含硅二氧化钛纳米管层的体外生物活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0986

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (30): 4864-4869.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0986

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含硅二氧化钛纳米管层的体外生物活性

张贤俊，赵锡江

江南大学附属医院(无锡市第四人民医院)骨科，江苏省无锡市 214062

收稿日期:2018-05-16 出版日期:2018-10-28 发布日期:2018-10-28
通讯作者: 赵锡江，博士，副主任医师，江南大学附属医院(无锡市第四人民医院)骨科，江苏省无锡市 214062
作者简介:张贤俊，男，1989年生，安徽省铜陵市人，汉族，2015年苏州大学毕业，硕士，医师，主要从事关节外科研究。
基金资助:
2017年无锡市卫生计生科研面上项目(MS201726)

In vitro bioactivity of silicon-incorporated titanium dioxide nanotubes

Zhang Xian-jun, Zhao Xi-jiang

Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China

Received:2018-05-16 Online:2018-10-28 Published:2018-10-28
Contact: Zhao Xi-jiang, MD, Associate chief physician, Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University. Wuxi 214062, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Xian-jun, Master, Physician, Department of Orthopaedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University. Wuxi 214062, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Wuxi Municipal Health and Family Planning, No. MS201726

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
MTS：一种新型的MTT类似物。与MTT、XTT不同，MTS在偶联剂PES存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原形成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与某些细胞株活细胞数在一定范围内呈高度相关。所以可通过测量吸光度值间接反映细胞增殖情况。
生物活性：在材料领域里主要指能在材料与生物组织界面上诱发特殊生物、化学反应的特性，这种反应导致材料和生物组织间形成化学键合。在生物矿化过程中，主要指生物材料与活体骨产生化学键合的能力，是衡量生物材料的一个重要指标。

背景：钛合金长期以来被用作可植入的生物材料，通过在其表面制备二氧化钛纳米管层可提高材料表面与骨的接触面积，然而将硅元素注入纳米管层表面是否可以进一步提高材料生物活性，有待进一步研究。
目的：探讨钛表面含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞MC3T3-E1细胞活性的影响，为医用钛金属生物管层的改良提供实验依据。
方法：利用阳极氧化法技术在钛表面制备二氧化钛纳米管层，采用等离子体浸没离子植入和沉积法，将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面(实验组)，以二氧化钛纳米管层为阳性对照组，光滑钛片作为阴性对照组。用扫描电镜观察各组形貌，X射线衍射仪测定各组元素组成。3组管层表面分别种植MC3T3-E1细胞，检测第1，3及5天各组细胞黏附铺展、增殖情况，第7天各组细胞相关基因的表达及第3，4周各组细胞的钙沉积情况。
结果与结论：①扫描电镜下显示硅元素的加入没有改变管层的表面形貌，且第1天仅实验组细胞上可以观察到有丝状伪足扩展，第3天丝状伪足活性增加并开始合并，第5天丝状网络结构较其他两组明显增多；②X射线衍射仪显示实验组出现了对应为硅元素特征峰；③MTS法显示培养第1，3天，黏附于实验组及阳性对照组表面的细胞数量比阴性对照组显著增多，第5天，实验组上的细胞增殖显著高于对其他2组(P < 0.05)；④实时定量RT-PCR检测结果显示7 d时实验组中成骨相关基因Ⅰ型胶原蛋白，碱性磷酸酶，Runx2，骨钙素和骨桥蛋白基因表达均高于对照组(P < 0.05)；⑤第3，4周实验组和阳性对照组上的细胞与阴性对照组相比钙矿物结节形成明显升高，第4周含实验组沉积的钙矿物比其他2组显著增加(P < 0.05)；⑥结果提示，二氧化钛纳米管层可以通过等离子体浸没离子植入和沉积法加载硅离子并具备良好的成骨活性。

ORCID: 0000-0003-4935-7919(张贤俊)

关键词: 硅元素, 二氧化钛, 纳米管, MC3T3-E1成骨细胞, Ⅰ型胶原蛋白, 碱性磷酸酶, Runx2, 骨钙素, 骨桥蛋白, X射线衍射仪, MTS试剂

Abstract:

BACKGROUND: Titanium alloy has been used as an implantable biomaterial for a long time. The contact area between the material surface and bone can be improved by the preparation of TiO₂ nanotube film on the surface of titanium alloys. However, further research is warranted to improve the bioactivity of silicon on the surface of the nanotube.

OBJECTIVE: To investigate the effect of silicon-incorporated TiO₂nanotubes on the bioactivity of MC3T3-E1 cells in vitro and to provide experimental evidence for the biochemical modification of titanium.

METHODS: Silicon-incorporated TiO₂ nanotubes films on titanium surface were prepared by anodization and silicon plasma immersion ion implantation. Si-TiO₂-NTs film was served as experimental group; TiO₂-NTs was served as positive control group, and titanium film was used as negative control group. Field emission scanning electron microscope and X-ray photoelectron spectroscopy were used to detect the morphology and element composition of samples in three groups. MC3T3-E1 cells were seeded onto the specimen surface of these three groups. After 1, 3, 5 days of cultivation, cell adhesion, spreading and proliferation were detected. After 7 days of cultivation, cell-related gene expression was detected in each group. After 3 and 4 weeks of cultivation, calcium deposition of cultured cells on the samples was evaluated by alizarin red s staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the scanning electron microscope, the addition of silicon element did not change the surface morphology of the nanotube film. On the 1^st day, filopodia expansion was only observed on the cells of the experimental group; on the 3^rd day, the activity of the filopodia increased and began to merge; on the 5^th day, the filamentous network structure increased significantly compared with the other two groups. (2) Results from X-ray photoelectron spectroscopy showed that the characteristic peak of silicon element appeared in the experimental group. (2) At 1 and 3 days of culture, the number of adherent cells in the experimental and positive control groups was higher than that in the negative control group. At 5 days of culture, cell proliferation in the experimental group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05). (4) Real-time quantitative RT-PCR results showed that the expression levels of osteogenic related genes, type I collagen, alkaline phosphatase, Runx2, osteocalcin and osteopontin, were all higher in the experimental group than the control groups (P < 0.05). (5) Compared with the negative control group, the cells on TiO₂-NTs and Si-TiO₂-NTs showed an elevated calcium mineral nodule formation at 3 and 4 weeks of culture (P < 0.05). Moreover, the deposited calcium mineral on Si-TiO₂-NTs exhibited a significant increase compared with the other two groups at 4 weeks of culture (P < 0.05). To conclude, TiO₂ nanotube layer can be loaded with silicon ions by plasma immersion ion implantation and deposition method and has good osteogenic activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Silicon, Titanium, Nanotubes, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张贤俊，赵锡江. 含硅二氧化钛纳米管层的体外生物活性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4864-4869.

Zhang Xian-jun, Zhao Xi-jiang. In vitro bioactivity of silicon-incorporated titanium dioxide nanotubes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(30): 4864-4869.

图/表（结果） 6

2.1 各组钛片表征各组钛片表面形貌见图1。扫描电镜下显示阳性对照组(图1A)和实验组(图1B)表面形貌无明显差异，这表明硅离子注入不会破坏二氧化钛纳米管的管状形貌。各组钛片表面元素分析见图2。X射线光电子能谱仪显示实验组与阳性对照组式样表面含C、O、Ti元素，而实验组管层表面的全分辨图谱在100-150 eV附近出现了对应为硅元素特征峰，其含量约为0.51%。表示硅元素已成功注入氧化钛纳米管层中。

2.2 各组钛片与MC3T3-E1细胞共培养后的细胞形态见图3。培养1 d后，阴性对照组的MC3T3-E1细胞呈扁平形态，同时细胞在阳性对照组和实验组表面显示圆形和不规则的形状，此外，在实验组可以观察到细胞上有丝状伪足扩展。第3天，阴性对照组细胞显示拉长和扁平形态，在阳性对照组上开始观察到丝状伪足延伸，而在实验组上丝状伪足活性增加并开始合并。第5天见细胞覆盖3组材料的表面。与阴性对照组表面相比，更多的网状丝状伪足出现在阳性对照组表面，而实验组表面的丝状网络结构较其他2组明显增多。

2.3 各组细胞的黏附各组随时间延长细胞黏附增殖活性有增加趋势。培养第1及3天，MTS检测示黏附于实验组表面及阳性对照组表面的细胞数量比阴性对照组显著增多(P < 0.05)；培养第5天时实验组表面的细胞增殖显著高于其他2组(P < 0.05)，见图4。

2.4 细胞分化相关基因的检测培养7 d时，实验组成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素和骨桥蛋白的表达水平显着高于其他2组(P < 0.05)。提示在含硅二氧化钛纳米管层钛片表面培养的成骨活性得到改善，见图5。

2.5 细胞茜素红染色定性检测与阴性对照组相比，阳性对照组和实验组材料上的细胞在第3及4周的钙矿物结节形成明显增多(P < 0.05)。此外，在第4周时，实验组材料上沉积的钙矿物显著多于阳性对照组(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计材料学实验。

1.2 时间及地点于2016年1月至2017年10月在江南大学医学院完成。

1.3 材料

实验用主要材料和试剂：医用纯钛片(天津正天医疗器械有限公司)。MC3T3-E1细胞(中科院上海细胞库，为第1代细胞)。MTS试剂盒(Dojindo Laboratories，日本)，EDTA (Sigma，美国)，PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)，其他引物(上海麦莎生物工程公司)。

实验用主要设备：X射线光电子能谱仪(MicroLab 310-F，VG Scientific，英国)，场发射扫描电镜(FEG-SEM，XL-30，Philips，荷兰)，X射线衍射仪(TF-XRD，D/MAX-2550，Rigaku，日本)，细胞培养箱(HEPA Class 100，Forma Scientific，美国)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组将72个纯钛片均分为3个组(每组24个)：阴性对照组：光滑钛片；阳性对照组：二氧化钛纳米管层钛片；实验组：含硅二氧化钛纳米管层钛片。

1.4.2 二氧化钛纳米管层及含硅二氧化钛纳米管层样品制备选用医用纯钛片，钛片为圆形，直径5.8 mm，厚度1.0 mm。使用乙醇和去离子水超声清洗钛片，然后使用体积分数5%草酸溶液在100 ℃预处理2 h^[12]。然后将预处理的样品放入由体积分数1.0%氢氟酸组成的电解质中在恒定电压(20 V)下阳极氧化30 min。在阳极氧化处理后，通过超声波处理和空气干燥，用三重蒸馏水冲洗样品，制成二氧化硅纳米管层样品。再将上述处理得到的二氧化钛纳米管层样品放置在等离子体浸没离子注入设备的真空室靶台，抽真空至2.5×10^-3 Pa，进行硅离子注入。使用纯度为99.99%的硅为阴极，注入电压为-20 KV，注入脉宽为 450 μs，频率6 Hz，时间为1 h，制成含硅二氧化钛纳米管层样品。

1.4.3 管层式样表面形貌及元素组成检测 3组采用随机数表法各随机抽取2个试件，场发射扫描电镜观察表面形貌，并用X射线光电子能谱仪检测表面元素成分。

1.4.4 细胞形态和铺展状况观察 MC3T3-E1细胞以 1×10⁵L^-1的细胞浓度接种于纯钛片、二氧化钛纳米管层钛片、含硅二氧化钛纳米管层钛片表面，分别于培养的第1，3及5天中止培养。常规处理后电镜观察。

1.4.5 MTS法检测细胞黏附增殖活性^[13] 将MTS试剂放入37 ℃水浴10 min。吸管吸除细胞培养液，用PBS冲洗3遍，以洗弃死亡的细胞。在96孔板中，3组实验样本每孔100 μL培养基加20 μL MTS。37 ℃，体积分数5%CO₂的环境下孵育温育3 h。于490 nm波长处测定上清液的吸光度值。以空白孔作为参照，计算后转换成各组的细胞数。

1.4.6 细胞分化相关基因的检测使用实时PCR测定MC3T3-E1细胞中典型的成骨分化相关基因(包括Ⅰ型胶原蛋白，碱性磷酸酶，Runx2，骨钙素和骨桥蛋白)的表达。具体步骤如下：收集细胞，提取RNA，取4 μL RNA溶液，采用紫外分光光度计在260 nm和280 nm处检测吸光度值，计算RNA浓度。稀释RNA到0.5 g/L，-80 ℃备用。进行反转录操作，合成cDNA，配置实时定量PCR反应体系，进行PCR扩增反应(引物序列见表1)，设置U6为内参，反应条件：95.0 ℃ 5 min，95.0 ℃ 20 s，58.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 20 s，共50个循环。采用2^-??Ct方法分析Ⅰ型胶原蛋白，碱性磷酸酶，Runx2，骨钙素和骨桥蛋白在细胞中的相对表达水平。

1.4.7 茜素红染色定性检测成骨诱导三四周后，将直径为13 mm的3组材料在体积分数75%乙醇中固定1 h。用双蒸水冲洗细胞，并使用200 μL的40 mmol/L茜素红S(pH 4.1)溶液在室温下染色10 min。然后通过用双蒸水冲洗来完全除去未结合的染色。茜素红S染色的定量分析通过在室温下用0.5 mol/L 盐酸和体积分数5%十二烷基硫酸钠溶解 30 min进行^[14]。使用分光光度计测量在405 nm处的吸光度来测定3组材料的成骨情况。

1.5 主要观察指标 ①各组钛片表征；②MC3T3-E1细胞共培养后体外生物活性；③细胞分化相关基因的检测；④细胞茜素红染色。

1.6 统计学分析实验数据结果均表示为x(_)±s，统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，不同组之间的比较用方差分析，组和组间比较用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

钛金属因其良好的机械性、生物相容性以及耐腐蚀性，是目前临床最常用的植入物材料^[15]。然而其与空气接触后产生的二氧化钛层的生物惰性，使其不易与骨细胞连接，不能早期与骨组织形成化学键性结合，这使得人工假体容易松动、下沉，导致疗效不佳^[16-17]。目前提高材料生物活性的常用方法是进行表面涂层处理，从而提高其生物相容性及生物活性^[18]。Honda等^[19]发现将自然形成的二氧化钛层改为二氧化钛纳米管层可以增大材料与骨之间的接触面积，使其早期与骨骼接触面产生化学键性结合。既往研究还表明，二氧化钛纳米管可促进细胞黏附，促使细胞伪足长入纳米管层中，影响细胞的增殖、分化^[20-21]。

受可降解生物活性玻璃硅能显著促进新骨形成的启发，国外开始探索将硅替代透明质酸，用于人工关节假体表面的微孔涂层，并已取得了初步研究成果。Sawada等^[22]发现纳米管层可作为载体合并生物活性微量元素如钙，硅，锌，锶和镁等，这些元素能通过增强成骨细胞活性刺激植入物表面骨生长。既往研究还发现，硅元素对于骨和软骨的发育起了重要的作用^[23]，生物陶瓷如生物玻璃、硅酸钙、硅灰石等加入硅元素后，其生物活性和生物相容性均显著提高。不仅如此，硅离子还具有良好的促成骨细胞黏附、增殖和分化的能力^[24]。Juliana等^[25]还发现硅可以上调成骨细胞基因的表达，并增加破骨细胞和成骨细胞骨整合的活性。

体外细胞培养，作为评价材料生物活性的重要手段，与动物实验相比，具有可重复、易控制实验条件及操作相对容易等优点。体外细胞培养多采用原代培养细胞或建株细胞系两类。细胞与涂层的接触方式包括直接和间接接触共培养。对材料的生物活性评价可通过观察细胞形态和数量变化或研究材料对细胞黏附、增殖和分化的影响来评估材料的生物活性^[26]。

当前研究通过使用阳极氧化法在钛表面形成有序排列和高纵横比的二氧化钛纳米管层钛片，并以此为载体，以PIII＆D处理技术将硅元素加入二氧化钛纳米管层表面形成含硅二氧化钛纳米管层，此为一种新型材料，既往研究较少。利用扫描电镜观察见与二氧化钛纳米管层相比，其表面形貌未见明显改变。光电子能谱分析表明硅元素已成功加入该管层中，硅含量约为0.51%。将成骨细胞系MC3T3-E1细胞与各材料直接接触，进行体外培养，并通过研究电镜观察显示，含硅二氧化钛纳米管层上的细胞在第1天即表现出良好的丝状伪足活性，并在后续的培养中较其他两组以更快的速度增殖、合并。而通过MTS测试可以看到，二氧化钛纳米管层与含硅二氧化钛纳米管层在培养的第1及3天均可促进细胞黏附、增殖活性，而培养第5天显示含硅二氧化钛纳米管层的增殖促进效应更明显，这可能与硅离子有关。

虽然含硅二氧化钛纳米管层对MC3T3-E1细胞的成骨分化增强的机制不清楚，既往研究认为新的纳米-小窝结构可能为活性蛋白提供更多的反应位点，这些活性蛋白可以促进成骨细胞黏附和随后的成骨分化，同时硅元素可以促进细胞外基质合成，能在早期调控细胞功能^[27]。当前研究选择的骨钙素，Runx2、Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶骨桥蛋白等是与成骨细胞分化相关的重要标志物^[28-29]。相关基因表达可以控制细胞并调节其发挥相对应的生理作用。因此，通过研究成骨细胞的分化情况可以观察管层材料生物活性和相容性^[30-33]。当前研究提示在含硅二氧化钛纳米管层上培养7 d的细胞中所有上述基因的表达显着高于其他2种材料上的细胞的表达，为了进一步验证硅元素可诱导增强MC3T3-E1细胞的成骨分化，实验通过茜素红S染色研究基质矿化。研究显示第21天纳米管上的钙结节沉积高于阴性对照组，实验组在第28天显示最多的钙结节。这些实验结果在一定程度上表明钛表面含硅二氧化钛纳米管层可以加强成骨细胞分化，表明含硅二氧化钛纳米管层是一种成骨活性良好的管层材料。

综上所述，PIII＆D处理技术加入的硅元素应该是影响该管层表面生物活性发生改变的主要因素。含硅二氧化钛纳米管层一方面通过二氧化钛纳米管层提供理想的物理形貌，另一方面沉积的硅离子可有效刺激细胞的增殖和分化，为细胞生长提供有利的微环境。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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