白细胞介素17和牙周膜成纤维细胞在体外诱导破骨样细胞生成中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1136

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (11): 1680-1686.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1136

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白细胞介素17和牙周膜成纤维细胞在体外诱导破骨样细胞生成中的作用

周恬，吴凯，黎敏，卢海丽，唐海芳，康娜

(广西医科大学附属口腔医院重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021)

收稿日期:2018-12-06 出版日期:2019-04-18 发布日期:2019-04-18
通讯作者: 康娜，博士，副教授，广西医科大学附属口腔医院重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:周恬，男，1992年生，浙江省湖州市人，广西医科大学在读硕士，主要从事牙合面畸形的矫治及机制的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81360170)，项目负责人：康娜

Effects of interleukin-17 and human periodontal ligament fibroblasts on the production of osteoclast-like cells in vitro

Zhou Tian, Wu Kai, Li Min, Lu Haili, Tang Haifang, Kang Na

(State Key Laboratory of Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2018-12-06 Online:2019-04-18 Published:2019-04-18
Contact: Kang Na, MD, Associate professor, State Key Laboratory of Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhou Tian, Master candidate, State Key Laboratory of Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Nature Science Foundation of China, No. 81360170 (to KN)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
破骨样细胞：破骨细胞由破骨细胞前体细胞分化形成，体外培养可分化为破骨样细胞，体外培养的破骨样细胞可用于细胞学及分子生物学研究。破骨样细胞与破骨细胞的区别在于破骨样细胞多用于实验研究，而破骨细胞存在于骨改建部位。
外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)：是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。目前外周血单个核细胞主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法。

摘要
背景：研究表明，牙根吸收是正畸治疗过程中常见的并发症，而白细胞介素17可能通过牙周膜参与介导破骨细胞的分化和成熟从而引发牙根吸收。
目的：探讨白细胞介素17和人牙周膜成纤维细胞在正畸炎性相关牙根吸收中的作用及其作用机制。
方法：取4-6代人牙周膜成纤维细胞分别加入含白细胞介素17质量浓度为0或20 μg/L的DMEM培养基预处理42 h，取细胞上清液加入50 μg/L核因子κB受体活化因子配体(RANKL)分别作用于外周血单核细胞3，5，7，10 d，建立人牙周膜成纤维细胞和外周血单核细胞间接共培养系统。实验分为6组：①对照组；②外周血单核细胞+RANKL组；③外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞组；④外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+白细胞介素17组；⑤外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+RANKL组；⑥外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+RANKL+白细胞介素17组。采用RT-qPCR法检测外周血单核细胞诱导生成破骨样细胞组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、碳酸酐酶ⅡmRNA的表达量，鬼笔环肽染色观察和计数破骨样细胞的细胞骨架中纤维肌动蛋白环的形态和数目。
结果与结论：①RT-qPCR分析证实，与对照组相比，白细胞介素17、人牙周膜成纤维细胞和RANKL诱导的基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K和碳酸酐酶Ⅱ表达水平显著提高；②鬼笔环肽染色结果显示，与对照组相比，加白细胞介素17组或(和)加RANKL组肌动蛋白环阳性细胞数目显著增加(P < 0.01)；③结果提示，白细胞介素17可有效诱导破骨细胞前体分化为具有骨吸收能力的破骨样细胞，其具体机制是通过调节人牙周膜成纤维细胞，上调RANKL下调骨保护素来介导的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7944-9959(康娜)

关键词: 白细胞介素17, 牙周膜, 人牙周膜成纤维细胞, 破骨样细胞, 组织蛋白酶k, 骨吸收, 骨保护素, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Root resorption has been shown to be a common complication during orthodontic treatment, and interleukin-17 may mediate the differentiation and maturation of osteoclasts through periodontal ligament to induce root resorption.
OBJECTIVE: To investigate the roles of interleukin-17 and human periodontal ligament fibroblasts in orthodontically induced inflammatory root resorption and the underlying mechanism.
METHODS: Passage 4-6 human periodontal ligament fibroblasts were added to the DMEM medium containing interleukin-17 at concentration of 0 or 20 μg/L for 42 hours. Cell supernatant mixed with 50 μg/L RANKL was cultured with peripheral blood mononuclear cells for 3, 5, 7 and 10 days, respectively to establish a human periodontal ligament fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells indirect co-culture system. There were six groups: control group, peripheral blood mononuclear cells+RANKL group, peripheral blood mononuclear cells+human periodontal ligament fibroblasts group, peripheral blood mononuclear cells+human periodontal ligament fibroblasts+interleukin-17 group, peripheral blood mononuclear cells + human periodontal ligament fibroblasts+RANKL group, and peripheral blood mononuclear cells+human periodontal ligament fibroblasts+RANKL+interleukin-17 group. The expression levels of cathepsin K, matrix metalloproteinase 9 and carbonic anhydrase II mRNA induced by peripheral blood mononuclear cells in osteoclast-like cells were detected by RT-qPCR. Phalloidin staining was used to observe and count the morphology and number of fibromuscular actin rings in the cytoskeleton of osteoclast-like cells.
RESULTS AND CONCLUSIONS: RT-qPCR analysis confirmed that interleukin-17, human periodontal ligament fibroblasts and RANKL increased the expression levels of cathepsin K, matrix metalloproteinase 9 and carbonic anhydrase II compared with the control group. The results of phalloidin staining showed a significant increase in the number of actin-loop positive cells in the interleukin-17 (+) or RANKL (+) groups compared with the control group (P < 0.01). To conclude, interleukin-17 can effectively induce osteoclast precursor differentiation into osteoclast-like cells with bone resorption ability, which may be mediated through upregulation of RANKL and downregulation of osteoprotegerin by human periodontal ligament fibroblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Interleukin-17, Osteoclasts, Periodontal Ligament, Tissue Engineering

中图分类号:

R446
R318

周恬，吴凯，黎敏，卢海丽，唐海芳，康娜. 白细胞介素17和牙周膜成纤维细胞在体外诱导破骨样细胞生成中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1680-1686.

Zhou Tian, Wu Kai, Li Min, Lu Haili, Tang Haifang, Kang Na. Effects of interleukin-17 and human periodontal ligament fibroblasts on the production of osteoclast-like cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1680-1686.

图/表（结果） 1

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引言

正畸炎性相关牙根吸收(OIIRR)是正畸牙齿移动最常见的不良反应之一^[1]。许多因素被证实可以解释正畸炎性相关牙根吸收，例如不良的口腔卫生习惯、个体差异、牙齿错颌畸形的类型、正畸力量过大和疗程过长等^[2]。连续正畸负荷引起的炎症反应是引起正畸炎性相关牙根吸收的重要原因之一。然而到目前为止，正畸医生依然无法精确预测正畸炎性相关牙根吸收的发生和发展。

研究表明，正畸力下牙周组织改建是一个多种生物力学信号转导通路相互调节相互作用的过程。通过Wnt/β-catenin 信号通路、MAPKs信号通路等多种传导途径^[3]，牙周组织及炎性细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α等炎症因子，诱导成骨细胞等表达核因子κB受体活化剂配体(receptor activator of NF-κ Bligand，RANKL)并与破骨细胞前体细胞表面的核因子κB受体活化因子结合，在巨噬细胞集落刺激因子存在的前提下^[4]，激活胞内信号转导，通过上调RANKL和下调骨保护素，促进牙周膜压力侧破骨细胞分化成熟，造成骨吸收^[5-6]。其中基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K(CTSK)、碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是破骨细胞骨吸收活性最具代表性的标志物^[7-8]，碳酸酐酶Ⅱ与破骨细胞泌酸功能关系密切，组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9与破骨细胞分解骨基质有机成分密切相关^[9]。然而，在多数情况下，破骨细胞活动不仅影响牙周组织的重塑，而且在正畸牙齿移动过程中也会转向牙齿本身，导致正畸炎性相关牙根吸收^[10]。有学者证明，牙根的表层组织主要由成牙骨质细胞和类牙骨质构成^[11]。牙根吸收初期，巨噬样细胞首先聚集到坏死部位，随后吸收周边牙根表层组织，清除坏死的牙周组织，形成吸收陷窝并开始牙根吸收。同时牙周膜毛细血管中的免疫细胞移出并释放炎症因子，与受力部的细胞共同介导此反应^[12]。研究发现，人体骨骼系统和免疫系统共存许多介质^[13]。骨细胞可以在生理和病理条件下与免疫细胞相互作用。据此可以合理地推断免疫系统通过与骨骼系统相互作用，参与正畸炎性相关牙根吸收的过程。

多项临床研究证实，白细胞介素17与细胞膜上白细胞介素17R结合参与了多种骨/软骨破坏性疾病及免疫疾病的发生发展过程^[14-15]，如牙周炎、骨关节炎、风湿性关节炎、哮喘等，具有关键的调节作用。白细胞介素17是辅助性T细胞17(Th17)的产物，是炎症反应的关键调节因子^[16]，在牙周膜组织中，Th17细胞由正畸力诱导形成^[17]。目前共存在6种白细胞介素17家族配体(白细胞介素17A，白细胞介素17B，白细胞介素17C，白细胞介素17D，白细胞介素17E和白细胞介素17F)和5种受体(白细胞介素17RA，17RB/白细胞介素25R，白细胞介素17RC，白细胞介素17RD/SEF和白细胞介素17RE)，而白细胞介素17通常被称为白细胞介素17A^[18]。白细胞介素17受体(白细胞介素17R)广泛分布于多种细胞和组织中，如成纤维细胞、T淋巴细胞、成骨细胞和软骨细胞^[1^，^19]。尽管Th17途径主要通过巨噬细胞的聚集来保护机体免受细菌性相关炎症反应，但涉及Th17通路导致骨吸收增加和加剧牙周炎的负面作用也得到了证实^[20]。

此外，白细胞介素17具有潜在的破骨细胞形成能力，部分原因在于其可以通过成骨细胞和其他基质细胞刺激RANKL受体激活剂的能力^[21]。Chitrapriya等^[22]通过实验检测到白细胞介素17与Th17蛋白表达于人慢性根尖周炎组织中，认为破骨细胞生成是由白细胞介素17上调的RANKL来介导，并引起根尖病变区骨质的吸收。Nakano等^[23]研究发现白细胞介素17通过刺激牙髓组织细胞分泌RANKL和提高RANKL/OPG比率，参与正畸牙根吸收的发生发展。课题组前期实验证实，白细胞介素17刺激人牙周膜成纤维细胞，可通过促进RANKL和抑制骨保护素介导破骨细胞分化和成熟，参与牙根吸收，白细胞介素17对人牙周膜成纤维细胞中RANKL、骨保护素因子的调节存在浓度依赖性。当白细胞介素17质量浓度为20 μg/L时，RANKL/OPG比值最大^[24]。

基于上述研究，作者做出假设：白细胞介素17和人牙周膜成纤维细胞共同参与了破骨细胞组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、碳酸酐酶Ⅱ相关因子的表达调控，进而影响破骨细胞分化，参与牙根吸收。在该研究中，以外周血单核细胞为破骨细胞前体，建立人牙周膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养系统，探讨白细胞介素17和人牙周膜成纤维细胞诱导破骨细胞分化和成熟的机制，明确人牙周膜成纤维细胞、破骨细胞和白细胞介素17之间的关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点于2016年12月至2017年3月在广西医科大学附属口腔医院重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 主要试剂及仪器无支原体胎牛血清、高糖DMEM培养基(南京维森特生物技术有限公司)、Ficoll淋巴细胞分离液(GE Healthcare UK)、双抗(青霉素100 U/mL、链霉素 100 U/mL)(北京solarbio公司)、锥虫蓝(上海恒远生物科技有限公司)、二氧化碳恒温培养箱(德国Heraeus公司)、PCR 扩增仪(美国Roche公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、低温高速离心机(美国基因公司)。

1.3.2 人牙周膜成纤维细胞源于广西医科大学附属口腔医院口腔外科11-16周岁正畸患者离体前磨牙，牙齿牙周组织健康，无任何牙体疾病。正畸者及其家属均对试验过程完全知情同意，同意将牙用于实验，并签署知情同意书。

1.4 实验方法

1.4.1 人外周血单核细胞的分离和培养指导参与志愿者避免剧烈运动、饮酒、摄入咖啡因和尼古丁，并在采血前一天保证清淡健康的膳食。抗凝管收集20 mL血液，通过Ficoll密度梯度离心法分离和培养外周血单核细胞。志愿者对试验过程完全知情同意，并签署知情同意书。

1.4.2 人外周血单核细胞活力鉴定通过锥虫蓝染色在光学显微镜下进行细胞计数，计数200个细胞，使用活细胞占总细胞数的百分比计算人牙周膜成纤维细胞的存活率。调节细胞浓度至1×10⁹L^-1。

1.4.3 人牙周膜成纤维细胞的原代培养采用组织块培养法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养。牙齿离体后放入预冷的含双抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)的无血清DMEM培养液中，30 min内刮取根中下1/3的牙周膜组织，制成约1 mm×1 mm的小块，漂洗，接种于75 mL培养瓶瓶底。将培养瓶竖直放于CO₂培养箱内培养，培养条件为体积分数5% CO₂、95%空气、37 ℃、饱和湿度。四五小时后翻转培养瓶，使培养液接触组织块。两三天给细胞换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况、拍照记录。取第4-6代人牙周膜成纤维细胞用于后续实验。

1.4.4 不同质量浓度白细胞介素17刺激人牙周膜成纤维细胞，收集细胞条件培养液取4-6代人牙周膜成纤维细胞，加入含体积分数10% FBS的DMEM培养液，调整细胞浓度至1×10⁸L^-1，置培养箱继续培养至细胞爬满60%，加入0或20 μg/L的重组人白介素17A蛋白及含体积分数10% FBS的DMEM培养液继续培养42 h，吸弃培养液，按3∶7的体积比例与细胞培养液混合，加入50 μg/L的RANKL，作为培养各组破骨细胞前体条件培养液。

1.4.5 实验分组及分组依据见表1。

表1 各组处理方法

Table 1 Treatment methods in each group

组别	处理方法
对照组	分离所获得的单核细胞接种于分预置盖玻片的48孔培养板中，每孔1 mL，作为对照组。
外周血单核细胞+RANKL组	单核细胞接种于预置盖玻片的48孔培养板中，加入含50 μg/L RANKL的培养液。
外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞组	单核细胞接种于预置盖玻片的48孔培养板中，加未经白细胞介素17作用的条件培养液。
外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+白细胞介素17组	单核细胞接种于预置盖玻片的48孔培养板中，加经白细胞介素17作用的条件培养液。
外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+RANKL组	单核细胞接种于预置盖玻片的48孔培养板中，加入含50 μg/L RANKL的未经白细胞介素17作用的条件培养液。
外周血单核细胞+人牙周膜成纤维细胞+RANKL+白细胞介素17组	单核细胞接种于预置盖玻片的48孔培养板中，加入含50 μg/L RANKL的经白细胞介素17作用的条件培养液。

分组依据：过去的研究已证实人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和骨保护素。因此在体外设计受到白细胞介素17作用的人牙周膜成纤维细胞与人外周血单核细胞共培养来证实人牙周膜成纤维细胞表达的RANKL和骨保护素是否对破骨细胞形成具有调节作用，以了解人牙周膜成纤维细胞、破骨细胞和白细胞介素17之间的关系。

1.4.6 不同条件培养液不同时间刺激破骨细胞前体细胞(外周血单核细胞) 待外周血单核细胞生长至80%后，培养基更换为含体积分数10%FBS的DMEM培养液的不同条件培养液。将48孔培养板放入CO₂孵箱中继续培养3，5，7，10 d，每3 d半量换液1次，每日倒置显微镜下观察各组细胞生长情况，照相记录。

1.4.7 总RNA提取及RT-qPCR反应按TRIZOL试剂盒说明书进行各组细胞总RNA的提取。紫外分光光度计检测 RNA提取质量，选择A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7-2.1的适宜RNA浓度样本进行后续实验。根据反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录为cDNA做模板进行RT-PCR反应。实验所涉及的引物序列见表2。最后将原始循环数据(Ct值)换算为基因的相对表达量(2^-??Ct)。

表2 Real-time PCR 引物序列

Table 2 Primer sequences for real-time PCR

基因	Primer sequences
基质金属蛋白酶9	Forward	5’-ACG CAC GAC GTC TTC CAG TA-3’
基质金属蛋白酶9	Reverse	5’-CCA CCT GGT TCA ACT CAC TCC-3’
组织蛋白酶K	Forward	5’-GTC TGA GAA TGA TGG CTG TGG A-3’
组织蛋白酶K	Reverse	5’-CAT TTA GCT GCC TTG CCT GTT G-3’
碳酸酐酶Ⅱ	Forward	5’-CTC AAC AAT GGT CAT GCT TTC AAC-3’
碳酸酐酶Ⅱ	Reverse	5’-CAG TAT GCT CTG AAC CTT GTC CAT C-3’

1.4.8 罗丹明标记鬼笔环肽染色 48孔培养板间接共培养诱导破骨样细胞生成14 d，细胞长满爬片50%-60%。取出细胞培养盖破片，采用鬼笔环肽染色试剂盒进行破骨样细胞肌动蛋白环(F-actin)染色。荧光显微镜和共聚焦显微镜下行荧光观察和计数破骨样细胞的细胞骨架中纤维肌动蛋白环的形态、数目。

1.5 主要观察指标 ①外周血单核细胞的分离效果；②人牙周膜成纤维细胞的培养结果；③不同条件培养液不同时间刺激破骨前体细胞外周血单核细胞的组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、碳酸酐酶Ⅱm-RNA表达量及变化；④鬼笔环肽染色观察破骨样细胞纤维肌动蛋白环表达情况。

1.6 统计学分析计量资料数据用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0进行单因素方差分析(方差齐性)，若方差不齐采用秩和检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

破骨细胞是骨组织中参与骨吸收的多核巨细胞，来源于骨髓单核-巨噬细胞系^[24]，其形成和分化所必须的细胞间信号转导由RANKL、核因子κB受体活化因子和骨保护素通路介导^[25]。在正畸过程中，破骨细胞、成骨细胞和牙周膜成纤维骨保护素细胞是造成牙槽骨改建的主要细胞，当牙齿因受力过大、牙根形态异常等多种因素作用下，将出现病理性的牙根吸收，破骨细胞是引起牙根吸收的最重要细胞^[26]。体外实验中，由原代培养或体外诱导形成的具有破骨细胞特征和功能的细胞称为破骨样细胞，多采用外周血单核细胞^[27]、脐血单核细胞(UBMCs)和人类白血病单核细胞系U937和THP-1为前体细胞诱导得到破骨样细胞。破骨细胞和破骨样细胞在生物学上属于同一种细胞。Matsuzaki等^[28]最初发现RANKL能诱导外周血单核细胞形成破骨样细胞，由于外周血单核细胞取材方便，分离方法简单，因此目前理想的破骨前体细胞来源是外周血单核细胞。

人牙周膜成纤维细胞作为牙周膜的主体细胞，除了通过不断合成与降解胶原，维持牙周膜中胶原的代谢，还能通过分泌多种细胞活性因子刺激成骨细胞和破骨细胞，参与牙周组织的正常代谢、病变、修复及再生^[29]。课题组前期实验TRAP染色结果显示，在人牙周膜成纤维细胞中，白细胞介素17通过促进RANKL和抑制骨保护素等骨吸收相关因子的表达，可能参与破骨细胞的分化与成熟^[30]。白细胞介素17刺激牙周膜成纤维细胞后，可促进成纤维细胞RANKL的表达升高，而骨保护素的表达降低。当单核细胞与在白细胞介素17刺激下的牙周膜成纤维细胞共培养后，单核细胞可融合成多核巨细胞，TRAP染色阳性。多核巨细胞与无白细胞介素17刺激的共培养组比较，体积较大，数目明显增多，差异有统计学意义。这说明白细胞介素17在其中起到了重要作用，在单个核细胞向破骨样细胞分化的过程中，白细胞介素17可能通过调节人牙周膜成纤维细胞RANKL 和骨保护素的变化间接影响破骨细胞的分化。由于前期实验TRAP染色鉴定和计数多核巨细胞尚不能证明是成功培养破骨细胞，为更好分析白细胞介素17和成纤维细胞对破骨细胞分化过程的影响，还需用更可靠的实验方法检测成熟破骨细胞的功能性酶以及破骨细胞的功能。

为证实推断，此次研究采用密度梯度离心法分离纯化外周血单核细胞及组织块培养法建立体外人牙周膜成纤维细胞系。0或20 μg/L白细胞介素17分别预处理牙周膜成纤维细胞42 h，收集细胞上清液并加入50 μg/L的RANKL作为条件培养液分别刺激外周血单核细胞 3，5，7，10， 14 d，检测不同时间段组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、碳酸酐酶Ⅱ mRNA表达情况及细胞肌动蛋白环阳性表达情况。实验结果显示，在人牙周膜成纤维细胞与外周血单核细胞共培养体系下，单核细胞能生成纤维肌动蛋白环阳性多核细胞，多核细胞在光学显微镜下观察与破骨样细胞相似，可视为破骨样细胞。共培养组受白细胞介素17诱导后，肌动蛋白环阳性细胞数目显著增加。提示：白细胞介素17有促进破骨样细胞生成的作用，其作用机制可能是通过人牙周膜成纤维细胞间接作用于外周血单核细胞。

此次实验研究结果发现，外周血单核细胞在单独培养的情况下，随时间的增加，外周血单核细胞逐渐减少，细胞逐渐凋亡，罗丹明-鬼笔环肽荧光染色未出现阳性，单核细胞并未向破骨细胞分化。而RANKL与外周血单核细胞共培养，细胞可融合成多核巨细胞，鬼笔环肽染色结果显示阳性，证明RANKL具有促进破骨前体细胞分化的功能。已有学者研究发现^[31]，单核/巨噬细胞分化为具有骨吸收能力的破骨细胞，需要两个细胞因子即RANKL和巨噬细胞集落刺激因子，RANKL是调节破骨细胞分化的终末因子，与此次实验结果相符。此外，实验将人牙周膜成纤维细胞与外周血单核细胞共培养，染色结果显示单核细胞向多核巨细胞分化。Bloemen等^[32]建立人牙周膜成纤维细胞与外周血单核细胞的共培养体系，发现人牙周膜成纤维细胞可诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化，实验结果与此次实验结果一致，由此可推测，牙周膜细胞可能像成骨细胞一样，通过表达RANKL和骨保护素来双向调节破骨细胞的分化。

此次研究旨在检验白细胞介素17可能诱导正畸炎性相关牙根吸收的假设。前期课题组证明，白细胞介素17可以以相对较低的浓度通过影响人牙周膜成纤维细胞炎性细胞因子分泌来促进破骨细胞分化成熟，并且其促进作用随着时间逐渐增强，可能是出于对RANKL水平增加和骨保护素水平降低的一种反馈机制。当白细胞介素17预处理的人牙周膜成纤维细胞条件培养液与不同浓度RANKL作用于外周血单核细胞 3，5，7，10 d后，相对于对照组，实验组组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、碳酸酐酶ⅡmRNA的表达水平随着时间增加而逐渐提高。其中在白细胞介素17预处理的人牙周膜成纤维细胞条件培养液和RANKL共同作用组和第10天组达最大值，提示RANKL诱导外周血单核细胞分化为破骨样细胞的体外最佳作用随时间的增加而上调。结合课题组前期实验结果，证实白细胞介素17可通过调节成纤维细胞促进RANKL表达和抑制骨保护素表达介导破骨样细胞分化成熟，参与牙根吸收。

值得注意的是，该实验仅限于在白细胞介素17刺激下的基因水平，基质金属蛋白酶9，组织蛋白酶K，碳酸酐酶Ⅱ和其他功能酶的在蛋白水平表达仍需要进一步研究。此外，破骨细胞的形成受多种因素的影响，人牙周膜成纤维细胞是如何识别白细胞介素17，人牙周膜成纤维细胞对白细胞介素17的应答机制以及如何将生物信号进行转换仍需要在未来的更多实验中进行研究和证实。

研究发现，通过X射线检测早期正畸炎性相关牙根吸收需要至少6个月的正畸治疗时间。只有当矿物质含量损失超过30%-60%时，才能看到X射线上的密度变化^[33]。此次实验结果证明白细胞介素17在破骨样细胞形成中具有重要作用，在正畸牙齿移动之前或移动期间均不能忽略白细胞介素17的影响。牙周膜微环境中白细胞介素17的水平可能是作为预测甚至预防早期正畸炎性相关牙根吸收发生和发展的可靠指标。在一定程度上，此次研究丰富了对影响破骨前体细胞生物学行为的人牙周膜成纤维细胞的认识，为理解白细胞介素17通过人牙周膜成纤维细胞在正畸炎性相关牙根吸收中所起的作用提供了坚实的实验基础和理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白细胞介素17和牙周膜成纤维细胞在体外诱导破骨样细胞生成中的作用

Effects of interleukin-17 and human periodontal ligament fibroblasts on the production of osteoclast-like cells in vitro

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