全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃复合材料对脂肪干细胞活性及成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1688

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 1995-2001.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1688

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全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃复合材料对脂肪干细胞活性及成骨分化的影响

罗凯，杨亚峰，马腾，夏冰，黄亮亮，黄景辉，罗卓荆

空军军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032

修回日期:2019-01-09 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 罗卓荆，教授，主任医师，空军军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032
作者简介:罗凯，男，1987年生，山西省晋中市人，汉族，空军军医大学在读硕士，主要从事脊柱外科及生物材料的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81672148)，项目负责人：黄景辉

Effects of perfluorotributylamine/alginate/bioglass biomaterials on viability and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells

Luo Kai, Yang Yafeng, Ma Teng, Xia Bing, Huang Liangliang, Huang Jinghui, Luo Zhuojing

Department of Orthopedics, Xijing Hospital, Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2019-01-09 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Luo Zhuojing, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, Xijing Hospital, Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Luo Kai, Master candidate, Department of Orthopedics, Xijing Hospital, Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81672148 (to HJH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
携氧组织工程材料：利用组织工程技术，将具有氧释放功能的材料复合于组织工程材料中，用于解决移植后材料内部缺氧导致的一系列问题。目前携氧材料被广泛应用于基础研究，具有氧释放功能的材料包括过氧化物、血红蛋白氧载体和全氟化合物等。
全氟碳化合物：是一种烃分子中的所有氢原子被氟原子取代而形成的有机化合物。由于全氟碳化合物的特殊结构，其具有高氧溶解性，而这一特性使其被广泛应用于生物医学领域。近年来，随着组织工程学的发展和人们对组织修复中氧作用的更深入理解，全氟碳化合物作为一种有效的携氧材料被应用在各种组织工程学研究中。全氟三丁胺是全氟碳化合物的一种。

摘要
背景：缺氧环境导致骨组织工程材料体内应用受限，构建一种携氧骨组织工程材料有望解决缺氧问题。
目的：构建一种含有携氧材料全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，探讨其在体外缺氧条件下对脂肪干细胞增殖、黏附及成骨分化的影响。
方法：制备含有0%，5%，10%，20%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料，测定含有不同体积分数全氟三丁胺材料的氧释放曲线和细胞毒性。在缺氧条件下，将兔脂肪干细胞种植于含有不同体积分数全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料中，比较脂肪干细胞的增殖情况，筛选全氟三丁胺的最优体积分数。将脂肪干细胞接种于含最优体积分数全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料上，检测细胞在常氧及缺氧条件下的黏附能力、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因的表达。
结果与结论：①在缺氧条件下，10%全氟三丁胺组细胞增殖显著高于5%全氟三丁胺组及空白对照组(P < 0.05)；②在缺氧条件下，10%全氟三丁胺材料组细胞的黏附状态良好，黏附斑平均吸光度值显著高于缺氧对照组(P < 0.05)；③在缺氧条件下成骨诱导培养7 d，10%全氟三丁胺组细胞的碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达显著高于缺氧对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，含有10%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料，在缺氧条件下可促进兔脂肪干细胞增殖、黏附及成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5749-0149(罗凯)

关键词: 脂肪干细胞, 生物玻璃, 全氟三丁胺, 藻酸盐, 缺氧, 细胞增殖, 细胞黏附, 成骨分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Under hypoxia, the in vivo application of bone tissue engineering materials is limited. To solve the problem of hypoxia, an oxygen-carrying bone tissue engineering material is required.
OBJECTIVE: To prepare an alginate/bioactive glass scaffold with optimal perfluorotributylamine concentration and to explore the effect of the composite scaffold on in vitro proliferation and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells under hypoxia.
METHODS: Alginate/bioactive glass biomaterials containing 0% (control), 5%, 10%, and 20% perfluorotributylamine were prepared to measure oxygen-releasing curves and cytotoxicity. Under the condition of hypoxia, the rabbit adipose-derived stem cells were implanted into in alginate/bioactive glass materials containing different concentrations of perfluorotributylamine. The cellular proliferation in the four groups was compared, and the optimal perfluorotributylamine concentration in the scaffolds was selected. The adipose-derived stem cells were implanted onto the optimal scaffold, and cell adhesion, alkaline phosphatase activity and osteogenesis-related genes were detected under normoxia and hypoxia.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under hypoxic conditions, the cell proliferation in the 10% perfluorotributylamine group was significantly higher than that in the 5% perfluorotributylamine group and the control group (P < 0.05). (2) Under hypoxic conditions, the cells in the 10% perfluorotributylamine group adhered well, and the mean absorbance value of adherence spots was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (3) After 7 days of osteogenic induction under hypoxia, the activity of alkaline phosphatase and the expression of osteogenesis-related genes in the 10% perfluorotributylamine group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). To conclude, the alginate/bioactive glass bone tissue-engineered scaffold with 10% perfluorotributylamine can promote the proliferation, adhesion and osteogenic differentiation of rabbit adipose-derived stem cells under hypoxia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Anoxia, Adipose Tissue, Stem Cells, Cell Proliferation, Cell Adhesion, Tissue Engineering

中图分类号:

罗凯，杨亚峰，马腾，夏冰，黄亮亮，黄景辉，罗卓荆. 全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃复合材料对脂肪干细胞活性及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 1995-2001.

Luo Kai, Yang Yafeng, Ma Teng, Xia Bing, Huang Liangliang, Huang Jinghui, Luo Zhuojing. Effects of perfluorotributylamine/alginate/bioglass biomaterials on viability and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 1995-2001.

图/表（结果） 2

2.1 全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料的释氧特征 将含有0%，5%，10%，20%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料分别置于缺氧培养箱中，每6 h抽取材料上层培养基进行血气分析。应用血气分析仪对其所取样本检测其氧含量，结果发现在72 h内各检测时间点缺氧各组培养基中氧含量显著低于常氧组，且缺氧条件下10%全氟三丁胺组与20%全氟三丁胺组在释氧能力上差异无显著性意义，见图1。

2.2 全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料的毒性评价 各组材料浸提液毒性测定结果显示：5%全氟三丁胺组、10%全氟三丁胺组、20%全氟三丁胺组及空白对照组的CCK-8吸光度值分别为1.220±0.038，1.271±0.051，1.235±0.022，1.244±0.045。4组组间比较差异无显著性意义(P=0.401)，见图2。

2.3 脂肪干细胞在全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料上的增殖能力 CCK-8吸光度值结果显示：常氧条件下培养48 h后，5%全氟三丁胺组、10%全氟三丁胺组、20%全氟三丁胺组及空白对照组的CCK-8吸光度值为0.717±0.009，0.735± 0.035，0.755±0.031，0.737±0.009，各组间比较差异无显著性意义。缺氧条件培养48 h后，吸光度值分别为0.647±0.021，0.723±0.008，0.670±0.028，0.366± 0.031，见图3。缺氧条件下，含有全氟三丁胺各组吸光度值显著高于空白对照组。因此，全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃材料能够促进缺氧状态下脂肪干细胞的增殖。在缺氧条件下，10%全氟三丁胺组与20%全氟三丁胺组的吸光度值差异无显著性意义。考虑材料应用因素，后续实验选用10%全氟三丁胺。

2.4 脂肪干细胞在全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料上的黏附能力 培养48 h后，用黏附斑(绿色)、细胞骨架(红色)以及细胞核(蓝色)进行免疫荧光染色，黏附斑是位于细胞和细胞外基质之间接合的结构，可以显示脂肪干细胞的附着状态和伸展情况。荧光显微镜下可以观察到，常氧10%全氟三丁胺材料组、常氧对照组及缺氧10%全氟三丁胺材料组细胞骨架(红色)伸展良好，布满整个细胞，其黏附斑(绿色)荧光强度相近，在荧光合并图像中，可观察到黏附斑与细胞骨架连接紧密，显示出细胞的黏附状态良好，见图4A。进一步通过测定黏附斑的荧光强度来定量评价黏附状态，常氧10%全氟三丁胺材料组与常氧对照组黏附斑吸光度值为0.91±0.02及0.82±0.45，差异无显著性意义(P > 0.05)。在缺氧条件下，缺氧10%全氟三丁胺材料组黏附斑吸光度值为0.79±0.03，显著高于缺氧对照组(0.56±0.02，P < 0.05)，见图4B。

2.5 全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料对脂肪干细胞成骨分化能力的影响 应用碱性磷酸酶试剂盒检测各组脂肪干细胞的碱性磷酸酶活性。培养7 d，常氧条件下，常氧10%全氟三丁胺组与常氧对照组碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义，在缺氧条件下，缺氧10%全氟三丁胺组细胞碱性磷酸酶活性显著高于缺氧对照组(P < 0.05)，见图5A。进一步通过RT-PCR检测OPN，RUNX2，COL1A1的基因转录水平。结果显示，常氧条件下，常氧10%全氟三丁胺组与常氧对照组3种基因的表达差异无显著性意义。缺氧条件下，缺氧10%全氟三丁胺组RUNX2、COL1A1基因表达量显著高于缺氧对照组(P < 0.05)，两组OPN基因表达量比较差异无显著性意义，见图5B-D。

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引言

创伤、感染以及肿瘤造成的大段骨缺损，导致骨组织失去连续性，对机体健康造成了严重的危害，这一问题是困扰骨科医生的难题。近年来，组织工程材料的应用为大段骨缺损修复提供了新的方法^[1]。有学者应用干细胞与支架材料复合，通过体外诱导、扩增，将其移植于骨缺损处，从而达到修复骨缺损的目的^[2-3]。然而，在骨缺损处由于骨的结构完整性及其内部血管破坏，氧气无法得到足够的供应，形成局部低氧环境^[4]，严重影响了干细胞的存活及功能^[5]，从而限制了组织工程材料的广泛应用。在移植材料内部新生血管长入前，如何为组织工程材料中的干细胞供氧是急需解决的问题。

目前，随着组织工程学的发展，有多种携氧材料被广泛应用于基础研究，包括过氧化物、血红蛋白氧载体和全氟化合物等。全氟三丁胺因其具有较好的氧溶解性和无毒副作用，被广泛用于解决组织缺氧的研究中^[6]。目前，藻酸盐复合生物玻璃构建的骨组织工程支架在骨组织修复中有着良好的应用^[7]。组织工程材料的体外构建需要种子细胞在材料中增殖并生成类似修复组织的基质，脂肪干细胞以其易于分离且获得量大，体外扩增能力强且具有向多种成体细胞分化的潜能而有望成为组织工程领域最广泛应用的种子细胞^[8-9]。

该研究以全氟三丁胺为携氧材料，以藻酸盐及生物玻璃为原料，构建了复合脂肪干细胞的携氧骨组织工程材料，并在体外实验中探索含有不同体积分数全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃骨组织工程材料对缺氧状态下脂肪干细胞增殖、黏附及成骨分化的影响，为其在骨组织工程的应用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 观察学实验。

1.2 时间及地点 于2016年6月至2017年6月在空军军医大学西京医院骨科实验室完成。

1.3 材料 全氟三丁胺(Sigma，美国)；藻酸钠(Sigma，美国)；多孔生物玻璃(Novabone，美国)；缺氧培养箱(New Brunswick GALAXY 48R，英国)；扫描电子显微镜(Hitachi公司，日本)；荧光显微镜(Olympus FV-1000，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔脂肪干细胞的分离、培养及鉴定 参照文献[8-9]的方法，在无菌条件下分离新西兰大白兔腹股沟处脂肪组织，放入预冷的PBS溶液中，剔除脂肪内的血管和筋膜；清洗修剪后的脂肪组织，移入新的培养皿，用眼科剪将脂肪组织剪碎，移入15 mL离心管，然后加入预先配制好的1%Ⅰ型胶原酶；将该离心管放入37 ℃摇床，使其充分消化40 min；然后加入同样体积的培养基终止消化，用胶头滴管轻柔吹打；吹打结束后进行离心，离心参数为1 200 r/min，时间为5 min；离心结束后，移去上清，加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，用胶头滴管轻柔吹打均匀；细胞计数后，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于培养瓶中，放入细胞培养箱进行培养；培养24 h后，显微镜下观察细胞状态，待细胞贴壁后进行换液，每2 d换液1次；当细胞密度接近80%时对其进行传代。选用第3代细胞进行实验，并进行流式鉴定及成骨、成脂诱导分化。该研究涉及的所有动物实验均由空军军医大学动物伦理委员会批准。

1.4.2 携氧材料全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃的制备 ①用蛋黄卵磷脂及Tyrode溶液经过超声乳化后制备基础乳液；②将制备好的基础乳液加入全氟三丁胺原液，继续超声乳化，得到体积分数为10%，20%，40%的全氟三丁胺乳液；③以0.25 μm滤器过滤除菌，得到无菌的全氟三丁胺乳液备用；④按1∶1比例将无菌的全氟三丁胺乳液及1.2%藻酸钠溶液混合，分别制成体积分数为5%，10%，20%的全氟三丁胺溶液；⑤制备完成后，将其放入高压氧仓30 min，使其充分溶解氧气；⑥消化第3代兔脂肪干细胞，终止消化，离心，弃上清后加入此溶液进行吹打，使细胞悬浮于此溶液中；⑦将经过⁶⁰Co辐射灭菌的多孔生物玻璃材料(8 mm× 8 mm×8 mm)浸泡于上述不同体积分数的全氟三丁胺/藻酸钠/脂肪干细胞溶液中，轻柔吹打，使溶液充分进入生物玻璃孔隙中，然后加入等量的1.5%CaCl₂溶液，使其形成凝胶结构；⑧同时制备不含脂肪干细胞的全氟三丁胺/藻酸钠/生物玻璃材料；⑨将材料块由凝胶中取出，放入6孔板，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂，95%湿度的CO₂孵箱中。

1.4.3 携氧材料氧释放曲线的测量 按以上方法制备含有0%，5%，10%，20%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料(不含脂肪干细胞)(8 mm×8 mm×8 mm)，置入6孔板中，每孔放置同种材料6块；向每孔加入3 mL DMEM/F12培养基。将4组6孔板放入缺氧条件下(体积分数为0.5%O₂，体积分数为5%CO₂，37 ℃)进行培养，每6 h在缺氧培养箱中抽取材料上层培养基进行快速血气分析，检测培养基氧含量；持续记录96 h，并保证缺氧培养条件不变。同时将含有0%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料置入6孔板中，放入常氧条件下(体积分数为5%CO₂，37 ℃)培养，同样方法进行血气分析以作对照。

1.4.4 携氧材料的毒性评价 将含0%，5%，10%，20%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料(不含脂肪干细胞)(8 mm×8 mm×8 mm)分别放置于6孔板中，每孔加入4 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基浸泡24 h制备浸提液。将第3代脂肪干细胞按照1×10⁴/孔接种于96孔板中，分为4组：空白对照组、5%全氟三丁胺组、10%全氟三丁胺组、20%全氟三丁胺组，培养8 h待细胞贴壁后，更换含有0%，5%，10%，20%全氟三丁胺材料浸提液，继续常氧状态下培养24 h，每孔加入CCK-8溶液10 µL，置于培养箱孵育4 h，应用酶标仪测定各孔450 nm吸光度值，并记录分析结果。

1.4.5 携氧材料对脂肪干细胞增殖的影响 将第3代脂肪干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于无菌圆形玻片(10 mm)上，常氧培养8 h后，将玻片放置于6孔Transwell小室系统上层，下层分别放置含0%，5%，10%，20%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料(8 mm×8 mm×8 mm)，分别对应4个实验组：空白对照组、5%全氟三丁胺组、10%全氟三丁胺组、20%全氟三丁胺组，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞，使培养基完全覆盖玻片。将Transwell小室分别在常氧(体积分数为5%CO₂，37 ℃)及缺氧(体积分数为0.5%O₂，体积分数为5%CO₂，37℃)条件下培养。培养48 h后，取出Transwell小室上层的圆形玻片，用胰蛋白酶消化法制备细胞悬液，将100 µL细胞悬液加入96孔板中，每孔加入CCK-8溶液10 µL，置于培养箱孵育4 h，应用酶标仪测定各孔450 nm吸光度值，并记录分析结果。根据以上实验筛选含最优体积分数全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料，确定以下实验中全氟三丁胺体积分数。

1.4.6 缺氧条件下脂肪干细胞的黏附能力 实验分为4组：常氧对照组(含0%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料)、常氧10%全氟三丁胺组(含10%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料)、缺氧对照组(含0%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料)、缺氧10%全氟三丁胺组(含10%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料)。将第3代脂肪干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于无菌圆形玻片(10 mm)上，常氧培养8 h，将玻片分别放置于6孔Transwell小室系统上层，下层放置含0%，10%全氟三丁胺的藻酸盐/生物玻璃材料，进行常氧及缺氧培养，48 h后将细胞进行多聚甲醛固定、破膜，山羊血清封闭，鼠抗兔黏附斑一抗4 ℃孵育过夜，异硫氰酸荧光素-IgE抗血清温浴(37 ℃)4 h，罗丹明标记鬼笔环肽37 ℃孵育30 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，荧光显微镜观察细胞的黏附状态，并测定黏附斑平均吸光度值。

1.4.7 缺氧条件下脂肪干细胞的分化能力 培养方式及分组同黏附实验，将常氧对照组、常氧全氟三丁胺组放置于常氧培养箱，将缺氧对照组、缺氧全氟三丁胺组细胞放置于缺氧培养箱，使用成骨诱导培养基(主要成分为DMEM/F12，体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松)培养7 d，取出Transwell小室系统上层的圆形玻片，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书加入相应试剂进行碱性磷酸酶活性测定。

利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测COL1A1、OPN、RUNX2的基因表达量：分别提取4组细胞的总RNA，进行反转录和荧光定量PCR反应，反应结束后进行扩增曲线和熔解曲线分析。实时荧光定量聚合酶链式反应以GAPDH作内参，实时荧光定量聚合酶链式反应引物见表1。

1.5 主要观察指标 ①全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料的释氧特征以及毒性评价；②常氧、缺氧条件下脂肪干细胞在全氟三丁胺/藻酸钙/生物玻璃材料上的增殖能力、黏附能力及成骨分化能力。

1.6 统计学分析 实验数据及图像的分析应用软件为IBM SPSS 20.00统计软件包(SPSS公司，美国)、GraphPad Prism 6(GraphPad software，美国)及Image-Pro plus 6.0 (Media cybernetics，美国)。实验数据的计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较P < 0.05时，采用Bonferroni检验进行两两样本差异检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

3.1 携氧骨组织工程支架材料的构建 氧是细胞生理、病理活动中的重要物质，在机体内各个部位氧分压都有其严格的范围，过高或者过低的氧分压都会导致机体损伤。就目前而言，由于干细胞的多分化潜能，体外低氧微环境下对其成骨诱导分化的影响并无一致性的结果。例如Grayson等^[10]研究发现体积分数为2%氧气促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；然而，Malladi等^[11]却认为体积分数为3%氧气抑制成骨细胞标志性基因的表达或活性上调，而体积分数为21%氧气却促进成骨细胞标志基因的表达。这些研究说明了不同氧体积分数对干细胞的成骨分化有不同的影响。

该实验中应用的全氟三丁胺作为全氟化合物的一种类型，具有很高的氧溶解性。目前，全氟碳化合物与生物材料的结合，已经用于骨骼、肝脏以及神经的修复^[12-16]。例如在神经修复方面，Ma等^[17]制备含全氟三丁胺纤维蛋白水凝胶携氧系统，发现其在缺氧状态下通过释氧对许旺细胞的活性和功能有相应的促进作用。在骨组织再生和修复方面，Benjamin等^[18]发现全氟三丁胺藻酸盐在缺氧条件下能够促进过表达骨形态发生蛋白2的骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，但抑制其向软骨方向分化。Kimelman-Bleich等^[19]将骨髓间充质干细胞在含有全氟三丁胺纤维蛋白水凝胶中培养，发现其能够在体内促进组织异位骨化形成。该实验用全氟三丁胺、藻酸盐、生物玻璃构建骨组织材料，在排除材料对脂肪干细胞的影响后，对材料中复合的全氟三丁胺的体积分数进行了实验。作者发现在10%的体积分数下，材料周围微环境中的氧分压对脂肪干细胞的存活、增殖及成骨分化有最优的促进作用。同时实验发现含有全氟三丁胺的材料供氧能力是有限的。有研究表明，新生血管在体内长入支架内部3-5 mm，至少需要1-3周的时间^[20-21]。这也就表明，大段骨缺损的修复时间至少在1周以上，而含有全氟三丁胺的材料所维持的供氧量及供氧时间在这种情况下是不足的。有学者已经通过封装全氟碳化合物，使材料供氧更加充足和持久^[13^，^22]。该研究中全氟三丁胺的供氧时长及供养量还可以进一步提高，在整个修复周期中的材料释氧量对内部种子细胞的影响还有待研究。

3.2 材料构建成分及理化性质 实验选用藻酸盐和生物玻璃作为支架材料的构建成分。藻酸盐具有无毒特性，近年来常被应用于药剂研制和食品工业中。在骨科基础研究中，藻酸盐经常应用于细胞的封装，作为传递生长因子的介质等方面。当藻酸盐单独作为骨组织工程材料时，由于生物机械强度弱，在承载重量的骨缺损中不能单独使用。既往有研究应用无机材料复合藻酸盐水凝胶来提升其机械性能。例如Luo等^[7]将生物玻璃与海藻酸盐复合构建具有多层结构的支架材料，显著改善了海藻酸盐支架的力学性能和矿化能力；Srinvasan等^[23]制备纳米活性生物玻璃和海藻酸钠复合支架用于牙周组织的再生。因此，加入无机材料可以提升藻酸盐材料的机械性能。生物玻璃近年来被广泛应用于骨组织、多种软组织修复^[24-32]。生物玻璃能促进成骨细胞复制和分化^[33-34]。生物玻璃还能与骨发生直接的化学结合，如Lovelace等^[35]将45S5生物玻璃应用于重度成人牙周炎患者牙周骨丧失的治疗，发现其有显著改善牙周软硬组织的作用。实验在以上研究背景下，应用藻酸盐和生物玻璃构建材料，这两者的结合在既往研究中对骨组织修复有一定的促进作用，并经研究证实对部分细胞的存活、黏附及成骨分化也有促进作用^[36-38]。

3.3 缺氧条件下含全氟三丁胺材料促细胞增殖、黏附及分化基因表达 氧气对干细胞的分化有一定的调控作用。有研究表明，骨缺损部位的长期缺氧可抑制细胞的正常增殖、分化及矿化，不利于其修复^[39]。缺氧条件下的成骨细胞矿化水平下降^[40]，另外细胞内环境中的高氧分压可使体内产生自由基，有可能对细胞造成损害。

实验构建全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃材料，当材料中全氟三丁胺的体积分数为10%时，其材料内部氧分压最适合同种异体脂肪干细胞的增殖、黏附及分化。黏附斑荧光强度测定显示，缺氧10%全氟三丁胺材料组与缺氧对照组细胞黏附斑平均吸光度值比较差异有显著性意义。这表明，在经过适宜体积分数全氟三丁胺调控后，脂肪干细胞的黏附能力有所提升。采用碱性磷酸酶活性及成骨相关基因检测分析脂肪干细胞的成骨分化作用，结果显示，缺氧10%全氟三丁胺材料组与缺氧对照组比较差异有显著性意义，全氟三丁胺提升材料氧分压，对植入的同种异体脂肪干细胞成骨分化有很大的作用。缺氧10%全氟三丁胺组RUNX2、COL1A1基因表达量与缺氧对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，而OPN基因表达量二者比较差异无显著性意义。查阅文献，Potier等^[41]发现短暂暴露在缺氧环境下的间充质干细胞会导致RUNX2、COL1A1基因下调及OPN基因上调。该研究发现在适宜氧分压条件下，脂肪干细胞RUNX2、COL1A1基因表达上调，而OPN基因表达与缺氧对照组差异无显著性意义，有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全氟三丁胺/藻酸盐/生物玻璃复合材料对脂肪干细胞活性及成骨分化的影响

Effects of perfluorotributylamine/alginate/bioglass biomaterials on viability and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells

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