脂肪间充质干细胞膜片移植促进创面愈合的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1581

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 790-796.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1581

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脂肪间充质干细胞膜片移植促进创面愈合的可行性

陈梅红，党旖旎，朱旭东，李璇，彭磊，杨佳佳，张国新

南京医科大学第一附属医院，江苏省南京市 210029

修回日期:2018-11-07 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 张国新，博士，教授，博士生导师，主任医师，南京医科大学第一附属医院，江苏省南京市 210029
作者简介:陈梅红，女，1993年生，江苏省溧阳市人，汉族，南京医科大学在读硕士，主要从事干细胞与创面修复方面的研究。
基金资助:
2015年江苏省级重点研发专项资金(BE2015716)，项目负责人：张国新；2014年度江苏省第四期“333工程”科研资助立项项目(BRA2014332)，项目负责人：张国新

Feasibility of adipose-derived mesenchymal stem cell sheet transplantation for wound healing

Chen Meihong, Dang Yini, Zhu Xudong, Li Xuan, Peng Lei, Yang Jiajia, Zhang Guoxin

the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Revised:2018-11-07 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Zhang Guoxin, MD, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Chen Meihong, Master candidate, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Jiangsu Provincial Special Fund for Research and Development Project in 2015, No. BE2015716 (to ZGX); 2014 Fourth-Phase “333 Project” Research Funding Project of Jiangsu Province, No. BRA2014332 (to ZGX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
温度敏感培养皿：利用温度敏感培养皿，可完整的获取细胞膜片，不使用消化酶，仅改变温度，培养于温度敏感培养皿上的细胞就可以成膜片状脱落，保留了细胞间的黏附蛋白、细胞外基质，且获取的细胞膜片易于黏附在生物组织上，不需缝合。该培养皿外观与一般培养皿相似，区别在于其细胞接种面上包被了一层温度敏感聚合物——聚乙烯N-异丙基丙烯酰胺，从而使其具有制备细胞膜片的能力。
脂肪间充质干细胞：是来源于中胚层，具有自我复制能力和多向分化潜能的多能成体干细胞。它来源丰富，取材方便，体外扩增体系成熟，且具有低免疫原性、炎症抑制等特点，还可通过分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子等，促进组织血管化、促进创面上皮再生，创面愈合，成为再生医学领域理想的种子细胞。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞因其能旁分泌多种生长因子、获取方便、具有免疫调节等作用，常被用于组织修复和功能重建。食管内镜黏膜下剥离后狭窄的预防和治疗是困扰医生和患者的难题。脂肪间充质干细胞结合新型组织工程技术——细胞膜片，具有促进创面修复、预防食管狭窄发生的潜能和应用价值。
目的：探讨脂肪间充质干细胞膜片的生物学特征，分析其预防食管内镜黏膜下剥离后狭窄的可行性。
方法：①将使用温度敏感培养皿制备的绿色荧光蛋白标记的脂肪间充质干细胞膜片设为实验组，常规贴壁脂肪间充质干细胞为对照组，通过ELISA、反转录实时PCR及Western blot比较2组血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子含量；②取裸鼠制备皮肤人工溃疡，随机分为贴膜组与模型组，贴膜组立即在皮肤创面处贴附绿色荧光蛋白标记的脂肪间充质干细胞膜片。
结果与结论：①脂肪间充质干细胞膜片中细胞含量较高，细胞外基质丰富，细胞与细胞之间连接存在；膜片组血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子表达水平均高于对照组；②裸鼠背部脂肪间充质干细胞膜片移植成功，且贴膜组愈合速度快于模型组；③实验结果提示脂肪间充质干细胞结合细胞膜片技术预防食管内镜黏膜下剥离后狭窄具有可行性，但仍需大量的基础及临床研究进一步证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3909-592X(陈梅红)

关键词: 内镜黏膜下剥离, 食管狭窄, 脂肪间充质干细胞, 细胞膜片, 血管内皮生长因子, 转化生长因子β1, 肝细胞生长因子, 创面愈合, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells are often used for tissue repair and functional reconstruction due to their paracrine actions of multiple growth factors, easy access and immunomodulatory effects. The prevention and treatment of esophageal stenosis after esophageal endoscopic submucosal dissection is a challenge for doctors and patients. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation combined with the cell sheet technology has the potential to promoting wound repair and preventing esophageal stenosis.
OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cell sheet, and to analyze the feasibility of preventing esophageal stenosis after esophageal endoscopic submucosal dissection.
METHODS: The green fluorescent protein-labeled adipose-derived mesenchymal stem cell sheets were prepared using temperature-sensitive culture dishes and were set as the experimental group. Conventionally adherent adipose-derived mesenchymal stem cells were used as the control group. Levels of vascular endothelial growth factor, transforming growth factor β1 and hepatocyte growth factor in the two groups were compared by ELISA, RT-qPCR and western blot. The skin ulcers of nude mice were prepared, and randomized into cell sheet group and model group. The green fluorescent protein-labeled adipose-derived mesenchymal stem cell sheets were then implanted into the skin wound in the cell sheet group.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of cells in the cell sheet was high with enriched extracellular matrix, and there was an interconnection between cells. The expression levels of vascular endothelial growth factor, transforming growth factor β1 and hepatocyte growth factor in the experimental group were all higher than those in the control group. The adipose-derived mesenchymal stem cell sheet on the back of nude mice was successfully transplanted, and the wound healing in the cell sheet group was faster than that of the model group. Experimental findings indicate that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation combined with the cell sheet technology is feasible to prevent stenosis after esophageal endoscopic submucosal dissection, but a large number of basic and clinical studies are warranted.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Intercellular Signaling Peptides and Proteins, Ulcer, Tissue Engineering

中图分类号:

R456
R318

陈梅红，党旖旎，朱旭东，李璇，彭磊，杨佳佳，张国新. 脂肪间充质干细胞膜片移植促进创面愈合的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 790-796.

Chen Meihong, Dang Yini, Zhu Xudong, Li Xuan, Peng Lei, Yang Jiajia, Zhang Guoxin. Feasibility of adipose-derived mesenchymal stem cell sheet transplantation for wound healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 790-796.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的生长特性及膜片形态 第3代脂肪间充质干细胞接种于温度敏感培养皿24 h后，即可见细胞贴壁生长，呈纤维状或长梭形，见图1A；第3代细胞的生长曲线呈S形，前2 d细胞生长缓慢，至第3天进入对数生长期，第5天进入生长平台期，见图1B；荧光显微镜下可见约80%的脂肪间充质干细胞标记绿色荧光蛋白，见图1C；脂肪间充质干细胞连续培养1周后，培养皿底部出现半透明乳白色膜样物质，细胞膜片呈皱缩状，倒置显微镜及苏木精-伊红染色可见膜片中细胞含量较高，细胞外基质丰富，细胞间连接紧密，膜片结构致密且厚度均匀，见图1D-F。

2.2 脂肪间充质干细胞的干细胞特性 流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞有99.30%的细胞表面表达CD73、93.91%的细胞表达CD90、99.35%的细胞表达CD105，而仅有0.35%的细胞表达CD34、0.17%的细胞表达CD45、0.08%的细胞表达HLA-DR，这与原代干细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达CD34、CD45、HLA-DR特性一致^[20-23]，见图2；成脂诱导培养基诱导培养第18天，油红O染色可见细胞胞浆内存在大小不一的橘黄色脂滴，表明成脂分化阳性，见图3；成骨诱导培养基诱导培养第16天，茜素红染色显示细胞中后出现深色钙结节，表明成骨分化阳性，见图4。

2.3 脂肪间充质干细胞膜片中血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子基因及蛋白的表达水平 实时定量PCR结果显示：细胞膜片3种基因的表达水平均高于对照组(P < 0.05)，见图5A-C；进一步Western blot验证了膜片中基因所对应的蛋白表达情况，与PCR检测结果一致，膜片血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子3种蛋白的表达水平均高于对照组，见图5D。

2.4 脂肪间充质干细胞膜片培养上清液中血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子的表达水平 ELISA结果显示，膜片移植前培养液生长因子含量显著高于干细胞专用完全培养基和基础培养基(P < 0.000)，见图6，而基础培养基和干细胞专用完全培养基中3种因子的含量接近。

2.5 裸鼠皮肤溃疡愈合模型的验证 将脂肪间充质干细胞膜片移植至裸鼠人工皮肤溃疡创面，图7A-C显示贴膜组裸鼠皮肤溃疡愈合速度快于模型组，贴膜组裸鼠皮肤溃疡约于造模后第8天全部愈合，而模型组为造模后12 d，造模后1周时，贴膜组溃疡表面血痂基本脱落，而模型组稍晚于贴膜组，于第10天全部脱落；造模后第2天和第6天小动物活体成像及造模后1周组织切片荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白标记的脂肪间充质干细胞成功贴附并整合于创面组织，见图7D，E；待溃疡完全愈合后取其瘢痕组织行免疫组化，发现贴膜组的血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子表达水平高于模型组，见图7F。

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引言

间充质干细胞因具有自我更新和多向分化的潜能，成为再生医学领域常用的种子细胞，其来源广泛，可来自骨髓、脐带、脂肪等。其中脂肪间充质干细胞取材方便，来源丰富，还具有免疫调节和炎症抑制等作用^[1]，常被用于创面修复和功能重建等，具有科研及临床价值。将脂肪间充质干细胞制备成细胞膜片移植至创面是近年来研究的热点。不同于传统胰酶消化收集细胞的方式，细胞膜片技术完整保留了体外培养过程中细胞分泌的胞外基质以及细胞间连接等结构，有利于构建创面组织修复的微环境^[2]。

创面愈合是机体受损伤后自发形成的一个生物学过程，主要为3个时期：炎症、增生和重塑。然而许多因素，如感染、肥胖和糖尿病等，也会影响创面修复的过程，导致慢性创面和瘢痕狭窄的形成^[3-4]。既往促进创面愈合的手术和非手术治疗方式，主要包括高压氧、超声、激光和人工组织移植等，但是效果尚有待提升^[5]。脂肪间充质干细胞膜片移植是一种新型的治疗手段，其主要优势可在于分泌多种细胞因子和生长因子，抑制炎症反应，促进组织血管化和上皮再生重塑等^[6]，目前已被应用于皮肤、食管等创面和组织修复的研究中^[7-8]。

内镜黏膜下剥离被广泛用于早期食管癌和高级别上皮内瘤变的治疗，是目前公认的最佳标准微创治疗方法^[9-10]。相较于外科食管切除，此方法侵入性较小，且能缩短患者的住院时间，并减少并发症的发生率^[11]。然而多变量分析表明黏膜缺损范围>3/4周和病变浸润深度是内镜黏膜下剥离后狭窄的独立危险因素，且与狭窄程度有相关性^[12-14]。目前预防狭窄的方式主要有4种，包括球囊或探条扩张、支架植入、口服或注射激素以及细胞移植^[15]。其中球囊扩张需反复进行，会增加患者的痛苦和经济负担^[16]；食管支架虽起到暂时性扩张作用，但当支架被取出后，狭窄易复发，且同时支架移位和嵌入易引起食管穿孔^[17]；糖皮质激素可抑制局部炎症反应，减少纤维结缔组织生成，软化瘢痕^[18]，但存在迟发性穿孔和全身不良反应的弊端。因而目前细胞膜片移植是研究热点，2012年日本学者Ohki等^[19]将患者自体口腔黏膜上皮细胞制备成细胞膜片移植至内镜黏膜下剥离后创面，发现这种方法可促进再上皮化，能有效预防狭窄的形成。

此次实验作者旨在构建脂肪间充质干细胞膜片，鉴定其基本的生物学特性，分析细胞膜片各种因子的表达，并探索其在创面的黏附性以及促进创面愈合的效果，为今后应用于预防食管内镜黏膜下剥离后狭窄提供帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年11月至2018年6月在南京医科大学第一附属医院消化科实验室和南京医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

动物：SPF级成年雄性裸鼠12只，体质量15-20 g，鼠龄4-6周龄，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证号SCXK(苏)2017-0001。实验经南京医科大学动物伦理审查，批准编号为IACUC-1807016。

细胞：原代人脂肪间充质干细胞购买于ScienCell公司。

实验用主要试剂及仪器：干细胞专用培养基、胰酶消化液、绿色荧光蛋白标记试剂盒、成脂诱导培养基、成骨诱导培养基购自ScienCell公司；温度敏感培养皿购自Thermo Fisher Scientific公司，主要成分为N-异丙基丙烯酰胺高分子聚合物；流式染色缓冲液、抗人CD73 FITC、CD90 FITC、CD34 APC、CD105 PE、CD45 APC、HLA-DR APC抗体、Western blot一抗、ELISA定量试剂盒购自MultiScience公司；Trizol购自碧云天公司；一步法凝胶制备试剂盒购自弗德生物公司；异氟烷购自瑞沃德公司；Western blot二抗购自Bioworld Technology公司；电化学发光底物显色试剂盒购自Thermo Fisher公司；荧光定量PCR试剂盒购自Vazyme公司；光学显微镜购自麦克迪奥Motic公司；荧光显微镜购自BIO-RAD公司；流式细胞仪、T7500型实时荧光定量PCR仪、小动物活体荧光成像仪购自Thermo Fisher Scientific公司；蛋白凝胶成像系统购自BIO-RAD公司。

1.4 方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的培养及膜片制备

细胞培养、传代：将细胞培养于干细胞专用培养基内，置于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中，每2 d或3 d换液1次，待细胞密度达90%-95%时加0.35%胰酶消化液1 mL消化，传代1次。取第3代脂肪间充质干细胞进行后续实验。

细胞计数：第3代脂肪间充质干细胞接种于24孔板，每孔含4×10³个细胞，每天用0.35%胰酶消化3孔，使用血细胞计数板在显微镜下直接计数，取其平均数，绘制生长曲线。

绿色荧光蛋白标记：原代脂肪间充质干细胞培养于6 cm培养皿12-16 h后，按绿色荧光蛋白标记试剂盒说明书标记细胞。48 h后，荧光显微镜下观察荧光标记效率。

脂肪间充质干细胞膜片制备、分离、苏木精-伊红染色：使用温度敏感培养皿制备绿色荧光蛋白标记的脂肪间充质干细胞膜片，设为实验组，常规贴壁脂肪间充质干细胞为对照组。待温度敏感培养皿中细胞融合至95%时，按培养皿说明书要求进行细胞膜片转移。培养7 d的脂肪间充质干细胞膜片以40 g/L多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察膜片显微组织结构。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的干细胞特性鉴定

流式细胞术：当第3代脂肪间充质干细胞细胞丰度达95%-100%时，以0.35%胰酶消化细胞，细胞计数后流式染色缓冲液调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1，分别加入抗人CD73 FITC、CD90 FITC、CD34 APC、CD105 PE、CD45 APC、HLA-DR APC各5 μL，震荡混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

脂肪间充质干细胞的成脂及成骨分化：取第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁴/cm²的密度接种于2个6孔板，干细胞专用培养基培养细胞丰度至100%时，去除干细胞专用培养基，更换为成脂诱导培养基和成骨诱导培养基，每4 d或5 d更换新鲜培养基，18 d后对成脂诱导细胞行油红O染色，16 d后对成骨诱导细胞行茜素红染色。油红O染色：去除旧培养基，用DPBS清洗细胞，40 g/L多聚甲醛固定细胞，室温固定15 min，去除固定液，超纯水洗3遍，油红染液室温孵育15 min，超纯水洗5遍，显微镜观察。茜素红染色：前同油红染色，超纯水去除后缓慢加入1 mL 2%茜素红染液，室温孵育20-30 min，超纯水清洗3-5遍，显微镜下观察。

1.4.3 实时定量PCR检测细胞膜片mRNA的表达 Trizol裂解并分别提取第3代脂肪间充质干细胞膜片及常规贴壁细胞的总RNA；测定浓度后反转录为cDNA，荧光定量PCR试剂盒检测mRNA的表达，反应体系20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环，T7500型实时荧光定量PCR仪检测记录数据，结果根据标准曲线由软件自动计算后得出，实验重复3次。引物序列见表1。

1.4.4 Western blot检测细胞膜片中蛋白的表达 碧云天强效裂解液分别裂解并提取第3代脂肪间充质干细胞膜片及常规贴壁细胞总蛋白，测定蛋白浓度后沸水煮5 min，冷却后分装，放入-80 ℃冰箱。配制体积分数10%的分离胶与体积分数5%浓缩胶，1×电泳缓冲液，根据蛋白定量结果上样，恒压200 V，电流400 mA，电泳时间45-50 min，配制转膜液，恒流300 mA，电压150 V，45 min进行转膜，携带蛋白的PVDF膜于封闭液中慢摇封闭2 h，根据目的蛋白分子量剪条带，加入血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子相对应的一抗，冰上摇30 min，4 ℃冰箱过夜，回收一抗，1×TBST快速震荡洗膜，15 min/次，共洗3次，加入二抗，常温摇床孵育1 h，洗膜，15 min/次，3次，洗膜后加入电化学发光底物显色试剂盒显色，蛋白凝胶成像系统照相观察。

1.4.5 ELISA检测细胞膜片培养上清中细胞因子的表达 将第3代脂肪间充质干细胞以1×10⁵/cm²的细胞密度接种于温度敏感培养皿中，细胞培养箱中孵育3 d，此时细胞融合达80%-90%，已成膜片，取细胞培养上清液1 mL，干细胞专用培养基10 mL，基础培养基10 mL，300×g离心5 min，取上清，分别命名为干细胞膜片组(完全培养基培养脂肪间充质干细胞膜片后的培养上清液)、完全培养基组(由基础培养基和干细胞培养相关添加物组成的完全培养基)和基础培养基组(单纯基础培养基)，ELISA定量试剂盒分别检测血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子，比较3组中各蛋白的表达情况，实验重复3次。

1.4.6 裸鼠皮肤溃疡愈合模型 取12只裸鼠制备皮肤人工溃疡，随机分为2组：贴膜组(n=6)与模型组(n=6)，异氟烷麻醉小鼠后，在其背部制备0.7 cm×0.7 cm皮肤人工溃疡创面，利用度量尺和标记笔将溃疡创面的大小固定，背部皮肤及器械消毒后，手术刀片配合剪刀和镊子去除皮肤全层至肌层显露，贴膜组立即在皮肤创面处贴附绿色荧光蛋白标记的脂肪间充质干细胞膜片，模型组仅进行皮肤创面制备，术后每2 d观察一次创面的变化情况，分别于造模后第2天和第6天进行小动物活体成像，使用异氟烷对贴膜组和模型组裸鼠进行全身麻醉，之后按序放置在荧光成像仪中，观察荧光情况，检测膜片贴附成功与否。造模后1周，异氟烷麻醉下活体取贴膜组创面瘢痕组织制备石蜡切片，荧光显微镜(BIO-RAD公司)下观察移植的脂肪间充质干细胞是否成功整合入小鼠体内。造模后第14天，处死小鼠，取愈合瘢痕组织行免疫组化染色检测血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子蛋白表达情况。

1.5 主要观察指标 细胞膜片中血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子的表达情况和膜片贴附成功与否及促进创面愈合的效果。

1.6 统计学分析 SPSS 13.0统计软件(美国SPSS公司)进行相关数据分析。两组间比较采用独立样本t 检验；P < 0.05为差异有显著性意义。进行多组间比较时，P值进行Bonferroni校正。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

在创面愈合的过程中，依赖于各种细胞因子和生长因子的释放^[24-28]。已有研究表明，脂肪间充质干细胞的胞核内部有多种促细胞生长、血管上皮生长及细胞外基质形成的重要基因，这些基因在细胞核内转录后于胞质内形成相应的功能蛋白，最后以自分泌或旁分泌的方式作用于其自身和周围细胞，促进细胞生长及细胞外基质形成^[3^，^29]。而食管内镜黏膜下剥离后创面失去了上皮的保护，易形成感染和深溃疡，固有肌层萎缩以及纤维瘢痕化是术后狭窄形成的关键因素^[30-33]。Honda等^[34]在比格犬上制备内镜下黏膜切除人工溃疡创面模型，并将脂肪间充质干细胞注射在创面上，发现注射组食管狭窄及黏膜挛缩发生率明显低于对照组，同时固有肌层萎缩和纤维化程度低于对照组，而新生血管组织却明显高于对照组。此次实验结果显示，脂肪间充质干细胞膜片细胞外基质存在，细胞膜片相关的PCR、Western blot、ELISA实验表明其旁分泌大量抗炎，促上皮和血管再生的因子(如血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子)，为上皮再生创造了有利的微环境。

作者进一步通过制备裸鼠皮肤人工创面模型，设计了脂肪间充质干细胞膜片移植组和模型组，2组间除细胞移植这一实验干预因素外均一致，实现了混杂因素的最小化。移植的脂肪间充质干细胞膜片可直接黏附于皮肤创面，造模后1周仍可见细胞存活，大体实验图片和创面面积随时间变化的柱状图均直观反映了移植组愈合速度明显快于模型组，证实了脂肪间充质干细胞膜片促进创面愈合的有效性，为今后用于食管内镜黏膜下剥离后创面的愈合提供了理论基础。Kato等^[7]曾在糖尿病大鼠皮肤溃疡模型上验证了脂肪间充质干细胞膜片能促进皮肤创面愈合，而此次实验中的裸鼠模型也得出了相似的结论。

此次实验的优势在于将新型的组织工程技术——细胞膜片和脂肪间充质干细胞相结合。细胞膜片技术无需支架材料和酶消化，通过自身分泌的细胞外基质形成内源性支架，利于细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的交互作用和信息传递，重建有利于复杂组织再生的微环境，有效地修复组织缺损和改善器官功能，可克服传统技术中支架材料引起的移植部位炎症、自身免疫等而引起的细胞死亡及损失的缺点^[35-40]。同时脂肪间充质干细胞的旁分泌因子和免疫调节等抑炎促生长作用为再生医学领域开拓了新的天地^[29]。然而，此次实验中的创面愈合模型，并未直接验证其促进内镜黏膜下剥离后创面愈合及预防食管狭窄的效果，因此需要进一步的动物实验以验证其可行性及有效性。

综上所述，利用脂肪间充质干细胞作为种子细胞构建细胞膜片，通过检测膜片中血管内皮生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子等促进组织再生的关键基因及蛋白的表达，制备裸鼠皮肤溃疡愈合模型，证实了脂肪间充质干细胞膜片可以通过旁分泌相关生长因子，促进创面的愈合，为今后应用于促进食管内镜黏膜下剥离后创面愈合，预防狭窄奠定了良好的理论基础，但仍需进一步的动物实验直接验证其预防狭窄的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪间充质干细胞膜片移植促进创面愈合的可行性

Feasibility of adipose-derived mesenchymal stem cell sheet transplantation for wound healing

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