纯钛表面微米坑复合纳米管形貌对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0997

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
阳极氧化：是一种在金属或合金上产生一层氧化膜的电化学方法，提前配置好镀液后将试件置于其中，通过设定电压或者电流使试件表面发生阳极氧化从而产生氧化膜。金属氧化物薄膜改变了表面状态和性能，如提高耐腐蚀性、增强耐磨性及硬度，保护金属表面等。
骨特异性转录因子：又称核心结合因子，包括Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨钙素、骨涎蛋白，为成骨细胞的特异转录因子，可促进合成骨细胞外基质蛋白，该编码的核蛋白在成骨细胞增殖分化、骨组织的形成和重建、骨骼基因表达调控过程中发挥着重要作用。

摘要
背景：近年来对钛种植体材料表面微米纳米的仿生设计成为了生物材料领域的研究热点。
目的：观察纯钛试件表面微米坑复合纳米管形貌对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。
方法：采用酸蚀阳极氧化方法，在纯钛表面构建微米坑复合纳米管形貌，作为实验组，以抛光处理的光滑钛试样为对照组，采用场发射扫描电子显微镜观察两组试样表面形貌。将骨髓间充质干细胞接种于两组钛试样表面，常规培养7 d内，MTT法检测细胞增殖能力；成骨诱导培养3，7，14 d后，检测碱性磷酸酶活性；成骨诱导培养7，14，21 d，RT-qPCR和Western blot检测成骨标志的mRNA及蛋白表达。
结果与结论：①对照组试样表面无微米及纳米级结构，实验组试样表面可见为凹凸不平的微米坑形貌与均匀分布的纳米管阵列；②随着培养时间的增长，两组试样表面的骨髓间充质干细胞数量逐渐增加，实验组培养3，5，7 d的细胞数量明显多于对照组(P < 0.05)；③实验组成骨诱导培养7，14 d的碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)；④实验组成骨诱导培养7，14，21 d的骨桥蛋白、骨特异性转录因子、骨钙素的mRNA及蛋白表达均高于对照组；⑤结果表明，钛表面微米坑复合纳米管形貌有利于骨髓间充干细胞的增殖与成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4577-4531(马燕)

关键词: 钛种植体, 酸蚀阳极氧化处理, 微米坑, 纳米管, 骨髓间充质干细胞, 细胞增殖, 成骨分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the biomimetic design of titanium implant surface at micron-nano level has become a research hotspot in the biomaterial research.
OBJECTIVE: To observe the effect of acid etching and anodic oxidation on the surface morphology of pure titanium and the proliferation and osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).
METHODS: The nanotubes with micron roughness were prepared on the titanium surface by acid etching and anodizing method. The surface morphology of nanotubes with micron roughness was used as experimental group and smooth titanium sample treated by polishing as control group. BMSCs were seeded on the surface of titanium samples and observed using field emission scanning electron microscope. Proliferation of the cells was detected by MTT assay within 7 days of conventional culture. Alkaline phosphatase activity was measured At 3, 7, 14 days after osteogenic induction. Osteogenic marker genes and proteins were detected using RT-qPCR and western blot at 7, 14, 21 days after osteogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The control group had no micron and nano structure surface of the samples, while uneven surface, micron-sized holes, and uniformly distributed nanotube arrays were visible in the experimental group. With the culture time, the number of BMSCs on the sample surface in the two groups was gradually increased, and the cell number in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 3, 5, 7 days after culture (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity in the experimental group was also higher than that in the control group at 7 and 14 days after osteogenic induction (P < 0.05). Compared with the control group, the expression levels of osteopontin, bone-specific transcription factors, osteocalcin mRNAs and proteins were increased in the experimental group at 7, 14, 21 days after culture. These results suggest that the acid etching and anodic oxidation of the titanium surface of nanotubes can promote BMSCs proliferation and osteogenic differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dental Implants, Titanium, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

马燕，张华，商建平，姜琦. 纯钛表面微米坑复合纳米管形貌对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4614-4619.

Ma Yan, Zhang Hua, Shang Jian-ping, Jiang Qi. Acid etching and anodic oxidation of titanium surface of nanotubes promotes the proliferation and osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4614-4619.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 原代细胞形状多呈长梭形、多角形，24 h后可见少量细胞贴壁，8 d左右长满瓶底，呈纺锤形，细胞排列呈漩涡状、辐射状；传代后，细胞贴壁及生长迅速，1 d左右可完全贴壁，五六天铺满瓶底，细胞形态较均一，呈漩涡状、辐射状或鱼群样排列，见图1。

流式细胞仪检测结果显示，第3代骨髓间充质干细胞表面CD44、CD29、CD90均呈阳性表达，其阳性表达率分别为96.5%，94.6%及98.2%；细胞表面CD14、CD34、CD45均呈阴性表达，符合骨髓间充质干细胞的生物学特性。

2.2 钛试样表面细胞增殖检测结果 随着培养时间的增长，实验组与对照组钛试样表面的骨髓间充质干细胞数量逐渐增加，实验组培养3，5，7 d的细胞数量明显多于对照组(P < 0.05)，提示在酸蚀阳极氧化处理钛表面接种的骨髓间充质干细胞增殖迅速，见图2。

2.3 钛试样表面细胞碱性磷酸酶活性检测结果 实验组与对照组成骨诱导培养3 d的碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组成骨诱导培养7，14 d的碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，见表2，说明酸蚀阳极氧化处理的钛表面可促进骨髓间充质干细胞分泌碱性磷酸酶。

2.4 钛试样表面细胞碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果
碱性磷酸酶染色：成骨诱导培养第7天，两组钛试样表面细胞胞浆内可见被染成红色的颗粒状碱性磷酸酶，说明经诱导后细胞表达碱性磷酸酶，并且实验组胞浆阳性颗粒数多于对照组，见图3。

茜素红染色：成骨诱导第21天，两组钛试样表面细胞胞外基质中可见大小不等的聚集团状结节，实验组钙结节数量及面积多于对照组，见图3。

2.5 钛试样表面细胞成骨标志基因的表达 见图4。

骨桥蛋白基因表达：两组均可见骨桥蛋白基因表达，骨桥蛋白基因表达在成骨诱导培养第14天达高峰，实验组成骨诱导培养7，14，21 d的骨桥蛋白基因表达均高于对照组(P < 0.05)。

骨特异性转录因子基因表达：两组均可见骨特异性转录因子基因表达，并且随着诱导时间的延长，骨特异性转录因子基因表达逐渐升高，实验组成骨诱导培养不同时间点的骨特异性转录因子基因表达均高于对照组，但仅在成骨诱导7，14 d时差异有显著性意义(P < 0.05)。

骨钙素基因表达：两组均可见骨钙素基因表达，骨钙素基因在成骨诱导培养的第21天时达高峰，实验组成骨诱导培养不同时间点的骨钙素基因表达均高于对照组，但仅在成骨诱导培养14，21 d时差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 钛试样表面细胞成骨标志蛋白的表达 两组钛试样表面细胞的成骨标志蛋白表达与基因检测结果一致，实验组诱导培养7，14，21 d的骨钙素蛋白、骨特异性转录因子及骨桥蛋白表达条带均强于对照组，见图5。

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引言

金属钛具有良好的弹性模量、机械强度、抗腐蚀性及生物相容性，因此在口腔修复领域应用广泛^[1-4]。金属钛表面具有一薄层二氧化钛氧化膜，可有效抑制金属离子的释放，使钛在人体内具有良好的生物相容性^[5-6]。但是此层氧化膜也降低了钛表面的骨诱导活性，使种植体与骨组织无法形成稳固的骨结合，导致种植失败。因此，越来越多的研究者致力于种植体表面改性研究，来提高种植体成功率。

目前常用的钛种植体表面改性方法主要有机械方法、物理方法、化学方法等，但是大多数方法只是在微米范围内对钛表面进行改性，虽然可在一定程度上提高种植成功率，却存在涂层不均匀、易脱落等问题^[7-10]。纯钛表面的纳米形貌能够很好地模拟人体骨组织结构和细胞外微环境^[11-12]，阳极氧化作为电化学方法，很容易在钛表面形成具有一致性和可控性纳米结构的表面形貌，该技术克服了钛不耐磨的缺点，提高了其生物相容性，且操作方法简单，成本低廉，具有一定实用性。付晓龙等^[13]应用阳极氧化技术在纯钛表面制备纳米孔结构，其有利于成骨细胞的黏附、增殖和护骨素基因的表达，进而促进成骨细胞生长，具有良好的生物相容性。陈岩等^[14]通过组织形态测量学评价正畸微螺旋种植体表面阳极氧化处理可促进钛合金微种植体与周围骨组织的结合。

骨髓间充质干细胞具有来源丰富、自我更新能力强和多向分化潜能等生物学特性，是目前公认的组织工程种子细胞^[15-20]。种植体周围骨形成是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、成熟的复杂过程^[21-27]。实验采用酸蚀阳极氧化方法，在纯钛表面构建微米坑复合纳米管形貌，通过观察其与骨髓间充质干细胞联合培养后的细胞增殖和成骨分化情况，来评价酸蚀阳极氧化处理钛表面微米坑复合纳米管形貌的骨诱导活性，为实现钛种植体和骨组织之间的早期骨结合提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察，体外细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年6月在吉林大学中日联谊医院实验室完成。

1.3 材料 商业纯钛(西北有色金属研究所)；胎牛血清(上海哈灵生物科技有限公司)；DMEM培养液(美国Sigma公司)；CD29-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC单克隆抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司)；成骨诱导培养液(广州赛业生物科技有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白试剂盒(北京奥维亚生物技术有限公司)；MTT、茜素红(上海威奥生物科技有限公司)；骨桥蛋白、Sox-2、骨钙素抗体(美国BD公司)；场发射扫描电子显微镜(泰思肯贸易(上海)有限公司)；流式细胞仪、免疫光化学检测成像仪(贝克曼库尔特)；酶标仪(上海皓庄仪器有限公司)；RT-PCR仪(美国Biorad公司)；离心机(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 酸蚀阳极氧化处理钛表面 取商业纯钛材料，修整为1 cm×1 cm×1 mm，将其分别以400目、600目、800目、1 000目、1 200目、1 500目碳化硅砂纸依次抛光并超声清洗，获得光滑钛试样。将光滑钛试样浸泡在0.5%氢氟酸溶液中30 min，制备微米坑形貌。然后将具有微米坑形貌的钛试样置于0.5%氢氟酸溶液中，进行阳极氧化处理，处理时间为1 h，阳极氧化电压为5 V，记为实验组。以抛光处理的光滑钛试样为对照组。

1.4.2 分离培养骨髓间充质干细胞^[28] 采用全骨髓细胞贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，具体方法如下：1月龄雄性SD大鼠2只，体质量约200 g(由吉林大学中日联谊医院实验中心提供)，麻醉后颈椎脱臼处死，将其放入体积分数75%乙醇中浸泡5 min，无菌分离双侧胫骨、股骨，仔细去除骨上附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并用PBS反复冲洗，收集冲洗液并用200目过滤器过滤，制成单细胞悬液，移入离心管中，1 200 r/min离心5 min，吸弃离心管上层浮脂层，在离心管中加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液3 mL，吹打混匀，接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，2 h后换液。以后每隔3 d换液1次，细胞生长至80%融合时，采用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。选择第3-5代细胞用于后继实验。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的分子表型鉴定 将第3代骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，按3.0×10⁵/管分装，各管中分别加入CD29-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC单克隆抗体，充分混匀，4 ℃条件下避光保存30 min，上流式细胞检测。

1.4.4 细胞接种 将两组钛试样以体积分数75%乙醇消毒灭菌，然后用无菌PBS清洗3次，分别置于24孔板中，将第3代骨髓间充质干细胞以2×10⁴/孔的密度接种于钛试样表面，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内孵育。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖 骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面1，3，5，7 d后，取出放入新的24孔板中，PBS清洗，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，培养箱继续培养4 h后，弃掉上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解沉淀，采用酶标仪于490 nm波长处检测吸光度值。

1.4.6 碱性磷酸酶活性检测 骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面24 h后，弃上清，加入成骨诱导培养液(含体积分数10%胎牛血清、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L、地塞米松0.1 μmol/L的DMEM培养液)，每2 d换液1次，成骨诱导培养3，7，14 d后，终止培养，弃掉培养液，PBS清洗，加入0.1%TritonX-100 0.5 mL，超声裂解细胞，在490 nm波长下，严格按照碱性磷酸酶试剂盒说明书检测吸光度值。

1.4.7 碱性磷酸酶染色与茜素红染色

碱性磷酸酶染色：骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面24 h后，弃上清，加入成骨诱导培养液，每2 d换液1次，在成骨诱导培养7 d后进行碱性磷酸酶染色，显微镜下观察。

茜素红染色：骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面24 h后，弃上清，加入成骨诱导培养液，每2 d换液1次，成骨诱导培养21 d后进行茜素红染色，显微镜下观察。

1.4.8 Western blot检测成骨标志蛋白表达 骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面24 h后，弃上清，加入成骨诱导培养液，每2 d换液1次，成骨诱导培养7，14，21 d后，终止培养，PBS清洗，采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒测量蛋白浓度。将20-30 μg蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上电泳，并将分离后的蛋白条带转移至PVDF膜。将PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，与一抗(骨桥蛋白抗体、骨特异性转录因子抗体、骨钙素抗体)孵育过夜，再与辣根过氧化酶标记二抗作用2 h，蛋白条带用增强型化学发光显色系统进行显色。

1.4.9 RT-qPCR检测成骨标志基因表达 骨髓间充质干细胞接种于钛试样表面24 h后，弃上清，加入成骨诱导培养液，每2 d换液1次，成骨诱导培养7，14，21 d后，终止培养，PBS清洗，每孔加入1 mL Trizol，收集各组细胞总RNA，测定A₂₆₀/A₂₈₀及RNA浓度，然后取1 μg RNA反转录成cDNA；再进行qPCR分析，采用2^-ΔΔCt法对目标基因表达进行相对定量分析。

各引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 实验组与对照组钛表面骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件对数据进行两两比较的t 检验，检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

种植体表面性状对种植体骨结合尤为重要^[29]。实验采用酸蚀阳极氧化法将微米级粗糙表面与纳米管的微纳米复合形貌相结合，对钛表面改性，主要观察其成骨活性。实验将骨髓间充质干细胞接种于改性钛材料表面，进行细胞增殖、碱性磷酸活性、碱性磷酸酶染色、茜素红染色、成骨标志基因及蛋白检测。MTT细胞增殖检测结果显示，实验组培养3，5，7 d的细胞数量明显多于对照组(P < 0.05)，提示在酸蚀阳极氧化处理钛表面接种的骨髓间充质干细胞增殖迅速。

碱性磷酸酶是一种细胞膜蛋白，可水解磷酸离子，形成羟基磷灰石晶体并促进矿化，是成骨细胞分化的早期标志物^[30-31]。茜素红是一种能与钙离子形成螯合复合物产生橘红色沉淀的蒽醌衍生物，其形成的钙结节代表细胞外基质矿化，可直接反映骨髓间充质干细胞的成骨分化程度，为成骨分化晚期标志^[32-33]。实验组成骨诱导培养不同时间点的碱性磷酸酶活性均高于对照组，在7，14 d时组间差异有显著性意义，提示酸蚀阳极氧化处理的钛表面可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。同时研究也进行了碱性磷酸酶染色与茜素红染色，结果显示实验组成骨诱导培养7 d的胞浆碱性磷酸酶阳性颗粒数多于对照组，成骨诱导21 d的钙结节数量多于对照组，更加证实了酸蚀阳极氧化处理的钛表面可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

骨特异性转录因子，又称核心结合因子，包括Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨钙素、骨涎蛋白，为成骨细胞的特异转录因子，可促进合成骨细胞外基质蛋白，该编码的核蛋白在成骨细胞增殖分化、骨组织的形成和重建和骨骼基因表达调控过程中发挥着重要作用^[34]。实验结果显示，两组均可见骨特异性转录因子基因表达，并且随诱导时间的延长，骨特异性转录因子基因表达逐渐升高，实验组成骨诱导培养不同时间点的骨特异性转录因子基因表达均高于对照组，在成骨诱导7，14 d组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

骨桥蛋白属于Sibling蛋白家族一员，可由成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞合成分泌，是富含丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的分泌性磷酸化糖蛋白^[35]，可趋化干细胞迁移到受损组织中，在骨基质形成、矿化、代谢及骨重建中发挥着重要作用^[36-37]。实验结果显示，两组均可见骨桥蛋白基因表达，在成骨诱导培养14 d达高峰，实验组成骨诱导培养7，14，21 d骨桥蛋白基因表达均高于对照组(P < 0.05)。

骨钙素由分化成熟的成骨细胞分泌，是一种维生素K依赖性钙结合蛋白，可维持正常骨钙化率，是成骨细胞分化和功能成熟的中晚期标志。实验结果显示，两组均可见骨钙素基因表达，在成骨诱导培养的第21天时达高峰，实验组成骨诱导培养不同时间点的骨钙素基因表达均高于对照组，在成骨诱导培养14，21 d组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

综上所述，在钛表面进行微米级粗糙度表面复合纳米管形貌改性，可促进骨髓间充干细胞的增殖与成骨分化。下一步将继续进行动物体内实验，进一步证实改性钛表面的成骨活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程