叶黄素通过PI3K/AKT信号通路调控胃癌干细胞增殖与凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1810

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
叶黄素：具有抗氧化、提高免疫力、延缓衰老和抗肿瘤等生物活性。多项研究表明，叶黄素可抑制乳腺癌、口腔上皮癌、食管癌、胃癌、肝癌、宫颈癌和前列腺癌等肿瘤细胞的增殖，也可诱导宫颈癌和前列腺癌细胞的凋亡。还有研究证实，叶黄素具有预防肿瘤发生的作用，提高机体免疫力。
胃癌干细胞：是存在于胃癌组织中具有异质性、自我更新及不对称分裂能力的肿瘤干细胞，其分化潜能与胚胎干细胞相似。胃癌干细胞不仅是胃部肿瘤的细胞起源，还与胃癌的侵袭、转移、复发和耐药密切相关。针对胃癌干细胞的靶向治疗研究将为胃癌的治疗提供新思路。

摘要
背景：叶黄素可抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进凋亡，但其对胃癌干细胞增殖与凋亡的影响及机制尚未见相关报道。
目的：观察叶黄素对胃癌干细胞增殖与凋亡的影响，探讨其可能机制。
方法：体外培养人胃癌细胞株SGC-7901获得胃癌干细胞，流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD44、CD24。用0，20，40，80，160 mmol/L叶黄素分别处理人胃癌干细胞24，48，72 h，CCK-8法检测细胞增殖活性，确定最佳作用浓度和作用时间。然后，将人胃癌干细胞分为4组：对照组、80 mmol/L叶黄素组、胰岛素样生长因子1组、叶黄素+胰岛素样生长因子1组，分别干预细胞48 h，流式细胞术检测细胞凋亡，实时定量PCR检测PI3K和Akt mRNA的表达，Western blot检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达。
结果与结论：①体外培养人胃癌SGC7901细胞获得的胃癌干细胞表达CD44和CD24；②80和160 mmol /L叶黄素作用48 h对人胃癌干细胞增殖活力的抑制作用优于其他作用浓度和时间(P < 0.05)，叶黄素作用48 h的IC50为91.58 mmol/L，选取80 mmol/L叶黄素作用48 h进行后续实验；③胰岛素样生长因子1组细胞增殖活力高于其他3组，叶黄素组细胞增殖活力低于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④叶黄素组细胞凋亡率高于其他3组，胰岛素样生长因子1组细胞凋亡率低于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤叶黄素组PI3K和Akt mRNA的表达低于其他3组，胰岛素样生长因子1组PI3K和Akt mRNA的表达高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑥叶黄素组p-PI3K和p-Akt蛋白的表达低于对照组和胰岛素样生长因子1组，胰岛素样生长因子1组p-PI3K和p-Akt蛋白表达高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑦结果提示，叶黄素通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制人胃癌干细胞增殖和诱导凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4408-6865(杜锐玲)

关键词: 肿瘤干细胞, 胃癌干细胞, 叶黄素, 信号通路, PI3K, Akt, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Lutein can inhibit proliferation and promote apoptosis in cancer cells of various origins. However, there are no reports on the effect and mechanism of lutein on the proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells.
OBJECTIVE: To observe the effect of lutein on proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells and explore its possible mechanism.
METHODS: Gastric cancer stem cells were obtained from human gastric cancer cell line SGC-7901 in vitro. Flow cytometry was used to identify cell surface markers CD44 and CD24. Human gastric cancer stem cells were treated with 0, 20, 40, 80, and 160 mmol/L lutein for 24, 48, and 72 hours, respectively. Cell proliferation activity was detected by cell counting kit-8 method, to determine the optimal concentration and action time of lutein. Human gastric cancer stem cells were then divided into four groups: control group, 80 mmol/L lutein group, insulin-like growth factor 1 group, lutein+insulin-like growth factor 1 group, and given the corresponding treatments for 48 hours. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. The expressions of PI3K and Akt mRNA were detected by quantitative real-time PCR, and the expressions of PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gastric cancer stem cells derived from human gastric cancer SGC7901 cells cultured in vitro expressed CD44 and CD24. (2) Lutein at 80 and 160 mmol/L acting for 48 hours could achieve the best inhibitory effect (P < 0.05). As the half maximal inhibitory concentration (IC50) of lutein for 48 hours was 91.58 mmol/L, 80 mmol/L lutein acting for 48 hours was selected for subsequent experiments. (3) The proliferation activity of the cells was highest in the insulin-like growth factor 1 group and lowest in the lutein group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). (4) The apoptotic rate was highest in the lutein group and lowest in the insulin-like growth factor 1 group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). (5) The expressions of PI3K and Akt mRNA were highest in the lutein group and lowest in the insulin-like growth factor 1 group, and there were significant differences between groups (P < 0.05). (6) The expressions of p-PI3K and p-Akt protein in the lutein group were significantly lower than those in the control group and insulin-like growth factor 1 group, while the expressions of p-PI3K and p-Akt protein in the insulin-like growth factor 1 group were significantly higher than those in the other three groups (P < 0.05). These results suggest that lutein inhibits the proliferation and induces apoptosis of human gastric cancer stem cells by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway.

Key words: tumor stem cells, gastric cancer stem cells, lutein, signaling pathway, PI3K, Akt, cell proliferation, apoptosis

中图分类号:

杜锐玲. 叶黄素通过PI3K/AKT信号通路调控胃癌干细胞增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4593-4598.

Du Ruiling. Lutein regulates proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells through PI3K/AKT signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4593-4598.

图/表（结果） 4

2.1 人胃癌干细胞的鉴定结果 流式细胞术检测结果显示，第3代人胃癌干细胞表达CD44和CD24，CD44⁺CD24⁺阳性率为66.3%，见图1。

2.2 叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞增殖活力的影响 CCK-8检测结果显示，80 mmol/L叶黄素组作用48 h和72 h，细胞增殖活力低于0，20，40 mmol/L叶黄素组(P < 0.05)；160 mmol/L叶黄素组作用24，48，72 h，细胞增殖活力低于0，20，40 mmol/L叶黄素组(P < 0.05)；40 mmol/L叶黄素组作用72 h，细胞增殖活力低于0，20 mmol/L叶黄素组(P < 0.05)，见图2A。叶黄素作用48 h的IC50为91.58 mmol/L。选取80 mmol/L叶黄素作用48 h进行后续实验。与对照组比较，叶黄素组和叶黄素+胰岛素样生长因子1组细胞增殖活力降低，胰岛素样生长因子1组细胞增殖活力升高(P < 0.05)；与叶黄素组比较，胰岛素样生长因子1组和叶黄素+胰岛素样生长因子1组细胞增殖活力升高 (P < 0.05)；与胰岛素样生长因子1组比较，叶黄素+胰岛素样生长因子1组细胞增殖活力降低(P < 0.05)，见图2B。

2.3 叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞凋亡的影响 流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，叶黄素组细胞凋亡率高于对照组(P < 0.05)；胰岛素样生长因子1组细胞凋亡率低于对照组和叶黄素组(P < 0.05)；叶黄素+胰岛素样生长因子1组细胞凋亡率高于胰岛素样生长因子1组，低于叶黄素组(P < 0.05)，见图3。结果提示，叶黄素可诱导人胃癌干细胞发生凋亡，PI3K/Akt信号通路激动剂胰岛素样生长因子1可抑制人胃癌干细胞凋亡。

2.4 叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞PI3K和Akt mRNA表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，叶黄素组PI3K和Akt mRNA的表达低于对照组(P < 0.05)；胰岛素样生长因子1组PI3K和Akt mRNA的表达高于对照组和叶黄素组(P < 0.05)；叶黄素+胰岛素样生长因子1组PI3K和Akt mRNA的表达高于叶黄素组(P < 0.05)，低于胰岛素样生长因子1组(P < 0.05)，见图4。结果提示，叶黄素可抑制人胃癌干细胞中PI3K和Akt mRNA的表达，胰岛素样生长因子1可提高人胃癌干细胞中PI3K和Akt mRNA的表达。

2.5 叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，叶黄素组p-PI3K和p-Akt蛋白的表达低于对照组(P < 0.05)；胰岛素样生长因子1组p-PI3K和p-Akt蛋白表达高于对照组和叶黄素组(P < 0.05)；叶黄素+胰岛素样生长因子1组p-PI3K和p-Akt蛋白的表达高于叶黄素组(P < 0.05)，低于胰岛素样生长因子1组(P < 0.05)；各组PI3K和Akt蛋白的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。结果提示，叶黄素可抑制人胃癌干细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，胰岛素样生长因子1可提高人胃癌干细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表达。

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引言

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，由于早期症状不明显而延误诊断，发现时多为中晚期，预后较差^[1]。尽管目前临床治疗总有效率有所提高，但患者死亡率仍未有效降低^[2]。对胃癌新的治疗途径与机制的探索仍是研究热点。研究已证实，胃癌干细胞与胃癌的耐药、转移和复发密切相关，是胃癌复发的根本原因^[3]。胃癌干细胞具有自我更新、分化和增殖特性，存在于胃肿瘤组织中，其较强的DNA修复能力可导致肿瘤的形成、复发与侵袭^[4]。以往的研究表明，化学药物或分子靶向药物治疗后，胃癌干细胞仍然存在，还会有富集现象出现。同时，体外培养的胃癌干细胞可分化为毛细血管内皮细胞和胃腺样结构，分泌促进血管新生的生长因子^[5-6]。体外实验研究发现，胃癌干细胞比胃癌细胞的侵袭与迁移能力以及对化疗药物的抵抗作用更强^[7]。因此，对胃癌干细胞自我更新信号通路和靶向治疗的研究有利于为胃癌治疗提供新的思路。

叶黄素是从叶绿素含量较高的植物中提取的一种类胡萝卜素，具有抗氧化、提高免疫细胞活性和抗肿瘤等多种生物活性。国内外多项研究表明，叶黄素可抑制乳腺癌^[8]、口腔上皮癌^[9]、食管癌^[10]、胃癌^[11]、肝癌^[12]、宫颈癌^[13]、前列腺癌等肿瘤细胞的增殖^[14]，也可诱导宫颈癌^[13]、前列腺癌^[14]、胃癌细胞的凋亡^[11]。研究证实，叶黄素通过其强抗氧化活性抑制肿瘤细胞的增殖，还可预防肿瘤的发生，同时提高人体免疫力^[8]。叶黄素通过抑制PI3K/Akt信号通路促进乳腺癌细胞凋亡^[8]。PI3K属于脂质激酶的一种，通过调控其下游各种效应分子的活化状态而发挥增殖促进与凋亡抑制作用^[15]。肿瘤属于信号通路异常疾病，PI3K/Akt通路在肿瘤的发生、发展与转化中发挥重要作用，已被认为是治疗肿瘤的新靶点。研究表明，抑制PI3K/Akt信号通路是靶向治疗胃癌及预防转移与复发的关键^[11]。阻断PI3K/Akt信号通路可抑制人胃癌干细胞的生长也已被证实^[16]。但叶黄素能否通过PI3K/Akt信号通路影响人胃癌干细胞的生长尚未有报道。因此，此研究拟探讨叶黄素在人胃癌干细胞增殖与凋亡中的作用，同时应用PI3K/Akt信号通路激动剂胰岛素样生长因子1初步阐明叶黄素作用的潜在分子机制，为胃癌的治疗提供实验参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞培养实验。

1.2 时间及地点 于2018年1至12月在四川省人民医院实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞 人胃癌SGC-7901细胞株购买于上海艾研生物科技有限公司。

1.3.2 实验试剂与仪器 叶黄素、二甲基亚砜、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素-人转铁蛋白-硒(ITS)细胞培养添加剂、B27细胞培养添加剂、碘化丙啶和核糖核酸酶(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；PI3K/Akt通路激动剂胰岛素样生长因子1 (美国Selleck Chemicals公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；兔抗人PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和β-actin抗体(美国PeproTech公司)；兔抗人CD44-PE、CD24-FITC抗体(美国Abcam公司)；CCK-8检测试剂盒(日本Dojindo公司)；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒(中国北京宝生公司)；CO₂培养箱(美国Thermo公司)；化学发光仪(美国Bio-Rad公司)；全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 胃癌干细胞的分离、培养与鉴定 将人胃癌SGC-7901细胞以150个/孔接种于一次性6孔培养板各孔内，用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮细胞生长因子、2%B27细胞培养添加剂和2%ITS细胞培养添加剂的DMEM/F12培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，隔日半量换液，待细胞富集形成细胞球后进行传代。应用流式细胞术检测细胞表面标志物CD44阳性率。取第3代胃癌干细胞制成细胞悬液，向流式专用管中加入细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液100 μL和CD44-PE、CD24-FITC及同型对照10 μL，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤1次，流式细胞仪上检测CD44⁺CD24⁺阳性细胞百分率，并应用磁珠分选方法分离CD44⁺CD24⁺阳性胃癌干细胞进行后续实验。

1.4.2 CCK-8法检测人胃癌干细胞增殖活力 为确定叶黄素的最佳作用浓度，将胃癌干细胞制成浓度为1×10⁴ L^-1的细胞悬液，接种于一次性96孔培养板各孔内，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，分别用0，20，40，80，160 mmol/L叶黄素溶液处理细胞，以只含培养液无细胞为空白对照组，二甲基亚砜组为溶剂对照组，每组设3个复孔。在干预24，48，72 h后，取出96培养孔板，每孔加入10 μL CCK-8工作液，轻柔混匀，37 ℃培养2 h，在全自动酶标仪上检测450 nm波长处各孔的吸光度值，活细胞数量越多吸光度值越大，根据公式：细胞增殖活力(%)=(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(溶剂对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%，计算各组细胞增殖活力。应用SPSS 20.0软件中Probit回归模型计算叶黄素对人胃癌干细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，确定最佳作用浓度和作用时间。

1.4.3 实验分组 确定最佳作用浓度和作用时间后，根据细胞干预药物不同，分为4组：①对照组：胃癌干细胞不加药物处理；②叶黄素组：用80 mmol/L叶黄素溶液处理胃癌干细胞48 h；③胰岛素样生长因子1组：用100 μg/L胰岛素样生长因子1处理胃癌干细胞48 h；④叶黄素+胰岛素样生长因子1组：用80 mmol/L叶黄素溶液和100 μg/L胰岛素样生长因子1共同处理胃癌干细胞48 h。

1.4.4 CCK-8法检测叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞增殖活力的影响 将各组胃癌干细胞制成细胞浓度为1×10⁴ L^-1的细胞悬液，接种于一次性96孔培养板各孔内，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，以只含培养液无细胞为空白对照组，二甲基亚砜组为溶剂对照组，每组设3个复孔。在干预48 h后，取出96培养孔板，每孔加入10 μL CCK-8工作液，轻柔混匀，37 ℃培养2 h，在全自动酶标仪上检测450 nm波长处各孔的吸光度值，计算细胞增殖活力。

1.4.5 流式细胞术检测叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞凋亡的影响 将各组胃癌干细胞制成细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，接种于一次性培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。干预48 h后收集细胞，1 500 r/min离心5 min，PBS漂洗，体积分数为70%乙醇4 ℃固定12 h，PBS漂洗，1 000 r/min离心5 min，用PBS重悬细胞放入流式专用管，每管内加入0.5 mL碘化丙啶工作液，37 ℃避光孵育15 min，在流式细胞仪488 nm波长处检测凋亡细胞百分率。上述实验重复3次。

1.4.6 RT-qPCR检测各组人胃癌干细胞PI3K和Akt mRNA的表达 在干预48 h后收集胃癌干细胞，用Trizol裂解细胞，提取总RNA并鉴定质量，选择提取质量良好的RNA应用反转录试剂盒获得cDNA；按照SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒说明书的操作步骤，以PI3K和Akt为引物，β-actin为内参，用20 μL反应体系在实时定量PCR仪上进行相对定量检测。上述实验重复3次。引物序列见表1。

1.4.7 Western blot检测各组人胃癌干细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达 在干预48 h后收集胃癌干细胞，用细胞裂解液4 ℃裂解细胞10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，煮沸法将各组蛋白变性，调整浓度进行10% SDS-PAGE电泳、转膜、2%脱脂牛奶室温封闭30 min，加入兔抗人PI3K (1∶500)、p-PI3K(1∶300)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶200)和β-actin(1∶2 000)多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，次日加入特异性IgG(1∶1 000)室温孵育1 h，加入化学发光液孵育5 min，在化学发光仪中显影，用Quantiy One软件测量条带灰度进行半定量分析。

1.5 主要观察指标 ①人胃癌干细胞增殖活力；②人胃癌干细胞凋亡率；③人胃癌干细胞PI3K和Akt mRNA的表达；④人胃癌干细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达。

1.6 统计学分析 应用GraphPad Prism 6.0软件对实验数据进行统计分析和绘图，数据采用x(_)±s表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胃癌干细胞的研究为探讨胃癌的发病机制及治疗提供了新思路^[17]。近年来，有关胃癌干细胞的自我更新和化疗抵抗机制以及miRNA表达谱的研究取得较大进展，但应用不良反应小的植物提取物有效抑制胃癌干细胞增殖的信号通路研究有限^[18]。该研究在体外无血清培养人胃癌SGC7901细胞株获得胃癌干细胞并应用不同浓度叶黄素进行干预，结果证实叶黄素可抑制人胃癌干细胞的增殖并诱导该细胞发生凋亡，具有一定的剂量和时间依赖性。

以往的研究发现，对胃癌干细胞的评价标准不统一会导致实验结果不一致，影响实验研究的可信度，也阻碍了对胃癌干细胞深入研究的发展^[19-20]。人胃癌干细胞的鉴定与其他肿瘤干细胞相同，应用流式细胞术鉴定细胞表面的标志物^[21]。CD44是第一个被发现的实体肿瘤干细胞表面标志物，随后被证实其在胃癌干细胞等多种肿瘤干细胞中均有表达^[22]。CD44是一种通过介导癌细胞迁移和黏附的独特黏附分子，通过增强肿瘤细胞的侵袭能力，促进肿瘤的形成与增殖^[23]。CD24是一种与糖基磷脂酰肌醇锚定有关的重要膜蛋白，与自身免疫性疾病和肿瘤密切相关，还可作为判断多种细胞成熟与否的标志^[24]。近年来，有学者从胃癌患者切除的肿瘤组织中分离出CD44⁺和CD24⁺细胞，并对2种细胞的自我更新与分化能力和成瘤性进行比较，发现CD44⁺/CD24⁺均能用作检测人胃癌干细胞的表面标记物^[25]。此研究应用流式细胞术从亲本细胞中分选CD44⁺CD24⁺细胞，阳性率为66.3%，得到纯度较好的人胃癌干细胞进行后续实验。

为了确认叶黄素对人胃癌干细胞的增殖有影响和确定最佳作用时间与浓度，此研究应用CCK-8细胞增殖检测法观察叶黄素对人胃癌干细胞增殖活力的影响。结果显示，在相同浓度叶黄素干预下，随着叶黄素干预时间延长，人胃癌干细胞的增殖活力逐渐降低；40 mmol/L的叶黄素在干预72 h后才发挥增殖抑制作用，80 mmol/L的叶黄素在干预48 h后发挥抑制作用；虽然160 mmol/L的叶黄素在干预24 h就发挥了抑制作用，但在48 h和72 h的抑制作用并未明显强于80 mmol/L浓度组，而且作用72 h后人胃癌干细胞开始铺满培养板底。为了避免生长抑制影响实验结果，此研究选用48 h作为干预时间，计算叶黄素作用48 h的IC₅₀为91.58 mmol/L，与80 mmol/L浓度更接近，故选取80 mmol/L作为干预浓度进行研究。

细胞凋亡一直是肿瘤研究的热点^[26]，肿瘤干细胞的凋亡也受到越来越多的关注^[27]。研究发现，包括胃癌干细胞在内的肿瘤干细胞由于其自我更新能力对化合物的凋亡诱导作用并不敏感^[28]。有研究证实，植物提取物姜黄素可以诱导胃癌干细胞凋亡，主要通过下调Akt/FoxM1信号通路中的蛋白分子发挥凋亡诱导和增殖抑制作用^[29]。也有研究证实，叶黄素通过抑制PI3K信号通路发挥抗人乳腺癌增殖的作用^[30]。同时，PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中异常激活并参与胃癌的发生和发展也已被证实。此研究应用流式细胞术检测叶黄素对人胃癌干细胞凋亡的影响，与对照组比较，叶黄素可提高人胃癌干细胞的凋亡率。为了进一步观察叶黄素是否通过PI3K/Akt信号通路发挥作用，此研究应用胰岛素样生长因子1与叶黄素联合干预。流式细胞术检测结果显示，单独应用全通路激动剂胰岛素样生长因子1之后，人胃癌干细胞的凋亡率较对照组降低明显，联合应用叶黄素后，细胞凋亡率提高，但与对照组凋亡率比较没有显著性意义，可能原因是PI3K/Akt信号通路在人胃癌干细胞的增殖方面发挥重要促进作用，通路激动剂对凋亡的抑制作用强于叶黄素对凋亡的促进作用。此研究应用RT-qPCR检测结果显示，叶黄素下调了人胃癌干细胞中PI3K、Akt mRNA的表达，这种作用被胰岛素样生长因子1减弱，提示叶黄素可能通过抑制PI3K/Akt信号通路中蛋白分子的表达调控人胃癌干细胞的增殖与凋亡。Western blot结果显示，叶黄素和胰岛素样生长因子1对人胃癌干细胞中PI3K和Akt蛋白表达的调节作用差异并不明显，与RT-qPCR不一致，可能原因是蛋白的表达变化晚于mRNA的变化或者PI3K和Akt蛋白发生了磷酸化。同时实验检测了p-PI3K和p-Akt表达的变化，结果显示胰岛素样生长因子1可上调p-PI3K和p-Akt的表达，叶黄素则下调两者的表达，提示PI3K/Akt信号通路参与人胃癌干细胞的增殖与凋亡，叶黄素可通过抑制PI3K和Akt磷酸化促进胃癌干细胞凋亡。

综上所述，通过体外培养人胃癌细胞形成肿瘤细胞球后应用表面标记物CD44和CD24流式分选获得人胃癌干细胞。叶黄素干预后人胃癌干细胞的增殖活力降低而凋亡率提高，并抑制了人胃癌干细胞中PI3K和Akt的磷酸化，而PI3K/Akt信号通路激动剂则逆转了叶黄素的作用，证实了PI3K/Akt信号通路在人胃癌干细胞的增殖中发挥正调控作用，叶黄素通过此通路抑制人胃癌干细胞增殖并诱导其凋亡。由于此研究没有检测叶黄素对其他胃癌细胞系中胃癌干细胞和PI3K亚单位的影响，有一定的局限性，后续实验将深入研究叶黄素对不同胃癌细胞株来源胃癌干细胞的作用及对PI3K亚单位的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程