。在图4中，根据一级解离动力学模型，以键生存时间作为横坐标，对应大于等于该生存时间的微球数的自然对数为纵坐标，作出散点图并进行线性拟合，直线的负斜率即为键解离速率。由图4A，B可见，随着剪切力从1 μN /cm²提高至3 μN/cm²，线性拟合的负斜率下降；随着剪切力从3 μN/cm²提高至7 μN /cm²，负斜率上升。通过拟合直线的斜率，提取出每个剪切力下整合素α_vβ₆-纤连蛋白片段的键解离速率koff，发现随着剪切力的增加，整合素α_vβ₆-纤连蛋白片段的键解离速率koff呈先下降后增加的趋势，见图4C，与键生存时间趋势相反，但具有相同的剪切力最低点3 μN/cm²。进一步采用逆反应速率常数的方法计算键的生存时间，结果表明通过2种不同的计算方法得到的键生存时间基本一致，见图4D，即从瞬时速率曲线中t₂-t₁方法及键解离速率的倒数方法。该结果进一步证明该单键黏附过程服从一级解离动力学模型。

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引言

整合素α_vβ₆是一条由α_v链与β₆链形成的异二聚体跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞质区^[1-2]。整合素α_vβ₆在正常上皮细胞上不表达或者表达量较低，但是在胚胎发育、组织修复和癌症恶性发展时，整合素α_vβ₆表达量上调^[3-4]。α_v链可与β₁、β₃、β₅、β₆和β₈构成异二聚体^[5]，其被证实能促进肿瘤部位的血管生成^[6]。大量体内和体外研究发现，整合素α_vβ₆与癌症的发生和发展有着密切联系，在乳腺癌等多种癌症中能检测到其表达的增加^[7-10]。另外，α_vβ₆表达上调与癌症差的预后有关，其可能与α_vβ₆能加强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有关。整合素α_vβ₆对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响，使其成为评估肿瘤转移潜能的生物标志物^[11-13]。水动力环境下，肿瘤细胞在血管壁表面的内皮细胞上黏附和迁移，是肿瘤转移的关键事件。实际上，肿瘤转移是一个多步骤、多途径、多阶段、涉及多基因变化的一系列复杂过程^[14-16]。整合素α_vβ₆作为整合素家族中的一员，具有整合素的一般特征，即介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用，从而介导细胞的的黏附迁移行为。因整合素α_vβ₆高表达于许多肿瘤细胞，并调控肿瘤细胞的迁移和侵袭等行为^[17-19]，当有效阻断整合素α_vβ₆分子时，肿瘤生长和肿瘤转移能得到有效抑制^[20]，这使得整合素α_vβ₆成为治疗多种肿瘤的靶标之一。

在整合素α_vβ₆的众多配体中，纤连蛋白是其中一个重要配体，整合素α_vβ₆通过与纤连蛋白相互作用促进肿瘤细胞的迁移，该过程通过激活各种信号通路影响肿瘤的侵袭和转移^[21-23]。纤连蛋白是细胞外基质的一个重要的组成蛋白，由3种重复片段组成，位于第3种重复片段的RGD结构域(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域)，是与多种整合素相互作用并介导正常细胞或者肿瘤细胞在细胞外基质上黏附迁移的活性部位^[24]。

至此发现整合素α_vβ₆与重要配体纤连蛋白的相互作用，在肿瘤的发生发展和侵袭迁移中具有重要作用，此外在血流环境下，该相互作用的发生受到流体剪应力的调节。因此，了解整合素α_vβ₆和纤连蛋白相互作用的力调控机制研究，对于了解各种肿瘤的发生发展过程，以及设计新型抗肿瘤药物等具有重要意义^[25]。在流体剪切力下，癌细胞在血管壁内皮细胞上的黏附和迁移受到力的调控。已有研究表明，许多整合素与其配体的相互作用存在力依赖的流动增强型现象^[26-29]。那么，整合素α_vβ₆和纤连蛋白的相互作用是否也存在这样的现象？

有鉴于此，此次研究在力的条件下研究整合素α_vβ₆和纤连蛋白相互作用，通过在铺有整合素α_vβ₆的底板上灌注包裹有纤连蛋白1 266-1 908片段(含有RGD片段)的微球，使之在不同的剪切力下黏附，观察和提取其相互作用键的生存时间和键解离速率，以期研究该相互作用介导的现象及揭示蕴含在其中的力调控机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点  实验于2017年9月至2019年2月在华南理工大学生物科学与工程学院进行。

1.3 材料  纤连蛋白片段(R&D system公司，美国)；整合素α_vβ₆(R&D system公司，美国)；不含钙、镁离子HBSS (Gibco，美国)；PBS (Gibco，美国)；牛血清蛋白(Sigma公司，美国)；直径为6 μm的微球(Polysciences，美国)，货号：Catalog No. 07312，此产品微球是单分散的聚苯乙烯微球，这些微球含有来自硫酸酯的轻微阴离子电荷，适合用于进行蛋白被动吸附，平均直径在6 μm，方差系数CV为10%，微球包装在25 g/L固体水悬浮液中，最终制剂中含有极少量的表面活性剂。

1.4 实验方法

1.4.1 在微球上包被纤连蛋白分子将含有1×10⁸个半径为3 μm的微球溶液置于离心管中，用PBS洗3次，加入   100 mg/L的纤连蛋白片段10 μL，并使用垂直旋转仪旋转离心管2 h，使微球与纤连蛋白片段充分混匀。为了使纤连蛋白片段分子充分吸附于微球表面，将含有微球与纤连蛋白片段的溶液于4 ℃冰箱中放置过夜。为了除去微球与底板的非特异性黏附，将1 mL含有2%牛血清蛋白的PBS加入含有微球的离心管中，并使用垂直旋转仪旋转离心管 30 min，再使用离心机2 000 r/min离心3 min，去除上清，加入1 mL含有2%牛血清蛋白的PBS，使溶液中微球的终浓度为0.5×10⁸ L^-1。

1.4.2 用整合素α_vβ₆功能化流动腔底板为了将整合素α_vβ₆蛋白分子铺在培养皿表面，用镊子夹取防水硅胶圈(工作区域大小为5 mm×5 mm)，将其固定在35 mm的细胞培养皿的中央，并用镊子尾部轻轻刮实垫圈，排除垫圈中的气泡。在培养皿外底部，用黑色签字笔对准垫圈的挖空部分，做上标记示意铺有分子的区域。用PBS将整合素α_vβ₆蛋白分子从其储存质量浓度(100 mg/L)稀释至10 mg/L，将40 μL整合素α_vβ₆蛋白分子滴于培养皿垫圈中央，置4 ℃冰箱中孵育过夜。为了除去非特异性黏附，将过夜孵育后的底板上多余的液体去除并抽出垫圈，使用含有2%牛血清蛋白的PBS洗3次，再吸取800 μL含2%牛血清蛋白的PBS铺于底板上，室温孵育30 min。

1.4.3 平行平板流动腔实验流动腔腔体和功能化的底板按图1组装，在不同的剪切力下将微球灌注到流动腔腔体中，观察和记录微球在底板上的黏附行为。为了提取微球上的纤连蛋白片段与整合素α_vβ₆分子的生存时间，使用Image Pro Plus(IPP)软件追踪微球在底板上的运动轨迹，获取瞬时速度和累计距离随时间变化的曲线，并根据瞬时速度-时间图和累积距离-时间图提取出微球在底板上的停留时间。在底板整合素α_vβ₆密度较低的情况下，微球上的纤连蛋白分子与底板上的整合素α_vβ₆分子形成单键，介导微球短暂停留，该停留时间即是整合素α_vβ₆与纤维蛋白片段成键的生存时间。

1.5 主要观察指标  微球在底板上的黏附比率。

1.6 统计学分析每个实验重复进行3次，采用Student-t检验对两组独立实验进行统计学差异检验。P < 0.05说明两独立组差异有显著性意义，P < 0.01表示两独立组差异有非常显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

因整合素α_vβ₆的表达水平在多种肿瘤中上调，并且整合素α_vβ₆的表达与患者的存活时间密切相关，使之成为多种肿瘤的预后指标^[32]。另外，整合素α_vβ₆与其配体纤连蛋白的相互作用，是整合素α_vβ₆行使其功能的重要生理病理基础。而且在整合素α_vβ₆介导肿瘤细胞迁移的过程中，其相互作用是在流体环境下发生的，受力的调控，因此研究力条件下整合素α_vβ₆与其配体纤连蛋白的相互作用的力-化学耦合的机制，对于深入了解肿瘤的发生发展具有重要的意义。此次研究通过功能化微球和流动腔底板，驱使微球在整合素α_vβ₆与其配体纤连蛋白介导下黏附，提取不同的流体剪应力下微球在底板的停留时间，从而计算出整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段的键生存时间和键解离速率。实验结果表明随着流体剪应力的增加，纤连蛋白片段与整合素α_vβ₆的键生存时间先增加后减小，表现出从“逆锁键”向“滑移键”转换的双态性。在此研究之前，已有研究证明了许多整合素与其配体也表现出了这种双态性，如α₅β₁、α_Lβ₂、α₄β₁和α_Mβ₂^[26-29]。此外，在其他细胞表面分子对也观察到此现象，如选择素与其配体P-选择素糖蛋白配体1^[30-31]、肌动蛋白/肌浆球蛋白^[32]、FimH/糖配体^[33]、GPIbα/vWF^[34]。逆锁键的存在能防止细胞在低剪切力条件下黏附，保证细胞在特定的最佳剪切力下行使其黏附功能，这样可以高效地调控细胞分布。因此，此次研究首次发现整合素α_vβ₆与其配体纤连蛋白的相互作用也存在流动增强型黏附现象并由逆锁键所调控。

值得注意的是，此次研究局限之一在于未深入探究整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段所表现出的力依赖双态性分子结构基础，但从现有研究报道可以推测，构象改变也许是解释逆锁键产生的机制。已有研究表明，力通过破坏铰链中的氢键增加了L-选择的柔性，导致配体在结合界面上滑动并增加重新结合的机会，从而增长生存时间^[35]。另外，也许逆锁键产生的力学机制是力有助于分子构象的延伸，从而形成高亲和力构象并增加键的生存时间^{[36- 37]}。此次研究的局限之二在于所使用的纤连蛋白分子不是全长的纤连蛋白，而是含有RGD结构域的纤连蛋白片段，从而模拟经过酶解后的纤连蛋白与整合素α_vβ₆的相互作用。已有研究表明，表达β₆的肿瘤细胞在基金金属蛋白酶9酶解后的纤连蛋白片段上迁移，相比于在全长的纤连蛋白上更容易^[38]。因此，实验探究整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段的相互作用还需要做更多的探索。

至此，实验在体外采用平行平板流动腔技术研究整合素α_vβ₆与纤连蛋白片段相互作用介导的微球的滚动行为，通过定量化该相互作用，观察到了力调控的流动增强型现象，并揭示了由逆锁键调控的机制。该结果对于了解各种由整合素α_vβ₆介导的肿瘤的侵袭和转移过程，相应设计以整合素α_vβ₆为靶标的新型抗肿瘤药物等具有重要意义。
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文题释义：

整合素α_vβ₆：是由α_v链和β₆链构成的异源二聚体跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞质区，能与纤连蛋白上的RGD环(由氨酸-甘氨酸-天冬氨酸3个氨基酸组成)结合，介导细胞的黏附迁移。整合素α_vβ₆在正常的上皮细胞上不表达或者表达量较低，但是在胚胎发育、组织修复和癌症恶性发展时，整合素α_vβ₆表达量上调。

纤连蛋白：是一种高分子质量约440 kD的细胞外基质糖蛋白，能与多种细胞外基质蛋白结合，与膜蛋白整合素α_vβ₆结合介导多种肿瘤细胞的黏附。
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延伸阅读

实验主要使用平行平板流动腔平台，使用6 μm的微球模拟细胞在血管上滚动粘附，在不同剪切力下研究整合素α_vβ₆-F3的力调控机制。在不同剪切力下将包被F3的微球灌注到铺有α_vβ₆的流动腔内，使用摄像机将微球的粘附行为记录。接着计算整合素α_vβ₆- F3的键生存时间和键解离速率，发现随着剪切力的增加，整合素α_vβ₆- F3的键生存时间先增加、后减小，呈现力依赖的双态性。随着力的增加，其键呈现由“逆锁键”向“滑移键”转换的现象。整合素α_vβ₆是肿瘤研究的热点分子，其与肿瘤的发生和发展密切相关，研究整合素α_vβ₆与纤连蛋白纤连蛋白作用对于了解肿瘤的发生和发展，设计靶向整合素α_vβ₆的肿瘤治疗策略有重要意义。
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Force-dependent mechanism of interaction between fibronectin and α_vβ₆

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