深静脉血栓形成模型小鼠沉默信息调节因子1和氧化应激损伤标志物的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0301

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (28): 4518-4524.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0301

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深静脉血栓形成模型小鼠沉默信息调节因子1和氧化应激损伤标志物的表达

赵冲宇，王兵，娄振凯，李兴国，何卫，赵学凌

昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市 650032

收稿日期:2018-02-26 出版日期:2018-10-08 发布日期:2018-10-08
通讯作者: 娄振凯, 博士，主治医师，昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市 650032
作者简介:赵冲宇，男，1992年生，云南省昆明市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81160236，81760029，81760030)；云南省卫生科技计划项目(2014NS142，2017NS022，2016NS021，2017NS021)；昆明医科大学第一附属医院博士科研基金项目(2017BS030)

Expression levels of SIRT1 and oxidative stress injury markers in a mouse model of deep venous thrombosis

Zhao Chong-yu, Wang Bing, Lou Zhen-kai, Li Xing-guo, He Wei, Zhao Xue-ling

First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2018-02-26 Online:2018-10-08 Published:2018-10-08
Contact: Lou Zhen-kai, MD, Attending physician, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Zhao Chong-yu, Master candidate, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81160236, 81760029 and 81760030; the Health Science and Technology Program of Yunnan Province, No. 2014NS142, 2017NS022, 2016NS021 and 2017NS021; the Doctoral Research Project of First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 2017BS030

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
沉默信息调节因子1：是生物体的遗传信息单位，经过DNA复制，将遗传信息准确传递至沉默子，是负性调节元件，当与特异蛋白因子结合时，对基因转录起到阻遏作用。文章中沉默信息调节因子1可通过抑制肿瘤坏死因子α 介导的炎性反应改善内皮细胞功能，修复内皮细胞损伤，减少动脉血栓形成。
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致炎症细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧自由基包括超氧阴离子(•O2-)、羟自由基(•OH)和过氧化氢(H2O2)等；RNS包括一氧化氮(•NO)、二氧化氮(•NO2)和过氧化亚硝酸盐(•ONOO-)等。

摘要
背景：研究表明，沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)对氧化应激有抑制作用，降低动脉血栓形成。而SIRT1和氧化应激损伤在静脉血栓中的变化仍不清楚。
目的：进一步分析SIRT1和氧化应激损伤与小鼠深静脉血栓形成的关系。
方法：把90只的C57型小鼠按体质量随机分为3组：空白组(n=30)，假手术组(n=30)，深静脉血栓形成组(n=30)。深静脉血栓形成组用下腔静脉狭窄法制备深静脉血栓形成动物模型，24 h后获取小鼠下腔静脉组织。苏木精-伊红染色法观察血栓情况；DCFH-DA荧光探针捕获、流式细胞仪检测静脉组织中活性氧的含量。并测得超氧化物歧化酶和丙二醛的量；用Western blot法检测SIRT1蛋白的表达。
结果与结论：①在深静脉血栓形成组里静脉壁中活性氧含量显著多于空白组和假手术组(P < 0.05)；②深静脉血栓形成组静脉壁组织超氧化物歧化酶的量显著低于空白组和假手术组，而丙二醛含量显著高于空白组和假手术组(P < 0.05)；③深静脉血栓形成组SIRT1表达显著低于空白组和假手术组(P < 0.05)；④结果提示：氧化应激损伤能促进深静脉血栓形成的发生发展，深静脉血栓形成中SIRT1的活性被抑制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9657-4911(赵冲宇)

关键词: 深静脉血栓, 静脉内皮细胞, 氧化应激损伤, 沉默信息调节因子1, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Silent information regulator1 (SIRT1) has been shown to inhibit oxidative stress and reduce arterial thrombosis. But changes in SIRT1 expression and oxidative stress in venous thrombosis remain unclear.
OBJECTIVE: To further analyze the correlation of SIRT1 and oxidative stress in deep venous thrombosis.
METHODS: Ninety C57 mice were randomized into three groups based on body mass: control, sham operation and model groups (n=30 per group). The mouse model of deep venous thrombosis was created by inferior vena cava stenosis, and the inferior vena cava tissues were gained at 24 hours after modeling. The thrombosis was observed by hematoxylin-eosin staining; the content of reactive oxygen species was assayed by membrane permeable fluorescent probe DCFH-DA and flow cytometry; contents of superoxide dismutase and malondialdehyde were tested; SIRT1 protein expression was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control and sham operation groups, in the modeling group, the contents of reactive oxygen species and malondialdehyde were significantly increased, and the level of superoxide dismutase was significantly decreased (P < 0.05). The expression level of SIRT1 in the modeling group was significantly lower than that in the control and modeling groups (P < 0.05). In summary, oxidative stress plays a significant part in the germination and growth of deep venous thrombosis, and the activity of SITR1 is inhibited during deep venous thrombosis formation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Venous Thrombosis, Models, Animal, Oxidative Stress, Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵冲宇，王兵，娄振凯，李兴国，何卫，赵学凌. 深静脉血栓形成模型小鼠沉默信息调节因子1和氧化应激损伤标志物的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(28): 4518-4524.

Zhao Chong-yu, Wang Bing, Lou Zhen-kai, Li Xing-guo, He Wei, Zhao Xue-ling. Expression levels of SIRT1 and oxidative stress injury markers in a mouse model of deep venous thrombosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(28): 4518-4524.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠90只，24 h内各组小鼠正常存活，全部进入结果分析。

2.2 围手术期表现实验鼠麻醉发挥药效时间平均 1.2 min，总体不到3 min；手术过后清醒时间平均20 min，总体时间跨度在15-30 min；假手术组的手术时间平均 3.5 min，总体时间跨度在4-9 min；深静脉血栓形成组手术时间平均5.5 min，总体时间跨度在6-10 min。

假手术组：术后意识清，情绪、精神、饮食正常进行，肢体活动自如，未出现躁动不安、激惹好斗。术后24 h观察，四肢、皮肤未见明显异常，手术切口可。

深静脉血栓形成组：麻醉清醒后，小鼠情况同假手术组。手术后第1天，肢体活动相对正常鼠较为迟缓，局部温度较高出现轻微的肿胀。

2.3 取材及测量

空白组：依据实验鼠之前的手术方案使其腹部的下腔静脉充分暴露。其中可以发现下腔静脉大体观察颜色为灰白，有轻微地跳动，血管壁光滑且富有弹性。管壁当中的血液血流流动正常，呈现暗红色。在小鼠左侧肾静脉与下腔静脉交汇处取材，表面观血管壁柔软光滑、管道内残渣较少。

假手术组：顺着之前的切口进行拆缝使其腹部充分暴露，可发现腹部内部情况正常，不存在血性腹水。使其腹部的下腔静脉充分暴露，可以发现下腔静脉大体观察颜色为灰白，有轻微地跳动，血管壁光滑且富有弹性。管壁当中的血液流动正常，呈现暗红色。相同部位血管取材，表面观血管壁柔软光滑、管道内残渣较少。

深静脉血栓形成组：顺着之前的切口进行拆缝使其腹部充分暴露，可发现腹部内部情况正常，不存在血性腹水。使其腹部的下腔静脉充分暴露，发现其中5只实验鼠与空白组和假手术组实验情况一致，均表现下腔静脉正常，未发现有显著的血栓组成；另外25只小鼠下腔静脉管壁呈暗黑或青紫色，管壁质韧无弹性，未触及搏动感。可见管腔轻度肿胀，管腔内残留有血凝块呈黑色，无流动血液，但是发现远心端的狭窄部位存在血栓，未见明显的脉搏跳动感，也不存在血液流动。近心端血流正常，管腔正常。连同下腔静脉及其中血栓一起取下，并用游标卡尺测量其栓子长度，电子天平测量栓子及下腔静脉总质量。

2.4 深静脉血栓形成组下肢静脉血栓行成状况该组实验鼠致死率、血栓百分比、狭窄情况、血液通畅横断面积比见表1；其静脉大小、血栓大小、下肢静脉与血栓相同的情况以及实验鼠的体质量见表2。随机在空白组、假手术组中各抽取3只小鼠标本行病理检测，剩余标本进行丙二醛、超氧化物歧化酶、SITR1检验；深静脉血栓形成组中25只发现血栓形成，在这25只中任意取样3只予病理组织检测，剩余的实验鼠给予丙二醛、超氧化物歧化酶、SITR1检测。

2.5 实验鼠下腔静脉活检结果假手术组：实验鼠下肢静脉管壁正常，肌层、外膜和内膜状态良好，其中内膜中的内皮细胞核正常，细胞形状、大小以及构造良好，也没有显著的炎性浸润(图2B)。空白组：表现与假手术组一致，管腔中少量红细胞残留(图2A，B)。深静脉血栓形成组：下腔静脉血管壁厚薄不一，血管外模、肌层及血管内膜增厚，内皮细胞细胞体积、细胞核大小不均，周围炎细胞浸润。管道中存在很多封闭内腔的血栓。这些栓子存在炎性浸润，内含细胞、纤维素等(图2C)。

2.6 实验鼠静脉中的活性氧量利用流式细胞术以及免疫荧光的技术对假手术组、空白组进行检测，发现阳性峰没有太大改变，而深静脉血栓形成组阳性峰值向右偏移。由此表示，深静脉血栓形成组存在的活性氧量较空白组和假手术组显著增加(P < 0.05)，见图3。

2.7 小鼠下腔静脉静脉组织中超氧化物歧化酶、丙二醛含量假手术组与空白组中超氧化物歧化酶、丙二醛含量无明显的变化(P > 0.05)。深静脉血栓形成组的超氧化物歧化酶含量与另外两组相比来说，相对较低(P < 0.001)，而该组的丙二醛含量明显升高(P < 0.001)，如图4。

2.8 实验鼠下肢静脉SIRT1蛋白的表达假手术组、空白组下肢静脉SIRT1蛋白的表达没有太大变化(P > 0.05)。而深静脉血栓形成组的SIRT1蛋白表达却明显降低(P < 0.001)，如图5。

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引言

深静脉血栓形成是静脉血发生不正常的凝固，导致血管被凝结的血液部分或者全部堵住，是静脉回流障碍性疾病的一种；脱落的血栓堵塞肺动脉而导致的疾病叫做肺动脉栓塞，这两种疾病一起叫做静脉血栓堵塞疾病。静脉血栓堵塞疾病在不一样的位置、时间段表现的两种方式，即肺动脉栓塞和深静脉血栓形成，他们彼此都有着联系^[1]。在全部的静脉血栓堵塞疾病患者里，深静脉血栓形成的患者大约有2/3，肺动脉栓塞患者大约有1/3^[2]。从这些年的调查数据可以看出，在成年人群里，深静脉血栓形成的发病率有1/1 000^[3]。在进行了骨科手术之后，深静脉血栓形成发病的概率超过了40%，手术后发生肺血栓栓塞的风险达5%^[4]。肺动脉栓塞患者的3个月总死亡率为8.6%，造成残疾的概率为1.7%，而4年的死亡率为36%^[5]。在美国，每一年得肺栓塞的患者有(5-7)万人，每一年肺动脉栓塞导致死亡的概率在10%-50%，而欧洲每一年因肺动脉栓塞而死亡的有20万人^[6]。静脉血栓堵塞疾病是骨科围手术期死亡的关键因素之一。

当深静脉血栓形成发作时，内皮细胞结构和功能的紊乱起重要作用^[7]。在缺氧、氧自由基、炎症因子、机械应力和相关酶等的作用下，内皮细胞损伤导致了促血栓因子的产生及血小板活化因子的释放，内皮素1可帮助血管收缩；细胞黏附分子P/E刺激白细胞的粘黏；生成血浆溶酶原激活物抑制剂和凝血因子V，促进血液凝固，以达到阻碍纤溶的目的。因此，深静脉血栓形成发病的始动因素就是血管内皮细胞受损^[8]。

目前，人们对沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)在氧化应激性损伤时所具有的改变和功能有着争议，SIRT1有没有阻碍深静脉血栓形成的功能仍不确定。有些实验显示在氧化应激性损伤时SIRT1发挥的作用会减少；相反，增加SIRT1可促进阻碍氧化应激性损伤。比如：Guo等^[9]指出刺激SIRT1的元素——白藜芦醇可增加SIRT1以减少LDL性损伤。Hu等^[10]指出白藜芦醇还可以利用增加SIRT1的作用阻碍因为氧化损伤而造成的心肌伤害和心室重构。然而，也有一些研究与之前相反，在氧化应激性损伤过程里SIRT1的作用加强，而减少SIRT1的作用能促进阻碍氧化应激性损伤过程。比如：Li等^[11]发现过氧化氢造成人脐静脉内皮细胞损伤的过程中，p-JNK、SIRT1p-p38MAPK、p-ERK蛋白的功能增强，使死亡细胞增多，而阻碍SIRT1的元素EX527可以阻碍以上的损伤，并发现SIRT1会利用MAPKs增加人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤。Brandl等^[12]也发现过氧化氢介导的骨髓干细胞受到损伤的同时SIRT1的作用会加强。所以，还不确定氧化应激性损伤过程中SIRT1是发挥作用或者是被阻碍。

实验前阶段利用下腔静狭窄法来形成固定的兔、SD大鼠和C57型小鼠等血栓动物模型，并通过用凝血酶、过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型，使用ELISA、RT-PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光、创建病毒运载工具和基因芯片等方法，在分析动物细胞时找到而且检验Rac1、MCP-1、KLF15、白细胞介素18和NF-κB等控制氧化应激的关键因子、蛋白，证实其对深静脉血栓形成的产生发挥重要功能，这些因子及蛋白的改变会对血小板、白细胞和内皮细胞的构造有一定影响，改变了纤溶/抗纤、破凝血/抗凝的均衡，促进深静脉血栓形成^[13-15]。文章探讨SIRT1和氧化应激损伤与小鼠深静脉血栓形成的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7月至2016年1月在昆明医科大学实验室完成。

1.3 材料由昆明医科大学医学SPF动物实验中心提供的C57 BL/6品系小鼠90只。把90只C57型小鼠以体质量排号，每个号码随意选一个数并按顺序分列，分列之后前30作为用于对比的空白组(n=30)，31-60作为假手术组(n=30)，61-90作为深静脉血栓形成组(n=30)。

1.4 实验方法

1.4.1 C57小鼠深静脉血栓形成模型建立及取材 C57小鼠有生存时间短、新陈代谢快、花费少的优势，使得深静脉血栓模型的形成迅速。同时，和其他的动物比较，小鼠有利于对去除不一样的基因来实现检验某一个基因的功能。所以，实验用C57小鼠来建立深静脉血栓形成模型，其方法可借鉴原始文献^[16]，以及实验组的前一阶段实验^[17]。

1.4.2 小鼠麻醉及术前准备麻醉方法为吸入式麻醉；麻醉试剂为异氟烷。麻醉后，将小鼠腹部备皮，利用线把足踝稳固在实验台的边上，小鼠采取仰卧位姿势，用体积分数75%乙醇分别对小鼠腹部和盆部消毒。

准备下腔静脉狭窄金属针：用直径为0.30 mm的30 G注射器金属针，在尾部约1 cm的地方把它弯成角度大概130°，为防止术中戳破血管，尖端研磨处理。

1.4.3 分组处理方法 ①空白组：30只小鼠放在SPF条件里常规喂养，不进行其他操作；②假手术组：30只小鼠做好术前准备之后，在腹正中间行1.5-2.0 cm切口，按顺序把表皮、皮下组织、腹部肌肉、腹部膜腔打开，把肠管、网膜等分离出来，并用温盐水纱布盖住，腹膜后使下腔静脉裸露后，依次缝合。用5-0 Prolene按顺序关腹。检测小鼠的生命征象，适温，在手术结束2 h后常规饲养；③深静脉血栓形成组：将余下的30只小鼠腹腔内容物剥离至腹部外，步骤同前，暴露下腔静脉，紧贴左肾静脉与下腔静脉交汇处，把下腔静脉分开，用专业卡尺在模拟建立模型打结的下腔静脉出测得直径。在左肾静脉、下腔静脉交汇处用7-0的线穿过备用，把30 G的金属针按照与下腔静脉竖轴平行放在腔静脉腔，把金属针和下腔静脉打结，打完结之后，从下腔静脉竖轴、头部拿出金属针，要防止损坏下腔静脉壁。这个流程叫做“利用下腔静脉狭窄法建立深静脉血栓形成模型”。关腹，术毕。术后喂养同前。

1.4.4 围造模期数据狭窄率=堵塞的下腔静脉血液流动的垂直切面面积/下腔静脉血管内腔垂直切面面积；残余血液流动量所占比是建立模型后经过下腔静脉的血液流动面积除以下腔静脉血管内腔面积。在拿出金属针之后下腔静脉血液流动面积是狭窄时摆放的金属针横断面面积。完成实验后，观察小鼠生命征象等、意识、精神、进食和饮水后四肢肿胀情况。

1.4.5 取材及数据记录观察并记录在行下腔静脉造模后24 h的小鼠生命迹象、行为、精神状况、进食后身体状况。同时制取外周血和下腔静脉组织的样本。物品、麻醉、术前准备同前。

采用小鼠单侧眼球摘除法采集外周血标本。每只小鼠抽0.5-1.0 mL的血。通过BD EDTA来抽血(5 mL)收集血液后，于4 ℃，3 000 r/min离心10 min后，取上层血浆-80 ℃冰冻保存。

采血完成后，用同动物模型建立时同样手术方法暴露下腔静脉。假手术组(n=30)和深静脉血栓形成组(n=30)小鼠在充分暴露下腔静脉后，大体观察下腔静脉肿胀程度、色样、血流状况(图1)。深静脉血栓形成组把狭窄的腔静脉组织全部拿出(图1)，察看大小、色样、弹性、产生血栓状况，计量血栓的全部长度、产生血栓部的下腔静脉壁和栓子的全部质量。

1.4.6 病理学切片苏木精-伊红染色观察小鼠下腔静脉组织血栓形成情况水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡复水、染色、水洗、复染、水洗、脱水、透明、封藏。

1.4.7 静脉壁组织活性氧含量检测研究前预备下腔静脉壁组织匀浆：把从液氮里拿出的静脉壁组织捣碎，加入 1 mL PBS(pH 7.4)，2次冷冻-热融化循环后离心取上清。实验步骤：

(1)DCF探针的装载：用无血清培养液(1∶1 000)稀释DCFH-DA，至浓度为10 μmol/L。把静脉壁组织放在上述溶液中，使壁细胞浓度达到1×10⁹L^-1。为保证DCFH-DA和人脐静脉内皮细胞充分接触，将静脉壁细胞置于培养箱(37 ℃)内孵育30 min。且每5-10 min摇匀颠倒1次。用无血清培养液(浓度为1∶1 000)把壁细胞洗3次，来达到完全清除没有穿透细胞的荧光检测针的目的。

(2)测试流式细胞仪：使用激发和发射波长度分别为488 nm和525 nm的流式细胞仪来测得荧光能力。

1.4.8 静脉壁组织超氧化物歧化酶活性检测采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定超氧化物歧化酶活力。按比例配置好以上溶液后，将其放置在漩涡混匀器中，多次混匀后，恒温水浴箱(37 ℃)加热40 min。把2 mL显色剂放入到试管和控制管，摇动，室温放置15 min，在用蒸馏水调零的波长550 nm、1 cm分光光度计依次比色A值，并记录。

1.4.9 静脉壁组织丙二醛含量检测 ①制取硫代巴比妥酸存储溶液：称量适量的2-硫代巴比妥酸，将其用TBA配制成浓度为37%后室温下避光保存；②制取丙二醛测验溶液：分别取TBA稀释和存放溶液1 500 μL和500 μL，取 30 μL抗氧化剂来制取丙二醛测验溶液；③减少标准品含量：拿出标准品后将其按1，2，5，10，20和50 μmol/L浓度梯度依次稀释，不同浓度标准品绘制标准曲线；④样品的测定：取出标准品后将其按照1，2，5，10，20和50 μmol/L浓度梯度依次稀释，水浴锅中加热，冷却后高速离心5- 10 min。拿出约200 μL上层清液放到96孔板，532 nm位置检测A值；⑤丙二醛测量：求出样品的丙二醛值之后，通过每单位质量里组织的质量来代表最开始的丙二醛值。

1.4.10 蛋白质印迹法测试静脉壁组织SIRT1蛋白的表达

(1)溶液和试剂：pH值7.4的磷酸缓冲盐溶液、RIPA裂解液、1×SDS缓冲液、2×SDS缓冲液、转膜液、10×PBS、Skim Milk、Methyl alcohol、TRIS缓冲液、三乙醇胺缓冲盐水溶液、稀释一抗、6%Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶。

(2)样品制备：①用TRIS洗涤2次细胞，来洗掉剩下的培养基；②把约1 mL/25 cm²Trypasase放到培育细胞瓶里，在6孔板上以每孔0.5 mL加入Trypasase，在室内温度下放5 min，等人脐静脉内皮细胞失去活性之后让细胞掉落，把它放到EP(1.5 mL)中，2 000 r/min离心5 min；③去上清，用TRIS缓冲液洗涤细胞并沉淀，室温下2 000 r/min离心5 min；④去上清，置入RIPA裂解液(与苯甲基磺酰氟浓度为200 μL/1×10⁶)，冷浴20 min，4 ℃、12 000 r/min离心机离心10 min；⑤把上层清液清放到另一个EP管里，用BCA来检测蛋白含量。

(3)BCA测量蛋白含量：运用二喹啉甲酸蛋白试剂盒(BCA Protein Assay Kit)检测。

(4)SDS-PAGE电泳：①等凝胶变成固态之后，清除分离胶上的乙醇和MilliQ，同时再使用MilliQ清洗；②配制胶条平衡缓冲液Ⅰ；③聚焦好的胶条朝上放在干滤纸上。用MilliQ水浸湿另一份滤纸，去多余水分后，放于胶条上，吸干胶条上的矿物油及多余样品；④转移胶条到样品水化盘中，加入平衡缓冲液Ⅰ6 mL，摇匀15 min；⑤配制胶条平衡缓冲液Ⅱ；⑥在首次均衡之后，把胶条拿出并竖直摆放在滤纸去除剩下溶液，加入用于均衡的缓冲液Ⅱ里，慢慢的摇动15 min；⑦清除SDS-PAGE上剩下的溶液，把二向凝胶置于桌子上，把凝胶的上面对着实验者；⑧给琼脂糖封胶溶液升温消融；⑨添加TGS缓冲液到100 mL量筒里；⑩在再一次均衡之后，把胶条拿出并清除剩下的溶液；?把胶条一边全部放在缓冲液(1×电泳)里清洗多次；?将胶条背向玻璃板放置，加入低熔点琼脂糖封胶液；?往下面按胶条，让它全部碰到聚丙烯酰胺凝胶。?摆放5 min之后，用低熔点琼脂糖封胶液凝固；?将凝胶转移至温度为15 ℃二向电泳制冷仪的电泳槽中，将电泳缓冲液加入其中，接通电源，起始为5-10 mA/gel/17 cm低电流，等样本全部移出IPG胶条并且变成一根线之后，增强电流到20-30 mA/gel/17 cm，当在底部边缘出现溴酚蓝指示剂即可停止电泳；?电泳结束后，从两层玻璃里拿出凝胶，然后进行标记。

(5)转膜：①把胶放在缓冲液里均衡10 min；②通过比对其胶大小来各取出滤纸和PVDF6张，并在缓冲液里均衡10 min，在纯甲醇里放5 s；③配制转移三明治：海绵加3张滤纸，再加膜和胶后再放上海绵，放置完后。赶去气泡，胶放于负极面；④将转移槽置于冰浴中，安装好电极，用电压为100 V、电流0.3 A，转膜1 h；⑤完成后拿出膜。

(6)免疫杂交：①室温下，用TBS液25 mL洗膜5 min，摇匀；②室温下将膜放置于25 mL封闭缓冲液中1 h，摇匀；③15 mL TBS洗3次(5 min/次)；④加入浓度稀释适宜的一抗，室内温度里放置1.0-2.0 h并慢慢晃动；⑤15 mL TBS/T洗涤3次(每5 min 1次)；⑥添加适宜稀释度的HRP，在室内温度放2 h，慢慢晃动；⑦15 mL TBS/T洗3次(5 min/次)；⑧15 mL TBS洗1次。

(7)显色：在光线暗的实验台上放一张保鲜膜，把相同容积的A和B液(ECLPlus)在EP管混匀，在PVDF膜蛋白面均匀滴上混合液，等1 min之后放到X片夹里。把用于显影和定影的液体加入到塑料盘里，在红色灯光里拿出X射线片曝光，把胶片马上放到显影液里显影，等有了显著条带之后，结束操作。将胶片放到定影液里10 min，等变成透明就结束，冲去定影液，晾干，通过Bio-Rad膜成像法来实现显色。

1.5 主要观察指标 ①取下的静脉血栓苏木精-伊红染色镜下观察组织内炎细胞浸润情况；②荧光探针捕获、流式细胞仪检测各组小鼠血栓组织中活性氧、超氧化物歧化酶及丙二醛含量；③蛋白质印迹法测量各组小鼠血栓组织中SIRT1含量。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0统计研究系统，测量的数据以x(_)±s表达，每个小组的对比使用单个因素方差分析，用P < 0.05代表差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

此次实验是人为造成小鼠下腔静脉狭窄的方法，使下腔静脉管腔横截面积减少血流速度减慢，形成血栓组织。然而在人体内，下肢深静脉血栓及其余动静脉血栓的形成机制复杂，受多重因素影响，如出、凝血功能障碍，血液高凝状态；血管壁的损伤及血流滞缓(长期制动、久坐、静脉曲张)等因素。因此深静脉血栓形成动物模型与临床上创伤、手术应激造成的深静脉血栓形成尚有一定区别，这是该研究存在的局限性。

SIRT1生理作用及性质复杂，非组蛋白和组蛋白都参与了其底物中，且代谢综合征、基因稳定性、肿瘤、神经退行性疾病的发生与之都有一定关系。SIRT1的激活在细胞增殖分化、氧化应激反应、炎症反应、肿瘤的发生以及心血管疾病的生理病理过程都有一定联系^[18]。

一些近几年的研究报道，SIRT1能阻碍动脉血栓发生，机制可能为：①SIRT1通过抑制血管内皮中CD40表达改善内皮细胞功能，并且抑制肿瘤坏死因子α所介导的炎症反应^[19]；②SIRT通过去乙酰AcK310中RelA/p65抑制血管内皮细胞黏附分子表达，从而抑制与NF-κB的启动子结合，干扰信号转导；③SIRT1通过阻碍巨噬细胞所产生的清道夫受体LOX-1、减少oxLDL的摄取和阻碍泡沫细胞形成来上调或下调其产生的炎症反应和脂类代谢；④SIRT1通过去乙酰化中RelA/p65可抑制NFκB，减少组织因子表达从而下调内皮组织因子表达，抑制动脉硬化血栓形成^[20-21]。综上，推测SIRT1同时也可能具有抑制静脉血栓形成的作用。

超氧化物歧化酶是人体众多除去氧自由基的酶中较为主要的之一，动物在狭窄法造模后，静脉内血流减慢、血液出现瘀滞，局部处于缺氧环境，导致组织内的超氧化物歧化酶水平降低，且自身合成超氧化物歧化酶相应不足，氧自由基不能彻底消除干净，再次阻碍超氧化物歧化酶活性。超氧化物歧化酶活性受到阻碍后可导致脂类过氧化物崩解而产生丙二醛，对细胞有毒性作用，诱导细胞凋亡。氧化应激介导下的细胞凋亡中，Caspase被激活、Bcl-2相关蛋白活化、细胞色素C释放等过程循环重复，对细胞凋亡过程产生影响^[22-23]。

活性氧含量是细胞内氧化应激水平的标志。在血管内皮细胞的老化、氧化应激损伤、凋亡以及血小板的活化、黏附、聚集等病理过程中，活性氧都直接参与其中^[24-25]。过氧化氢(H₂O₂)、超氧负离子(O₂^-)、羟基自由基(OH^-)都属于活性氧。线粒体内的氧化呼吸链和NADPH氧化酶是活性氧产生的最主要来源^[26]。生理状态下，机体活性氧持续不断产生，当然，其含量和活性在不断被超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等一些低分子量的抗氧化剂持续清除。当机体组织缺氧或者局部组织的血流瘀滞，或由于一些组织发生缺血再灌注损伤的病理生理过程及感染所致脓毒血症和创伤导致的应激等都能有大量的活性氧产生^[27-28]，当机体内抗氧化应激系统在短时间内无法或彻底清除活性氧时，大量活性氧便会滞留在血液中，导致内皮细胞持续处于氧化应激状态，从而使内皮细胞损伤、凋亡^[29]。此次动物实验发现，深静脉血栓形成组小鼠的下静脉壁组织中活性氧含量增加，丙二醛含量上升，但超氧化物歧化酶活性下降。说明在整个血栓形成过程里，活性氧过度表达，因此根据相关研究所报道的，其导致了抗氧化酶合成和活性下降，细胞膜脂质过氧化，内皮细胞损伤、凋亡。与此同时，在内皮细胞中SIRT1蛋白的表达下降，可能是在活性氧的直接作用下，SIRT1基因和蛋白的表达受到了抑制。上述结果共同促进了血栓形成。

研究在动物层面验证了氧化应激反应是内皮细胞损伤的重要因素，发现了SIRT1在体内深静脉血栓形成过程中的表达变化。为进一步理解深静脉血栓形成的复杂分子机制并寻找其关键靶点提供了有力的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

深静脉血栓形成模型小鼠沉默信息调节因子1和氧化应激损伤标志物的表达

Expression levels of SIRT1 and oxidative stress injury markers in a mouse model of deep venous thrombosis

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